Summary
Det här protokollet beskriver en effektiv metod för utvinning och kvantifiering av koffein i cellsuspensioner C. arabica l. och en experimentell process för att utvärdera den enzymatiska aktiviteten av koffein syntas med uttryck den gen som kodar detta enzym.
Abstract
Koffein (1,3,7-trimethylxanthine) är en purin alkaloid i populära drycker som kaffe och te. Denna sekundära metabolit betraktas som kemiska försvar eftersom det har antimikrobiell aktivitet och anses vara ett naturligt insektsmedel. Koffein kan också producera negativa allelopathic effekter som förhindrar tillväxten av omgivande växter. Dessutom, konsumerar människor runt om i världen koffein för sina smärtstillande och stimulerande effekter. På grund av intresse för de tekniska tillämpningarna av koffein, har forskning om den biosyntetiska vägen för denna förening vuxit. Dessa studier har främst fokuserat på att förstå de biokemiska och molekylära mekanismer som reglerar biosyntesen av koffein. In vitro vävnadskultur har blivit ett användbart system för att studera denna biosyntetisk väg. Denna artikel kommer att beskriva en stegvisa protokoll för kvantifiering av koffein och för att mäta avskrift nivåerna av genen (CCS1) kodning koffein synthase (CS) i cellsuspensioner C. arabica L. samt dess aktivitet.
Introduction
Koffein är en sekundär metabolit som är biosyntetiseras av växter av släktet Coffea1. Denna alkaloid tillhör familjen methylxanthine och betraktas som en kemisk fabrik försvar eftersom det kan agera mot de negativa effekterna av patogener och växtätare2,3. Denna metabolit är dessutom ansvarig för kaffedrycken, som är allmänt konsumeras i världen4,5stimulerande egenskaper. På grund av dess egenskaper, är flera forskargrupper intresserade studera biosyntetisk väg och katabolism av koffein6,7. För närvarande, fungera växt i vitro cell/vävnadskulturer som ett alternativ för att utvärdera koffein ackumulering under olika biotiska och abiotiska strategier8,9.
Koffein biosyntes lansering hydrolytiska av 7-methylxanthine från den motsvarande ribos nukleosid följt av beställda N-methylations i position 3 och 1. En specifik S- adenosyl metionin (SAM)-beroende N-metyltransferas (NMT) katalyserar metyleringen vid position 7, medan teobromin synthase (TS) och CS är inblandade i den 3 - och 1-methylations, respektive, producerar teobromin och koffein. Studier av gener som kodar för distinkta NMTs låtit förstå den mekanism som reglerar koffein produktion10,11. CS, som har N -metyltransferas aktivitet, katalyserar de sista två stegen av biosyntetisk väg av koffein11. I kaffe plantor, har det visat att ljus strålning kan öka CS aktivitet, vilket resulterar i en ökning av koffein biosyntes. Vi visade nyligen att underhållet av cellsuspensioner C. arabica l. under ljus bestrålning är den optimala villkoren för att utvärdera de effekter som producerar abiotisk stressfaktorer som påverkar den biosyntetiska vägen av koffein8. Den information som erhålls i dessa studier kan ha program i metabola engineering och systembiologi för att maximera studien av koffein biosyntetisk väg i sådana in vitro- system.
Med tanke på fördelarna med att erhålla en lämplig modell för studier av koffein biosyntes, optimerat vi utvinning villkoren för koffein på cellsuspensioner C. arabica L. Det var också möjligt att utveckla ett användbart protokoll för att studera den enzymatiska aktivitet samt metodologiska steg för bedömningen av genen utskrifter av Coffea koffein syntas 1 (CCS1) kodning detta enzym. Häri, rapporterar vi ett protokoll att extrahera och kvantifiera koffein i C. arabica cellsuspensioner genom tunnskiktskromatografi och densitometry (TLC-densitometry).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koffein utvinning i cellsuspensioner av C. arabica L.
- Använda C. arabica cell suspensioner9. Upprätthålla upphävanden av varannan vecka subkulturer i Murashige och Skoog medium vid pH 4.3 med konstant 100 rpm skakar vid 25 ° C under kontinuerlig ljus (8,3 W/m2).
- Skörda cellerna under dammsugarfilter använder 11 µm porstorlek filterpapper och en Buchner tratt.
- Registrera den färska vikten av insamlade celler med hjälp av en skala, Linda in dem i aluminiumfolie, frysa dem i flytande kväve och hålla dem vid-80 ° C fram till analys.
- Lyophilize frysta cellulära material för 72 h.
- Registrera vikt frystorkade cellerna för att uppskatta torrsubstans avkastningen.
- Lagra pulveriserade materialet i återanvändbara polyetylenpåsar (9 x 7,5 cm). Lös upp materialet till ett fint pulver och store i exsickator fram till användning.
- Mäta 0,5 g cellular torrsubstans på analytisk skala och lägga till den i en glas-kolv (25 mL).
- Tillsätt 10 mL aceton till frystorkade cellerna och blanda i en vortex mixer för 30 s för homogenisering. Sedan tillslut kolven med aluminiumfolie.
- Blanda vid 100 rpm med en rotator i rumstemperatur (25 ° C) för 5 h.
- Överföra alla material till en 15 mL koniska rör och centrifugera vid 13 000 x g i 10 min. överföring vätska fas till en ny tub och minska den torrhet vid rumstemperatur i spiskåpa.
- Återsuspendera provet med 25 µL av aceton.
2. villkor för bedömning av koffein av tunna lager kromatografi (TLC)-Densitometry
- Gäller 1 µL av tidigare återsuspenderade koffein extraktet den stationära fasen.
Obs: kiselgel plattor (F254) används som den stationära fasen. Innan proverna, plattorna har utvecklats med 10 mL kloroform-metanol [9:1 v/v] i en kromatografi kammare (14 x 12 cm x 9,5 cm), och plattorna torkades vid rumstemperatur. Kännetecknen av kromatografiska plattan där proverna tillämpas visas i figur 1. Kammaren var mättad för 30 min med lösningsmedel innan utveckla plattan. TLC plattor bör hantera med handskar för att undvika kontaminering. - Utveckla TLC i kromatografi kammaren med 10 mL av den mobila fasen cyklohexan-Acetonen [40: 50 v/v].
Obs: Denna blandning tillåter separation av koffein på 0,34 bibehållande faktor (Rf).- Ta bort den TLC-plattan från kammaren och låt dem torka i rumstemperatur.
- Visualisera koffein band i kort våglängd ultraviolett ljus (UV, 254 nm). Använda en kompakt UV-lampa. Dessutom för detta steg, Använd skyddsglasögon med UV-skydd.
- Kvantifiera koffeinnivåer av densitometry på 273 nm. Instrumentet styrs med kromatografi programvara.
3. ribonukleinsyra (RNA) isolering
- Ta cellsuspensioner från steg 1,1 och vakuum filtratet med filterpapper (11 µm porstorlek).
- Samla in det cellulära materialet från pappersfiltret, väg upp 0,5 g av cellulära material på en Analysvåg och packa det i aluminiumfolie. Frys provet med flytande N2.
- Lös upp cell provet i en porslin mortel med flytande kväve och tillsätt 1 mL RNA isolering reagens tills homogeniserade.
Obs: Sterilisera de porslin mortlar i en muffelugn vid 300 ° C för 6 h. RNA isolering reagens innehåller fenol, guanidin isotiocyanat och andra komponenter.- Överföra 500 µL av provet till ett sterilt mikrocentrifug rör (1,5 mL). Lägga till 300 µL av kloroform-isopentanol (24:1) och 300 μL av skakad fenol (pH 8,0).
- Blanda provet med en vortex mixer och sedan Centrifugera det 20 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Överföra 300 μL av den övre fasen i en mikrocentrifug rör. Tillsätt 200 μL isopropanol. Inkubera röret för 1 h vid-20 ° C.
- Centrifugera röret på 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och häll sedan upp den flytande fasen.
- Tillsätt 1 mL etanol (70%) att bilda en pellet i röret. Centrifugera vid 12 000 x g i 10 min och häll. Upprepa detta steg två gånger.
- Torra provet för 1,5 h i rumstemperatur (25 ° C). Återsuspendera RNA extraktet med 25 μL av dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten.
Obs: För de RNA-extraktionen, använda vatten som behandlats med 0,1% DEPC v/v.
4. inkubation av RNA avskrift med Deoxyribonuclease (DNase)
- Lägg till 2 µg totalt RNA extrahera till en steril mikrocentrifug rör. Tillsätt 1 μL 10 x reaktion buffert (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Tillsätt 1 μL av 1 U/µL DNAS.
- Ta reaktionen till en slutlig volym av 10 μL DEPC-behandlad vatten. Blanda provet och centrifugera kort vid 2000 x g i 1 min.
- Inkubera provet vid 37 ° C i 30 min.
- Stoppa reaktionen med tillägg av 1 μL av 50 mM dinatrium etylendiamintetraacetat dihydrat (Na2EDTA) och inkubera provet vid 65 ° C i 10 min.
- Analysera integritet RNA av agaros gelelektrofores.
- Förbereda en standard 1% agarosgel och färga det med 1 µL 3 x infoga nukleinsyra fläcken lösning.
- Tillämpa 500 ng av RNA till Agarens gel och kör gelen.
- Visualisera integritet RNA med hjälp av en geldokumentationssystem för foto.
- Använder RNA som mall för cDNA syntes av omvänt transkriptas.
5. kompletterande deoxiribonukleinsyra (cDNA) syntes
- Tillsätt 2,5 μg av total-RNA i en mikrocentrifug rör. Tillsätt 1 μL oligo-deoxythymine (dT) grundfärg och fyll röret till en slutlig volym 13 μL med nuclease-gratis vatten. Blanda provet och sedan Centrifugera en 2 000 x g i 1 min.
- Inkubera provet vid 65 ° C i 5 min och sedan vid 4 ° C i 2 min.
- Tillsätt 4 μL av 5 x reaktion buffert används för omvänt transkriptas, 2 μL deoxynucleotide trifosfater (dNTP) mix (10 mM för varje dNTP) och 1 μL av omvänt transkriptas (200 U/µL). Blanda försiktigt och centrifugera vid 2000 x g i 1 min.
- Inkubera provet vid 45 ° C i 50 min och sedan vid 70 ° C i 10 min.
- Kvantifiera cDNA koncentrationen med en UV-spektrofotometer.
- Använd cDNA som mall för polymeras-kedjereaktion (PCR).
Obs: Reaktion bufferten användes som 10 x (steg 4.1.1) och 5 x gånger koncentrerade (steg 5.3), respektive.
6. realtid kvantitativ PCR (qPCR) att förstärka den Gene CCS1
- Tillsätt 7,5 μL av Taq-DNA polymeras 2 x (0,1 U/mL) och 0,1 μM av 5-karboxi-X-rodamin (ROX) till ett PCR mikrocentrifug rör.
Obs: Varmstart Taq-DNA polymerase 2 x användes som en lösning 2 x koncentrerad.- Tillsätt 5 μl nuclease-gratis vatten.
- Lägg till 0,75 μL varje 10 μM framåt och bakåt primer att förstärka genen CCS1 (AB086414) (framåt: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' och omvänd: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Använda primers för tubulin som städning genen i en separat reaktion (framåt: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' och omvänd: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
- Lägga till 600 ng av cDNA mall.
- Utför förstärkning reaktionen vid 50 ° C för 2 min och 95 ° C i 5 min. Inkubera reaktionen i real-time PCR systemet för 40 cykler av 95 ° C i 30 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C under 30 s.
- Inkubera provet vid 50 ° C för 30 s och 20 ° C för 10 s.
- Analysera data med PCR-programvaran.
- Beräkna det relativa uttrycket av 2-ΔΔCT metod beskrivs av Livak och Schmittgen (2001)12.
Obs: Analysera en kontroll reaktion som innehåller alla komponenter utom mallen DNA (ingen mall styrning, NTC) att kassera förorenade reagenser eller förstärkning primer-dimerer.
7. totalt Protein extrakt av cellsuspensioner av C. arabica L.
- Filtrera cellsuspensioner under vakuum med en medium-pore filterpapper.
- Väg 1 g av cellulära material och packa det i aluminiumfolie.
- Frys provet med flytande kväve. Lös upp provet i en steriliserad porslin mortel att få ett fint pulver.
- Överför provet till en injektionsflaska av glas och tillsätt 2,5 mL av utvinning buffert (400 mM tris (hydroxymetyl) aminometan hydroklorid (Tris-HCl), vid pH 8,0, med 10 mM β-merkaptoetanol, 5 mM Na2EDTA och 0,5% (w/v) natriumaskorbat.
- Blanda provet i en vortex mixer i 2 min.
Obs: Det är viktigt att provet hålls på is för att förhindra protein denaturering.
- Blanda provet i en vortex mixer i 2 min.
- Centrifugera provet vid 20 000 x g i 20 min vid 4 ° C och överföra 500 µL portioner till kryogen injektionsflaska (2 mL). Lagra prover vid-72 ° C fram till användning.
- Mätning av protein koncentrationen av provet vid 562 nm i en spektrofotometer med bicinchoninic acid test med bovint serum albumin som standard.
8. enzymatisk analys för koffein syntas
- Förbereda en reaktionsblandning i en mikrocentrifug rör innehållande 200 µM SAM, 4,07 kBq av metyl [3H]-SAM, 200 µM teobromin, 200 µM MgCl2och 5 µM koffein. Öka volymen till 200 µL med 100 mM Tris-HCl vid pH 8,0.
- Behålla mikrocentrifug röret på is och lägga till en volym av den lösliga fraktionen innehåller 7-9 mg protein. Sedan blanda av virvel och inkubera i 30 min vid 30 ° C i en termostatblandare badkar/cirkulationspumpen. För ett parti av flera prover, inkubera varje prov i två exemplar i 1 min perioder att ge tillräckligt med tid att stoppa reaktionerna för alla prover i en exakt tidsperiod på 30 min.
- Tillsätt 1 mL kloroform att stoppa reaktionen och sedan skaka provet med en vortex mixer. Skaka provet med en vortex mixer för 3 min bort radioaktiva koffein i lösningsmedlet.
- Centrifugera proverna vid 11 000 x g i 5 min och försiktigt återställa en volym på 900 µL. Överför sedan proverna till scintillation injektionsflaskor.
- Avdunsta i kloroform för att slutföra torrhet i huven vid rumstemperatur vid 25 ° C. Tillsätt 5 mL av scintillation vätska i injektionsflaskan och blanda provet.
- Analysera radioaktiviteten införlivas med koffeinet i en scintillationsräknare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koffein extrakt erhålls via processen presenteras här analyserades av TLC-densitometry genom att utsätta proverna till tallrik kromatografi enligt schemat visas i figur 1. Att kvantifiera mängden koffein i cell extrakt, en kurva med olika koncentrationer av kommersiell standard för denna förening var används (figur 2A). Mönstret av absorbansen för koffein analyserades i det synliga spektrat (UV-VIS) med en maximal absorption topp på 273 nm (figur 2B), och maximal separation av koffein på TLC plattan visade en Rf mellan 0,34 och 0,39 (figur 2 c).
Aktiviteten av koffein-syntas som utvärderas med hjälp av detta protokoll anges en viss aktivitet för detta enzym av 1,2 pkat (tabell 1). Detta enzym aktivitet var liknande som rapporterats av andra författare som använt renat protein.
Det första steget innan CCS1 genuttrycket utvärderas var isoleringen av hög kvalitet RNA. Kvaliteten på extrakt av den total-RNA härrör från cellsuspensioner utvärderades, och avskiljandet av 5S, 28S och 18S rRNA subenheter visades, som anger att RNA extraherade från prover var av hög kvalitet (figur 3A). Dessa RNA utdrag hade dock behandlas med DNAS enzym ta bort genomisk DNA-kontaminering (figur 3B), som interfererar med utarbetandet av cDNA. Därefter utfördes qPCR med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, och resultatet av smälta kurvan visade en enda förstärkning produkt för den koffein-genen (figur 4).
Figur 1. Systemet som används för tillämpningen av koffein extrakt prover på en TLC-platta. Systemet visar en kvarts platta dimension (6 x 10 cm) som används för att tillämpa upp till åtta prover inklusive koffein extrakt eller standarder. Överväga ett avstånd av 1 cm mellan prover i TLC plattan att erhålla bättre upplösning av koffein bandet separation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Påvisande av koffein av TLC-densitometry i cell extrakt av C. arabica L. (A) separation av olika koffein standard koncentrationer (lane 1, 0,4; 2, 0,6; 3, 0.8; 4, 1, 5, 1,2; och 6, 1,4 µg) och separation av sina toppar i bilden till höger. (B) absorbans mönster av en koffein standard (lila linje) och koffein extrakt (gröna linjen) på olika våglängder använda Absorptionsspektra (UV och synligt). (C) maximal separation av koffein i cellen extrahera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Extraktion av den totala RNA. RNA extrakt av cellulära suspensioner av C. arabica L. analyserades av elektrofores. (A) RNA-extraktion, (körfält 1-2 dubbletter); (B) RNA proverna utsatts för behandling med DNAS. 1% agaros gel var beredd och färgas med 3 x infoga nukleinsyra fläcken lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Smältande kurva tillverkad av qPCR programvara och RT-qPCR data. Kurvan rödmarkerade är en enda förstärkt produkt som motsvarar den koffein-genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Anläggningen | Protein-extrakt | CS-specifik aktivitet | Referens |
| Coffea | |||
| Cellsuspension | Råolja | 1.2 pkat | Detta protokoll |
| Frövita | Renat | 5.7 pkat | 12 |
| Te | |||
| Lämnar | Renat | 11 pkat | 13 |
| Guarana | |||
| Frön | Renat | 20 fkat | 14 |
Tabell 1. Jämförelse av CS-specifika aktiviteten i olika grödor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar här de optimala förutsättningarna för att utvärdera koffeinhalt, CS aktivitet och avskrift nivåer i en in vitro- växt vävnaden kultur, såsom cellsuspensioner av C. arabica. Tidigare rapporter har bekräftat att upprätthålla celler under ljus bestrålning och i närvaro av teobromin i odlingssubstratet är lämpliga parametrar för att öka nivån av koffein, vilket gör det möjligt att utvärdera de koffein separationsmetoder använda omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC). För närvarande finns det några rapporter som använder en enkel och snabb metod med ekonomiska fördelar för att studera koffein biosyntes i cellsuspensioner. Här, en alternativ bedömning visade en separationsmetod för koffein med TLC-densitometry, vilket är effektivt för kvantitativ analys av koffein i cell extrakt. Utvärdera koffein i cellerna, var det inte nödvändigt att mata teobromin till kultur cellerna som rapporterats tidigare14,15.
Koffein-syntas aktivitet har utvärderats i flera växt vävnader, inklusive frövita, blad och frön. I dessa studier ingår metoderna för bestämning av koffein synthase aktivitet ett steg av partiell protein rening som föreslog att det var nödvändigt att använda de rena enzymet16,17. Här, utfört vi en optimal protokoll för studier av CS enzymatiska aktiviteten med ett lösligt protein extrakt utan behov av åtgärder som rör rening av proteinet. CS aktivitet i den råa extraktet av cellsuspensioner kan mätas i enheter av pkat, som andra författare har rapporterat. Vi utvärderade koffeinnivåer och enzymatisk aktivitet i bladen, och de har liknande dem i in vitro- kultur.
Slutligen, även om föregående författare har studerat uttrycket av koffein-syntas, flera har använt differentierade vävnadsodling6,18. Den metod som presenteras här är användbar att erhålla en RNA extrakt och utvärdera uttrycksnivåerna av genen CCS1 av RT-qPCR i olika in vitro- modeller av cellsuspensioner för anläggningen, såsom te och kakao.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet i vårt laboratorium finansierades genom ett bidrag från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) till SMTHS. Denna forskning stöddes också av ett stipendium till RJPK (No. 37938) beviljat CONACyT och de Sistema Nacional de Investigadores (4422). Författarna tackar CIATEJ för användning av dess installationer under skrivandet av detta manuskript. Speciellt tack utvidgas till Dr Víctor Manuel González Mendoza för alla rekommendationer i molekylärbiologi avsnitt och Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM för anläggningar under inspelningen av denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
