Summary
Este protocolo describe una metodología eficiente para la extracción y cuantificación de cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. y un proceso experimental para la evaluación de la actividad enzimática de la cafeína sintasa con el nivel de expresión de el gen que codifica esta enzima.
Abstract
Cafeína (1,3,7-trimetilxantina) es un alcaloide de purinas presente en bebidas populares como el café y té. Este metabolito secundario es considerado como una defensa química ya que tiene actividad antimicrobiana y es considerado un insecticida natural. La cafeína también puede producir efectos negativos alelopáticos que impiden el crecimiento de las plantas circundantes. Además, personas de todo el mundo consuman cafeína por sus efectos analgésicos y estimulantes. Debido al interés en las aplicaciones tecnológicas de la cafeína, ha crecido la investigación sobre la vía biosintética de este compuesto. Estos estudios se han centrado principalmente en la comprensión de los mecanismos bioquímicos y moleculares que regulan la biosíntesis de la cafeína. Cultivo de tejidos in vitro se ha convertido en un sistema útil para el estudio de este camino biosintético. Este artículo describe un protocolo paso a paso para la cuantificación de cafeína y de medición de los niveles de transcripción del gen (ECC1) codificación cafeína sintasa (CS) en suspensiones celulares de C. arabica L., así como su actividad.
Introduction
La cafeína es un metabolito secundario que es biosynthesized por plantas del género Coffea1. Este alcaloide pertenece a la familia de metilxantinas y es considerada como una defensa química de la planta porque puede actuar contra los efectos adversos de agentes patógenos y herbívoros2,3. Además, este metabolito es responsable de las propiedades estimulantes de la bebida de café, que es consumido en todo el mundo4,5. Debido a sus propiedades, diversos grupos de investigación están interesados en el estudio de la vía biosintética y catabolismo de cafeína6,7. Actualmente, cultivos de vegetales en vitro de la célula y tejidos sirven como una alternativa para evaluar la acumulación de cafeína en diferentes estrategias bióticos y abióticos8,9.
Biosíntesis de la cafeína implica la liberación hidrolítica de 7-metilxantina de la nucleósido ribosa correspondiente seguido de orden N-metilaciones en las posiciones 3 y 1. Una específico S- adenosil metionina (SAM)-dependiente N-metiltransferasa (NMT) cataliza la metilación en la posición 7, considerando que la teobromina sintasa (TS) y CS están implicados en las metilaciones 3 y 1, respectivamente, produciendo teobromina y cafeína. El estudio de genes que codifican distintos territorios no metropolitanos ha permitido entender el mecanismo que regula la producción de cafeína10,11. CS, que tiene N -methyltransferase actividad, cataliza los dos últimos pasos de la vía biosintética del cafeína11. En plántulas de cafeto, se ha demostrado que la radiación de la luz puede aumentar actividad de la CS, que se traduce en un aumento en la biosíntesis de la cafeína. Recientemente, demostró que el mantenimiento de suspensiones celulares de C. arabica L. bajo irradiación de la luz es la condición óptima para la evaluación de los efectos que producen los factores de estrés abióticos que afectan la vía biosintética del cafeína8. La información obtenida en estos estudios puede tener aplicaciones en la biología ingeniería y sistemas metabólica para maximizar el estudio de la vía biosintética de la cafeína en estos sistemas in vitro .
Dadas las ventajas de obtener un modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de la cafeína, hemos optimizado las condiciones de extracción de la cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. También fue posible desarrollar un protocolo útil para el estudio de la actividad enzimática así como los pasos metodológicos para evaluar el nivel de las transcripciones del gene del synthase del cafeína de Coffea 1 (ECC1) codificación de esta enzima. Adjunto, Divulgamos un protocolo para extraer y cuantificar cafeína en suspensiones celulares de C. Arábica por cromatografía en capa fina y densitometría (TLC-densitometría).
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Protocol
1. la cafeína extracción en suspensiones celulares de C. arabica L.
- Uso de suspensiones de células de C. arabica 9. Mantener las suspensiones quincenales subcultivos en un medio Murashige y Skoog a pH 4.3 con constante 100 rpm de agitación a 25 ° C bajo luz continua (8,3 W/m2).
- Cosecha de las células debajo de filtración de vacío utilizando papel de filtro de poro de 11 μm y un embudo de Buchner.
- Registrar el peso fresco de las células colectadas usando una escala, envuelva en papel aluminio, congelar en nitrógeno líquido y mantenerlos a-80 ° C hasta su análisis.
- Liofilizar el material celular congelado durante 72 h.
- Registrar el peso de las células liofilizadas para estimar el rendimiento del peso seco.
- Almacenar el material en polvo en bolsas de polietileno reutilizables (9 cm x 7,5 cm). Macerar el material a un polvo fino y guárdelo en un desecador hasta su uso.
- Medir 0.5 g de materia seca de celular en la balanza analítica y agregar a un matraz de vidrio (25 mL).
- Añadir 10 mL de acetona a las células liofilizadas y mezclar en un vórtex durante 30 s de homogeneización. Luego, sellar el frasco con papel de aluminio.
- La mezcla a 100 rpm usando un agitador a temperatura ambiente (25 ° C) durante 5 h.
- Transferir todo el material a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos traspaso el líquido a un tubo nuevo de la fase y reducir a él sequedad a temperatura ambiente en la campana.
- Resuspender la muestra con 25 μl de acetona.
2. condiciones para la evaluación de cafeína por delgada capa de cromatografía (TLC)-densitometría
- 1 μl del extracto de cafeína previamente resuspendido se aplican a la fase estacionaria.
Nota: las placas de gel de sílice (F254) se utilizan como la fase estacionaria. Antes de aplicar las muestras, las placas se desarrollaron con 10 mL de Cloroformo-metanol [9:1 v/v] en una cámara de cromatografía (14 cm x 12 cm x 9.5 cm), y las placas se secaron a temperatura ambiente. Las características de la placa cromatográfica donde se aplican las muestras se muestran en la figura 1. La cámara se saturó por 30 min con solvente antes de desarrollar la placa. Placas de TLC deben manipular usando guantes para evitar la contaminación. - Desarrollar el TLC en la cámara de cromatografía con 10 mL de la fase móvil ciclohexano-acetona [40:50 v/v].
Nota: Esta mezcla permite la separación de la cafeína en un factor de retención (Rf) de 0.34.- Retire la placa de TLC de la cámara y dejarla secar completamente a temperatura ambiente.
- Visualizar bandas de cafeína en la luz ultravioleta de longitud de onda corta (Ultravioleta, 254 nm). Utilice una lámpara de UV compactada. Además, para este paso, uso gafas con protección UV.
- Cuantificar los niveles de cafeína por densitometría en 273 nm. El instrumento es controlado con el software de cromatografía.
3. ácido ribonucleico (ARN) aislamiento
- Tomar las suspensiones de células de paso 1.1 y vacío filtrado con papel de filtro (tamaño de poro de 11 μm).
- Recoger el material celular del papel de filtro, pesar 0.5 g de material celular en una balanza analítica y envuélvalo en papel de aluminio. Congelación de la muestra con líquido N2.
- Macerar la muestra de células en un mortero de porcelana con nitrógeno líquido y añadir 1 mL de reactivo de aislamiento de RNA hasta homogeneizada.
Nota: se deben esterilizar los morteros de porcelana en un horno a 300 ° C por 6 h. RNA aislamiento reactivo contiene isotiocianato de guanidina, fenol y otros componentes.- Transferir 500 μl de la muestra a un tubo de microcentrífuga estéril (1,5 mL). Añadir 300 μL de cloroformo-isoamyl alcohol (24:1) y 300 μL de fenol equilibrado (pH 8.0).
- Mezclar la muestra con un mezclador de tipo vórtex y luego lo Centrifugue a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir 300 μL de la fase superior a un tubo de microcentrífuga. Añadir 200 μL de isopropanol. Incubar el tubo por 1 h a-20 ° C.
- Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y luego decantar la fase líquida.
- Añadir 1 mL de etanol (70%) para formar un pellet en el tubo. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos y decantar. Repita este paso dos veces.
- Secar la muestra durante 1,5 h a temperatura ambiente (25 ° C). Agite el extracto de RNA con 25 μL de dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada.
Nota: Para la extracción de RNA, use agua tratada con DEPC 0.1% v/v.
4. incubación de transcripción de ARN con desoxirribonucleasa (DNasa)
- En un tubo de microcentrífuga estéril, agregar Extracto de 2 μg de ARN total. Añadir 1 μL de tampón de reacción de 10 x (100 mM Tris-HCl 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Añadir 1 μL de DNasa U/μL 1.
- Llevar la reacción hasta un volumen final de 10 μL con agua tratada con DEPC. Mezcle la muestra y centrifugar brevemente a 2.000 x g durante 1 minuto.
- Incubar la muestra a 37 ° C durante 30 minutos.
- Detener la reacción con la adición de 1 μL de 50 mM disódica, dihidrato ethylenediaminetetraacetate (Na2EDTA) e incubar la muestra a 65 ° C durante 10 minutos.
- Análisis de la integridad del ARN por electroforesis en gel de agarosa.
- Preparar un estándar del gel de agarosa al 1% y tinción con 1 μl de 3 x intercalando solución de tinción de ácido nucleico.
- Aplicar 500 ng de ARN a la agarosa gel y correr el gel.
- Visualizar la integridad del RNA usando un sistema de documentación de foto de gel.
- Uso el RNA como plantilla para síntesis de cDNA por la transcriptasa inversa.
5. como complemento del ácido desoxirribonucléico (cDNA) síntesis
- Añadir 2,5 μg de RNA total a un tubo de microcentrífuga. Añadir 1 μL de cebador oligo-deoxythymine (dT) y llenar el tubo hasta un volumen final de 13 μL con agua libre de nucleasa. Mezcle la muestra y luego centrifugar a 2.000 x g durante 1 minuto.
- Incubar la muestra a 65 ° C por 5 min y luego a 4 ° C por 2 min.
- Añada 4 μL de 5 x buffer de reacción para la transcriptasa reversa, 2 μL de mezcla de Deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) (10 mM de cada dNTP) y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Mezclar suavemente y centrifugar a 2.000 x g durante 1 minuto.
- Incubar la muestra a 45 ° C durante 50 minutos y luego a 70 ° C durante 10 minutos.
- Cuantificar la concentración de cDNA utilizando un espectrofotómetro UV.
- Utilice el cDNA como plantilla para la reacción en cadena de polimerasa (PCR).
Nota: Se utilizó el buffer de reacción 10 x (paso 4.1.1) y 5 veces x concentraron (paso 5.3), respectivamente.
6. en tiempo real PCR cuantitativa (qPCR) para amplificar el gen ECC1
- Añadir 7,5 μL de Taq ADN polimerasa 2 x (0,1 U/mL) y 0.1 μM de 5-carboxi-X-rodamina (ROX) a un tubo de microcentrífuga PCR.
Nota: El hot start Taq ADN polimerasa 2 x fue utilizado como una solución 2 x concentrado.- Añadir 5 μL de agua libre de nucleasa.
- Añadir 0,75 μL de 10 μM hacia adelante y hacia atrás la cartilla para amplificar el gen ECC1 (AB086414) (forward: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' y hacia atrás: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Usar primers de tubulina como el gen de mantenimiento de la casa en una reacción independiente (adelante: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' y hacia atrás: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
- Agregar 600 ng de plantilla de cDNA.
- Realizar la reacción de amplificación a 50 ° C por 2 min y 95 ° C por 5 min incuban la reacción en el sistema PCR en tiempo real durante 40 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 30 s.
- Incubar la muestra a 50 ° C para 30 s y 20 ° C durante 10 s.
- Analizar los datos con el software PCR.
- Calcular la expresión relativa de la 2-ΔΔCT método descrito por Livak y Schmittgen (2001)12.
Nota: Analizar una reacción de control que contiene todos los componentes excepto la plantilla de la DNA (sin control de plantilla, NTC) reactivos de desecho contaminado o cartilla-dímeros de amplificación.
7. total extracto proteico de suspensiones celulares de C. arabica L.
- Suspensiones celulares de filtro al vacío con un papel de filtro de poro mediano.
- Pesar 1 g de material celular y envuélvalo en papel de aluminio.
- Congelación de la muestra con nitrógeno líquido. Macerar la muestra en un mortero esterilizado porcelana hasta obtener un polvo fino.
- Transferir la muestra a un frasco de vidrio y agregar 2,5 mL de tampón de extracción (400 mM tris (hidroximetil) aminometano clorhidrato (Tris-HCl), a pH 8.0, que contienen β-mercaptoetanol de 10 mM, 5 mM Na2EDTA y ascorbato de sodio 0.5% (p/v).
- Mezclar la muestra en un vórtex durante 2 minutos.
Nota: Es importante que la muestra se mantiene en hielo para evitar la desnaturalización de la proteína.
- Mezclar la muestra en un vórtex durante 2 minutos.
- Centrifugar la muestra a 20.000 x g durante 20 min a 4 ° C y transvasar 500 μL en frascos criogénicos (2 mL). Almacenar las muestras a-72 ° C hasta su uso.
- Medir la concentración de proteína de la muestra a 562 nm en un espectrofotómetro usando análisis ácido bicinchoninic con albúmina sérica bovina como estándar.
8. ensayo enzimático para la cafeína sintasa
- Preparar una mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 μm SAM, 4.07 kBq de metilo [3H]-SAM 200 teobromina μm, 200 μm MgCl2y cafeína 5 μm. Aumentar el volumen a 200 μL con 100 mM Tris-HCl a pH de 8.0.
- Mantenga el tubo de microcentrífuga en hielo y añadir un volumen de la fracción soluble contiene 7-9 mg de proteína. Luego, mezclar por vortex e incubar durante 30 min a 30 ° C en un baño termostático/circulador. Para un lote de varias muestras, incubar cada muestra por duplicado en períodos de 1 min para dar tiempo suficiente para parar las reacciones para todas las muestras en un período de tiempo exacto de 30 minutos.
- Añadir 1 mL de cloroformo para detener la reacción y luego agitar la muestra con un mezclador de tipo vórtex. Agite la muestra usando un mezclador de tipo vórtex durante 3 minutos para eliminar la cafeína radiactiva en el solvente.
- Centrifugar las muestras a 11.000 x g durante 5 minutos y con cuidado recuperar un volumen de 900 μl. Luego, se transfieren las muestras a viales de centelleo.
- Evaporar el cloroformo para completar sequedad en la campana a temperatura ambiente a 25 ° C. Añadir 5 mL de líquido de centelleo para el vial y mezclar la muestra.
- Analizar la radiactividad incorporada en la cafeína en un contador de centelleo.
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Representative Results
Extractos de cafeína obtenidos mediante el proceso aquí presentado fueron analizados por TLC-densitometría sometiendo las muestras para la placa de cromatografía de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 1. Para cuantificar los niveles de cafeína en los extractos de la célula, una curva con diferentes concentraciones del estándar comercial para este compuesto fue utilizado (figura 2A). Se analizó el patrón de absorción de la cafeína en el espectro de luz visible (UV-VIS) con un pico máximo de absorción a 273 nm (figura 2B) y la separación máxima de cafeína en la placa de TLC demostraron un Rf entre 0.34 y 0,39 (figura 2).
La actividad de la cafeína sintasa evaluado mediante este protocolo indica una actividad específica de esta enzima de 1.2 pkat (tabla 1). Actividad de esta enzima fue similar al reportado por otros autores que utilizaron la proteína purificada.
El primer paso antes de evaluar la expresión del gen ECC1 fue el aislamiento de RNA de alta calidad. Se evaluó la calidad del extracto del ARN total derivado de suspensiones celulares, y la separación de las subunidades de rARN 28S, 18S y 5S fue demostrada, indicando que el ARN extraído de las muestras era de alta calidad (Figura 3A). Sin embargo, estos extractos de RNA tuvieron que ser tratado con la enzima DNasa para eliminar la contaminación de ADN genómica (figura 3B), que interfiere con la preparación de ADNc. Posteriormente, la qPCR fue realizada utilizando el protocolo descrito anteriormente y el resultado de la curva de fusión demostró un producto único de amplificación para el gen de la sintasa de cafeína (figura 4).
Figura 1. Esquema utilizado para el uso de la cafeína extrae las muestras en una placa de TLC. El esquema muestra una dimensión de placa de silicona (6 x 10 cm) que se utiliza para aplicar hasta ocho muestras incluyendo extractos de cafeína o normas. Considere una distancia de 1 cm entre las muestras en la placa de TLC para obtener la mejor resolución de la separación de la banda de cafeína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Detección de cafeína por TLC-densitometría en celda de extractos de C. arabica L. (A) separación de varias concentraciones estándar de cafeína (carril 1, 0.4; 2, 0.6; 3, 0.8; 4, 1; 5, 6 y 1.2; 1,4 μg) y la separación de sus cumbres en la imagen de la derecha. (B) patrones la absorbancia de un estándar de cafeína (línea morada) y la cafeína del extracto (línea verde) en diferentes longitudes de onda usando espectros de absorción (ULTRAVIOLETA y visibles). (C) Extracto de separación pico de cafeína en la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Extracción del ARN total. Los extractos de RNA de suspensiones celulares de C. arabica L. se analizaron por electroforesis. (A) extracción de RNA, (duplicados de carriles 1-2); (B) las muestras de RNA sometidas a tratamiento con DNasa. geles de agarosa al 1% fueron preparados y manchados con 3 x intercalando solución de tinción de ácido nucleico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Curva de fusión mediante qPCR software y los datos de RT-qPCR. La curva marcada en rojo es un solo producto amplificado que corresponde al gen de la sintasa de cafeína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Planta | Extracto de la proteína | Actividad específica de CS | Referencia |
| Coffea | |||
| Suspensión de células | Crudo | 1.2 pkat | Este protocolo |
| Endospermo | Purificada | pkat 5,7 | 12 |
| Té | |||
| Hojas | Purificada | pkat 11 | 13 |
| Guarana | |||
| Semillas | Purificada | fkat 20 | 14 |
Tabla 1. Comparación de la actividad de CS-específicas en diferentes cultivos.
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Discussion
Aquí presentamos las condiciones óptimas para evaluar el contenido de cafeína, niveles de actividad y transcripción de CS en una en vitro planta de cultivo de tejidos, tales como suspensiones celulares de C. arabica. Informes anteriores han confirmado que las células manteniendo bajo irradiación de la luz y en presencia de teobromina en el medio de cultivo son los parámetros adecuados para incrementar el nivel de cafeína, lo que es posible evaluar los métodos de separación de la cafeína utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). Actualmente, hay pocos informes que utilizan un método simple y rápido con ventajas económicas para el estudio de la biosíntesis de la cafeína en las suspensiones celulares. Aquí, una evaluación alternativa demostró un método de separación de cafeína utilizando TLC-densitometría, que es eficaz para el análisis cuantitativo de la cafeína en extractos celulares. Para evaluar la cafeína en las células, no era necesario alimentar la teobromina a las células de cultura como se informó anteriormente de14,15.
Actividad del synthase de cafeína ha sido evaluado en varios tejidos de la planta, incluyendo el endospermo, hojas y semillas. En estos estudios, los métodos para la determinación de la cafeína sintasa actividad incluyen un paso de purificación de proteína parcial que sugirió que era necesario utilizar la enzima purificada16,17. Aquí, se realizó un protocolo óptimo para el estudio de la actividad enzimática de la CS utilizando un extracto soluble de la proteína sin necesidad de pasos que implica la purificación de la proteína. Actividad de CS en el extracto crudo de suspensiones celulares se puede medir en unidades de pkat, como otros autores han reportado. Se evaluaron los niveles de cafeína y actividad enzimática en las hojas, y tienen niveles similares a los de cultivo en vitro .
Finalmente, aunque autores anteriores han estudiado la expresión de la sintasa de cafeína, varios han utilizado el cultivo de tejidos diferenciados6,18. La metodología aquí presentada es útil para obtener un RNA extracto y para evaluar los niveles de expresión del gen ECC1 por RT-qPCR en diferentes en vitro modelos de suspensiones celulares vegetales, como el té y el cacao.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo de nuestro laboratorio fue financiado por una subvención de la Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) a Smiths. Esta investigación también fue apoyada por una beca otorgada a RJPK (núm. 37938) por CONACyT y el Sistema Nacional de Investigadores (4422). Los autores agradecen CIATEJ para el uso de sus instalaciones durante la escritura de este manuscrito. Especial agradecimiento se extiende a Dr. Víctor Manuel González Mendoza para todas las recomendaciones en la sección de biología molecular y Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM por las facilidades durante la filmación de este artículo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
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