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Biochemistry

कैफीन निष्कर्षण, एंजाइमी गतिविधि और संयंत्र सेल सस्पेंशन से कैफीन सिंथेस की जीन अभिव्यक्ति

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58166
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2CONACYT, Facultad de Ingeniería Química, Campus de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad Autónoma de Yucatán

Summary

यह प्रोटोकॉल सी. अरेबिक एल. के सेल सस्पेंशन में कैफीन की निकासी और ठहराव के लिए एक कुशल पद्धति का वर्णन करता है और कैफीन सिंथेस की एंजाइमी गतिविधि का अभिव्यक्ति स्तर के साथ मूल्यांकन करने के लिए एक प्रायोगिक प्रक्रिया जीन है कि इस एंजाइम सांकेतिक शब्दों में बदलना ।

Abstract

कैफीन (1, 3, 7-trimethylxanthine) कॉफी और चाय जैसे लोकप्रिय पेय में एक प्यूरीन उपक्षार मौजूद है । इस माध्यमिक metabolite एक रासायनिक रक्षा के रूप में माना जाता है क्योंकि यह रोगाणुरोधी गतिविधि है और एक प्राकृतिक कीटनाशक माना जाता है । कैफीन भी नकारात्मक allelopathic प्रभाव है कि आसपास के पौधों के विकास को रोकने का उत्पादन कर सकते हैं । इसके अलावा, दुनिया भर के लोग इसके एनाल्जेसिक और stimulatory इफेक्ट के लिए कैफीन का सेवन करते हैं । कैफीन के तकनीकी अनुप्रयोगों में रुचि के कारण, इस परिसर के कृत्रिम मार्ग पर अनुसंधान हो गया है । ये अध्ययन मुख्यतः जैव रासायनिक और आणविक तंत्र है कि कैफीन के जैव संश्लेषण को विनियमित समझने पर ध्यान केंद्रित किया है । इन विट्रो में ऊतक संस्कृति इस कृत्रिम मार्ग का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली बन गया है । यह लेख कैफीन की ठहराव के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन और जीन (CCS1) एंकोडिंग कैफीन सिंथेस (सीएस) के सेल सस्पेंशन में सी. अरेबिक एल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी गतिविधि के प्रतिलिपि के स्तर को मापने के लिए होगा ।

Introduction

कैफीन एक माध्यमिक metabolite कि जीनस Coffea1के पौधों द्वारा संश्लेषित है । इस उपक्षार methylxanthine परिवार के अंतर्गत आता है और एक रासायनिक संयंत्र रक्षा के रूप में माना जाता है क्योंकि यह रोगजनकों और शाकाहारी2,3के प्रतिकूल प्रभावों के खिलाफ कार्रवाई कर सकते हैं । इसके अलावा, यह metabolite कॉफी पीने के उत्तेजक गुणों, जो सामान्यतः दुनिया भर में4,5भस्म हो जाता है के लिए जिंमेदार है । इसके गुणों के कारण, कई अनुसंधान समूहों के लिए कृत्रिम मार्ग और कैफीन6,7के catabolism का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं । वर्तमान में, इन विट्रो में संयंत्र कोशिका/ऊतक संस्कृतियों विभिंन बायोटिक और अजैव रणनीतियों8,9के तहत कैफीन संचय के मूल्यांकन के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा करते हैं ।

कैफीन hydrolytic 7 की रिहाई-methylxanthine इसी ribose nucleoside से आदेश दिया N-मिथाइल के बाद 3 और 1 पदों पर शामिल है । एक विशिष्ट एस-एडेनोसिल methionine (सैम)-निर्भर N-methyltransferase (NMT) स्थिति 7 पर मिथाइल catalyzes, जबकि theobromine सिंथेस (टीएस) और सीएस 3 में शामिल है और 1-मिथाइल, क्रमशः, उत्पादन theobromine और कैफीन. अलग NMTs एंकोडिंग जीन का अध्ययन तंत्र है कि कैफीन उत्पादन10,11को विनियमित समझने की अनुमति दी है । सीएस, जो एनmethyltransferase गतिविधि है, catalyzes के पिछले दो कदम कैफीन11के कृत्रिम मार्ग । कॉफी ट्री अंकुर में, यह दिखाया गया है कि प्रकाश विकिरण सीएस गतिविधि है, जो कैफीन के संश्लेषण में वृद्धि में परिणाम को बढ़ा सकते हैं । हाल ही में, हमें पता चला है कि सी. अरेबिक एल के सेल सस्पेंशन के रखरखाव प्रकाश विकिरण के तहत प्रभाव है कि अजैव तनाव कैफीन8के कृत्रिम मार्ग को प्रभावित कारकों का उत्पादन मूल्यांकन के लिए इष्टतम स्थिति है । इन अध्ययनों में प्राप्त जानकारी में ऐसे विट्रो प्रणालियों में कैफीन जैव सिंथेटिक मार्ग के अध्ययन को अधिकतम करने के लिए चयापचय इंजीनियरिंग और सिस्टम्स जीवविज्ञान में आवेदन कर सकते हैं.

कैफीन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्राप्त करने के लाभों को देखते हुए, हम कैफीन के लिए निष्कर्षण शर्तों को अनुकूलित सी. अरेबिक एल के सेल सस्पेंशन पर यह भी एंजाइमी गतिविधि के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रोटोकॉल विकसित करने के साथ ही Coffea कैफीन सिंथेस 1 के जीन टेप के स्तर का आकलन करने के लिए methodological कदम (CCS1) इस एंजाइम एंकोडिंग संभव था । साथ ही, हम एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट को निकालने और C. अरेबिक सेल के निलंबन में कैफीन मात्रा पतली परत क्रोमैटोग्राफी और densitometry (टीएलसी-densitometry) द्वारा ।

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Protocol

1. सी. अरेबिक एल के सेल सस्पेंशन में कैफीन निष्कर्षण

  1. Use C. अरेबिक सेल सस्पेंशन9. निरंतर प्रकाश (८.३ डब्ल्यू/एम2) के तहत 25 डिग्री सेल्सियस से अधिक लगातार १०० rpm को मिलाते हुए Murashige और Skoog माध्यम में सप्ताह उपसंस्कृतियों द्वारा सस्पेंशन को बनाए रखें ।
  2. फसल वैक्यूम निस्पंदन के तहत कोशिकाओं 11 µm ताकना फिल्टर कागज और एक Buchner कीप का उपयोग कर ।
  3. एक पैमाने का उपयोग कर एकत्र कोशिकाओं के ताजे वजन रजिस्टर, एल्यूमीनियम पंनी में उन्हें लपेट, तरल नाइट्रोजन में उन्हें फ्रीज और विश्लेषण तक-८० डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए ।
  4. ७२ एच के लिए जमे हुए सेलुलर सामग्री Lyophilize ।
  5. lyophilized कोशिकाओं का वजन रजिस्टर करें ताकि ड्राई वेट यील्ड का अनुमान लगाया जा सके ।
  6. पुन: प्रयोज्य पॉलीथीन बैग (9 सेमी x ७.५ सेमी) में पाउडर सामग्री की दुकान । Macerate एक desiccator में एक ठीक पाउडर और स्टोर करने के लिए सामग्री का उपयोग करें जब तक ।
  7. विश्लेषणात्मक पैमाने पर शुष्क सेलुलर मामले के ०.५ g उपाय और यह एक गिलास कुप्पी (25 एमएल) के लिए जोड़ें ।
    1. lyophilized कोशिकाओं के लिए एसीटोन के 10 मिलीलीटर जोड़ें और homogenization के लिए 30 एस के लिए एक भंवर मिक्सर में मिश्रण । फिर, एल्यूमीनियम पंनी के साथ कुप्पी सील ।
    2. 5 एच के लिए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर एक रोटेटर का उपयोग १०० rpm पर मिश्रण ।
  8. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए सभी सामग्री हस्तांतरण और 10 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक । तरल चरण एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण और धुएं के हुड में कमरे के तापमान पर यह सूखापन को कम ।
  9. एसीटोन के 25 µ l के साथ नमूना resuspend ।

2. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा कैफीन के आकलन के लिए शर्तें-Densitometry

  1. लागू 1 µ एल पहले से निलंबित कैफीन निकालने के स्थिर चरण के लिए ।
    नोट: सिलिका जेल प्लेट्स (F254) स्थिर चरण के रूप में उपयोग किया जाता है । नमूनों को लागू करने से पहले, प्लेटें क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल के 10 मिलीलीटर के साथ विकसित किए गए थे [9:1 v/v] एक क्रोमैटोग्राफी चैंबर में (14 सेमी x 12 cm x ९.५ cm), और प्लेटें कमरे के तापमान पर सूख गईं । क्रोमेटोग्राफिक प्लेट की विशेषताओं जहां नमूनों को लागू कर रहे है चित्रा 1में दिखाया गया है । चैंबर 30 मिनट के लिए प्लेट विकसित करने से पहले विलायक के साथ संतृप्त किया गया था । टीएलसी प्लेटें दस्ताने का उपयोग कर संदूषण से बचने के लिए संभाल चाहिए ।
  2. क्रोमैटोग्राफी कक्ष में टीएलसी को विकसित करने के साथ 10 मिलीलीटर के मोबाइल चरण cyclohexane-एसीटोन [40:50 v/
    नोट: यह मिश्रण ०.३४ के एक प्रतिधारण कारक (आरएफ) पर कैफीन की जुदाई की अनुमति देता है ।
    1. कक्ष से टीएलसी प्लेट निकालें और इसे कमरे के तापमान पर पूरी तरह से सूखने दें ।
  3. लघु तरंग दैर्ध्य पराबैंगनी प्रकाश (यूवी, २५४ एनएम) में कैफीन बैंड कल्पना । एक कॉंपैक्ट यूवी लैंप का प्रयोग करें । इसके अतिरिक्त, इस कदम के लिए, यूवी संरक्षण के साथ चश्मे का उपयोग करें ।
  4. २७३ एनएम पर densitometry द्वारा कैफीन का स्तर बढ़ाता है । साधन क्रोमैटोग्राफी सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रित किया जाता है ।

3. Ribonucleic एसिड (आरएनए) अलगाव

  1. १.१ कदम से सेल निलंबन ले लो और फिल्टर कागज के साथ वैक्यूम छानने का (11 µm ताकना आकार) ।
  2. फिल्टर कागज से सेलुलर सामग्री ले लीजिए, एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर सेलुलर सामग्री के ०.५ जी बाहर वजन और एल्यूमीनियम पंनी में पैक । तरल एन2के साथ नमूना फ्रीज ।
  3. Macerate तरल नाइट्रोजन के साथ एक चीनी मिट्टी के बरतन मोर्टार में सेल नमूना है और homogenized तक आरएनए अलगाव एजेंट की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: ३०० डिग्री सेल्सियस पर एक ओढ़ना भट्ठी में चीनी मिट्टी के बरतन मोर्टारों को निष्फल 6 h. आरएनए अलगाव रिएजेंट के लिए phenol, guanidine isothiocyanate और अन्य घटक होते हैं ।
    1. एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब (१.५ एमएल) के लिए नमूने के ५०० µ एल स्थानांतरण. क्लोरोफॉर्म-isoamyl अल्कोहल (24:1) और ३०० μL के equilibrated phenol (pH ८.०) के ३०० µ l को जोड़ें ।
  4. एक भंवर मिक्सर के साथ नमूना मिश्रण और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए २०,००० x g पर यह केंद्रापसारक ।
  5. स्थानांतरण ३०० ऊपरी चरण के μL एक microcentrifuge ट्यूब करने के लिए । isopropanol के २०० μL जोड़ें । -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ट्यूब मशीन ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक, और फिर तरल चरण खिचड़ी भाषा ।
    1. इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें (७०%) ट्यूब में एक गोली के रूप में । 10 मिनट और खिचड़ी भाषा के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
  7. कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर १.५ घंटे के लिए नमूना सूखी । diethyl pyrocarbonate (DEPC) के 25 μL के साथ आरएनए निकालने resuspend-इलाज पानी ।
    नोट: आरएनए निष्कर्षण के लिए, ०.१% DEPC वी/वी के साथ इलाज पानी का उपयोग करें ।

4. Deoxyribonuclease (DNase) के साथ आरएनए प्रतिलिपि की मशीन

  1. एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में, कुल आरएनए निकालने के 2 µ जी जोड़ें. 10x प्रतिक्रिया बफर के 1 μL जोड़ें (१०० मिमी Tris-एचसीएल, 25 मिमी MgCl2, 1 मिमी CaCl2). 1 μL की 1 U/µ l DNase जोड़ें ।
    1. DEPC-इलाज पानी के साथ 10 μL के एक अंतिम मात्रा के लिए प्रतिक्रिया लाओ । नमूना मिश्रण और 1 मिनट के लिए २,००० x g पर संक्षेप में केंद्रापसारक ।
  2. 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर नमूना मशीन ।
  3. ५० mM disodium ethylenediaminetetraacetate डाईहाइड्रेट (Na2EDTA) के 1 μL के अलावा के साथ प्रतिक्रिया बंद करो और 10 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन ।
  4. agarose जेल ट्रो द्वारा आरएनए की अखंडता का विश्लेषण.
    1. एक मानक 1% agarose जेल तैयार है और 3x intercalating न्यूक्लिक एसिड दाग समाधान के 1 µ एल के साथ यह दाग ।
    2. agarose जेल के लिए ५०० आरएनए के एनजी लागू करें और जेल चलाते हैं ।
    3. एक जेल फोटो प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर आरएनए की अखंडता कल्पना ।
    4. transcriptase रिवर्स द्वारा सीडीएनए संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में आरएनए का उपयोग करें.

५. पूरक Deoxyribonucleic अम्ल (सीडीएनए) संश्लेषण

  1. कुल आरएनए के २.५ μg को एक microcentrifuge ट्यूब में जोड़ें । oligo-deoxythymine (डीटी) प्राइमरी का 1 μL जोड़ें और ट्यूब को nuclease से मुक्त पानी के साथ 13 μL अंतिम मात्रा में भरें । नमूना मिश्रण और फिर 1 मिनट के लिए एक २,००० x g केंद्रापसारक ।
  2. 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर नमूना मशीन और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ।
  3. के 4 μL जोड़ें 5x प्रतिक्रिया बफ़र रिवर्स transcriptase, 2 μL के deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) मिश्रण (प्रत्येक dNTP के 10 मिमी) और रिवर्स μL के 1 transcriptase (२०० यू/µ एल) के लिए इस्तेमाल किया । धीरे मिश्रण और 1 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  4. ५० मिनट के लिए ४५ डिग्री सेल्सियस पर नमूना और फिर 10 मिनट के लिए ७० ° c पर मशीन ।
  5. एक यूवी spectrophotometer का उपयोग कर सीडीएनए एकाग्रता यों तो ।
  6. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए का उपयोग करें ।
    नोट: प्रतिक्रिया बफर के रूप में इस्तेमाल किया गया था 10x (कदम शुू) और 5x टाइंस केंद्रित (चरण ५.३), क्रमशः ।

6. वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) जीन CCS1 बढ़ाना

  1. Taq डीएनए पोलीमरेज़ 2x के ७.५ μL (०.१ U/एमएल) और 5 के ०.१ माइक्रोन-carboxy-एक्स-rhodamine (ROX) एक पीसीआर microcentrifuge ट्यूब जोड़ें ।
    नोट: गर्म शुरू Taq डीएनए पोलीमरेज़ 2x एक समाधान 2x केंद्रित के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।
    1. nuclease के 5 μL जोड़ें-मुफ्त पानी ।
    2. जोड़ें ०.७५ μL प्रत्येक के 10 माइक्रोन फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर को बढ़ाना जीन CCS1 (AB086414) (फॉरवर्ड: 5 '-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3 ' और रिवर्स: 5 '-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3 ') । घर के रूप में tubulin के लिए उपयोग प्राइमरों एक अलग प्रतिक्रिया में जीन रखने (फॉरवर्ड: 5 '-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3 ' और रिवर्स: 5 '-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3 ')9।
    3. जोड़ें ६०० सीडीएनए टेंपलेट के एनजी ।
  2. 5 मिनट के लिए 2 मिनट और ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धन प्रतिक्रिया प्रदर्शन. 30 एस के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस के ४० चक्र के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में प्रतिक्रिया की शुरुआत, 30 एस के लिए ६० ° c और के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस 30 एस ।
  3. 10 एस के लिए 30 एस और 20 डिग्री सेल्सियस के लिए ५० ° c पर नमूना मशीन
  4. पीसीआर सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण ।
  5. Livak और Schmittgen (२००१)12द्वारा वर्णित 2-ΔΔCT विधि द्वारा सापेक्ष व्यंजक की गणना करें ।
    नोट: एक नियंत्रण प्रतिक्रिया है कि डीएनए टेंपलेट को छोड़कर सभी घटकों का विश्लेषण (कोई टेंपलेट नियंत्रण, एनटीसी) दूषित रिएजेंट या प्रवर्धन प्राइमर-dimers को त्यागने के लिए ।

7. सी. अरेबिक एल के सेल सस्पेंशन का कुल प्रोटीन निकालने

  1. एक मध्यम-ताकना फिल्टर कागज के साथ वैक्यूम के तहत फ़िल्टर सेल सस्पेंशन.
  2. सेलुलर सामग्री के 1 जी वजन और एल्यूमीनियम पंनी में पैक ।
    1. तरल नाइट्रोजन के साथ नमूना फ्रीज । Macerate एक निष्फल चीनी मिट्टी के बरतन मोर्टार में नमूना एक ठीक पाउडर प्राप्त करने के लिए ।
  3. नमूना एक गिलास शीशी में स्थानांतरण और निष्कर्षण बफर की २.५ मिलीलीटर (४०० mm tris (hydroxymethyl) aminomethane हाइडरोक्लॉराइड (tris-HCl), पीएच ८.० में, 10 मिमी β-mercaptoethanol, 5 मिमी ना2EDTA और ०.५% (डब्ल्यू/वी) सोडियम ascorbate जोड़ने ।
    1. 2 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर में नमूना मिश्रण ।
      नोट: यह नमूना प्रोटीन विकार को रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाता है कि महत्वपूर्ण है ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस और ५०० µ एल aliquots में क्रायोजेनिक शीशियों (2 मिलीलीटर) में स्थानांतरण पर 20 मिनट के लिए २०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । नमूने पर-७२ ° c उपयोग तक संग्रहीत करें ।
  5. एक spectrophotometer में ५६२ एनएम पर नमूना के प्रोटीन एकाग्रता उपाय मानक के रूप में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन के साथ bicinchoninic एसिड परख का उपयोग कर ।

8. कैफीन सिंथेस के लिए एंजाइमी परख

  1. एक microcentrifuge ट्यूब में एक रिएक्शन मिक्सचर तैयार करें जिसमें २०० µ एम सैम, ४.०७ kBq मिथाइल [3एच]-सैम, २०० µ एम theobromine, २०० µ एम MgCl2, और 5 µ एम कैफीन युक्त हों । ८.० के एक पीएच में १०० mM Tris-HCl के साथ २०० µ l के लिए वॉल्यूम बढ़ाएं ।
  2. बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब रखें और घुलनशील अंश की मात्रा जोड़ें जिसमें 7-9 मिलीग्राम प्रोटीन होता है । फिर, भंवर और एक थर्मोस्टेट स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस में 30 मिनट के लिए मशीन से मिश्रण/ कई नमूनों के एक बैच के लिए, 30 मिनट की एक सटीक समय अवधि में सभी नमूनों के लिए प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए पर्याप्त समय देने के लिए 1 मिनट की अवधि में डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने की मशीन ।
    1. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर जोड़ें और फिर एक भंवर मिक्सर के साथ नमूना हिला । विलायक में रेडियोधर्मी कैफीन को दूर करने के लिए 3 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर नमूना शेक ।
  3. 5 मिनट के लिए ११,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक और ध्यान से ९०० µ एल के एक खंड की वसूली इसके बाद, नमूनों को जुटाई शीशियों में स्थानांतरित करें ।
  4. 25 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर हुड में सूखापन पूरा करने के लिए क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना । शीशी में 5 मिलीलीटर तरल पदार्थ जोड़ें और नमूना मिश्रण ।
  5. एक जुटाना काउंटर में कैफीन में शामिल रेडियोधर्मिता का विश्लेषण.

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Representative Results

कैफीन अर्क यहां प्रस्तुत की प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त टीएलसी-densitometry द्वारा विश्लेषण किया गया प्लेट क्रोमैटोग्राफी के लिए नमूनों की योजना के अनुसार चित्रा 1में दिखाया गया है । कोशिका अर्क में कैफीन के स्तर को बढ़ाता है, इस यौगिक के लिए वाणिज्यिक मानक के विभिन्न सांद्रता के साथ एक वक्र का उपयोग किया गया था (चित्रा 2a). कैफीन के लिए अवशोषक के पैटर्न दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम में विश्लेषण किया गया था (यूवी विज़) २७३ एनएम (चित्रा 2 बी) में एक अधिकतम अवशोषण चोटी का उपयोग कर, और टीएलसी प्लेट पर कैफीन की चोटी जुदाई ०.३४ और ०.३९ (चित्रा 2c) के बीच एक आरएफ दिखाया ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर मूल्यांकन कैफीन सिंथेस की गतिविधि १.२ pkat (तालिका 1) के इस एंजाइम के लिए एक विशिष्ट गतिविधि का संकेत दिया । इस एंजाइम गतिविधि है कि अंय लेखकों जो शुद्ध प्रोटीन का इस्तेमाल द्वारा रिपोर्ट के समान था ।

CCS1 जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने से पहले पहला कदम उच्च गुणवत्ता आरएनए के अलगाव था । सेल सस्पेंशन से व्युत्पंन कुल आरएनए के निकालने की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया था, और 28S, 18S और 5 एस rRNA उपइकाइयों के जुदाई का प्रदर्शन किया था, यह दर्शाता है कि आरएनए नमूनों से निकाली उच्च गुणवत्ता (चित्रा 3ए) की थी. हालांकि, इन आरएनए अर्क DNase एंजाइम के साथ इलाज किया जाना था जीनोमिक डीएनए संदूषण (चित्रा बी), जो सीडीएनए की तैयारी के साथ हस्तक्षेप को दूर करने के लिए । बाद में, qPCR प्रोटोकॉल का उपयोग कर ऊपर वर्णित किया गया था, और पिघल वक्र के परिणाम कैफीन सिंथेस जीन (4 अंक) के लिए एक एकल प्रवर्धन उत्पाद दिखाया ।

Figure 1
चित्र 1. योजना एक टीएलसी प्लेट पर कैफीन निकालने के नमूने के आवेदन के लिए इस्तेमाल किया । योजना एक सिलिका प्लेट आयाम (6 x 10 सेमी) है कि कैफीन निष्कर्षों या मानकों सहित आठ नमूनों को लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है दिखाता है । कैफीन बैंड जुदाई का बेहतर समाधान प्राप्त करने के लिए टीएलसी प्लेट में नमूनों के बीच 1 सेमी की दूरी पर विचार करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. C. अरेबिक एल के सेल अर्क में टीएलसी-densitometry द्वारा कैफीन का पता लगाना । (क) विभिंन कैफीन मानक सांद्रता के पृथक्करण (लेन 1, ०.४; 2, ०.६; 3, ०.८; 4, 1; 5, १.२; और 6, १.४ µ g) और दाईं ओर छवि में अपनी चोटियों की जुदाई । (ख) एक कैफीन मानक (बैंगनी लाइन) और कैफीन निकालने (हरी रेखा) अवशोषण स्पेक्ट्रा का उपयोग विभिन्न तरंग दैर्ध्य में (पराबैंगनी और दिखाई) के अवशोषक पैटर्न । (ग) सेल निकालने में कैफीन की पीक जुदाई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. कुल आरएनए का निष्कर्षण । सी. अरेबिक एल के सेल्यूलर सस्पेंशन का आरएनए अर्क ट्रो द्वारा विश्लेषण किया गया. (क) आरएनए निष्कर्षण, (गलियाँ 1-2 डुप्लीकेट्स); (ख) आरएनए DNase के साथ उपचार के अधीन नमूने । 1% agarose जैल तैयार किया गया और 3x intercalating न्यूक्लिक एसिड दाग समाधान के साथ दाग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. पिघलने वक्र qPCR सॉफ्टवेयर और RT-qPCR डेटा का उपयोग कर उत्पादित । वक्र लाल रंग में चिह्नित एक एकल प्रवर्धित उत्पाद है कि कैफीन सिंथेस जीन से मेल खाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संयंत्र प्रोटीन निकालें सीएस विशिष्ट गतिविधि संदर्भ
Coffea
सेल सस्पेंशन कच्चे तेल १.२ pkat इस प्रोटोकॉल
Endosperm शुद्ध ५.७ pkat 12
चाय
पत्ते शुद्ध 11 pkat 13
Guarana
बीज शुद्ध 20 fkat 14

तालिका 1. विभिन्न फसलों में सीएस-विशिष्ट गतिविधि की तुलना ।

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Discussion

हम यहां कैफीन सामग्री, सीएस गतिविधि और प्रतिलिपि स्तर में एक में इन विट्रो संयंत्र ऊतक संस्कृति, सी. अरेबिकके सेल सस्पेंशन के रूप में मूल्यांकन के लिए इष्टतम शर्तों प्रस्तुत करते हैं । पिछले रिपोर्टों की पुष्टि की है कि प्रकाश विकिरण के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने और संस्कृति माध्यम में theobromine की उपस्थिति में कैफीन के स्तर को बढ़ाने के लिए उपयुक्त मापदंडों रहे हैं, यह कैफीन जुदाई तरीकों का मूल्यांकन करने के लिए संभव बनाने का उपयोग कर उलट-चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (RP-HPLC) । वर्तमान में, वहां कुछ रिपोर्टों है कि सेल सस्पेंशन में कैफीन का अध्ययन करने के लिए आर्थिक लाभ के साथ एक सरल और तेजी से विधि का उपयोग कर रहे हैं । यहां, एक वैकल्पिक मूल्यांकन कैफीन टीएलसी-densitometry, जो कोशिका निष्कर्षों में कैफीन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कुशल है का उपयोग कर के लिए एक जुदाई विधि से पता चला । कोशिकाओं में कैफीन का मूल्यांकन करने के लिए, यह आवश्यक नहीं था संस्कृति कोशिकाओं को theobromine फ़ीड के रूप में पहले14,15की सूचना दी ।

कैफीन सिंथेस गतिविधि endosperm, पत्तियों और बीजों सहित कई संयंत्र के ऊतकों में मूल्यांकन किया गया है । इन अध्ययनों में, कैफीन सिंथेस गतिविधि के निर्धारण के लिए तरीकों आंशिक प्रोटीन शुद्धि के एक कदम है कि सुझाव दिया है कि यह शुद्ध एंजाइम16,17का उपयोग करने के लिए आवश्यक था शामिल थे । यहां, हम सीएस एंजाइमी के अध्ययन के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल प्रदर्शन एक घुलनशील प्रोटीन निकालने का उपयोग कर कदम के लिए प्रोटीन की शुद्धि को शामिल करने की आवश्यकता के बिना । सीएस गतिविधि सेल निलंबन के क्रूड निकालने में pkat की इकाइयों में मापा जा सकता है, के रूप में अंय लेखकों की रिपोर्ट है । हम कैफीन का स्तर और पत्तियों में एंजाइमी गतिविधि का मूल्यांकन, और वे इन विट्रो संस्कृति में उन लोगों के लिए समान स्तर है ।

अंत में, हालांकि पिछले लेखकों कैफीन सिंथेस की अभिव्यक्ति का अध्ययन किया है, कई विभेदित ऊतक संस्कृति6,18का इस्तेमाल किया है । यहां प्रस्तुत पद्धति एक आरएनए निकालने प्राप्त करने के लिए और इस तरह के चाय और कोको के रूप में संयंत्र सेल सस्पेंशन, के विभिंन इन विट्रो मॉडल में RT-qPCR द्वारा जीन CCS1 की अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हमारी प्रयोगशाला का काम Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT २१९८९३) से SMTHS को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह शोध भी CONACyT और Sistema Nacional de Investigadores (४४२२) द्वारा RJPK (No. ३७९३८) को दी फैलोशिप द्वारा समर्थित था । लेखक इस पांडुलिपि के लेखन के दौरान अपनी स्थापनाओं के उपयोग के लिए CIATEJ का धन्यवाद करते हैं । विशेष धंयवाद आणविक जीवविज्ञान अनुभाग और Valentín मेंडोज़ा Rodríguez, IFC, उणां में सभी सिफारिशों के लिए Dr. Víctor मैनुअल गोंजालेज मेंडोज़ा के लिए विस्तारित कर रहे है इस लेख के फिल्मांकन के दौरान सुविधाओं के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture PhytoTechnology Laboratories M524 Packge Size: 50 L
Reagent (mg/L)
Ammonium Nitrate (1650)
Boric acid (6.2)
Calcium chloride, anhydrous (322.2)
Cobalt Chloride•H2O (0.025)
Cupric Sulfate•5H2O (0.025)
Na2EDTA•2H2O (37.26)
Ferrous Sulfate•7H2O (27.8)
Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7)
Manganese Sulfate•H2O (16.9)
Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25)
Potassium Iodide (0.83)
Potassium Nitrate (1900)
Potassium Phosphate, Monobasic (170)
Zinc Sulfate•7H2O (8.6)
Supplemented with
myo-inositol (100)
thiamine (10)
cysteine (25)
sucrose (30000)
2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3)
6-benzylamine purine (1)
Caffeine SIGMA C0750-5G STANDARD-5g
Theobromine SIGMA T4500 20 g
CAMAG TLC Scanner-4 CAMAG 27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software CAMAG 1.4.10 Software
Isoamyl alcohol (24:1) SIGMA C-0549 500 mL
Cyclohexane JALMEX C4375-13 1 L
Acetone J.T. BAKER 900643 4 L
Methanol J.T. BAKER 9093-03 4 L
Chloroform JALMEX C-4425-15 3.5 L
TLC silica gel 60 F254 Merck 1.05554.0001 TLC plate
β-mercaptoethanol M6250 SIGMA 100 mL
(+)-sodium L- ascorbate A4034 SIGMA 100 g
Trizma base SIGMA T6066 1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38% J.T. Baker 9535-05 2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo scientific 232227 Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine Perkin Elmer NET155 Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials SIGMA Z253081
Thermostatic bath/circulator Cole Parmer 60714
Micro centrifugue tube Eppendorf Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials Heathrow Scientific HS23202A 2 mL
Centrifuge 5804 Eppendorf 5804 000925
Vortex Thermolyne LR 5947
Porcelain mortar Fisherbrand FB961B
Filter paper Whatman Z274844 Porosity medium
Picofuge Stratagene 400550 2000 x g
Analytical balance AND HR-120 Model HR-120
Scintillation counter Beckman Coulter 6500
Gel photodocumentation system Bio-Rad Chemic XRS Model Chemic XRS
Compact UV lamp UVP 95002112 UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel SIGMA 2419907 Type 37600 mixer
TRIzol reagent Thermo scientific 15596-018 200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase Thermo scientific #EP0441 10000 U
Oligo (dT)18 primer Thermo scientific #S0131 100 µM
DNase I, RNase-free Thermo scientific #EN0525 1000 U
Magnesium chloride Thermo scientific EN0525 1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid Thermo scientific EN0525 1 mL
dNTP mix Thermo scientific R0191 R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X) Thermo scientific K0251 For 200 reactions of 25 µL
PikoReal Thermo scientific 2.2 Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure USB J75829 100 mL
Isopropyl alcohol Karal 2040 1 L
Ethyl alcohol SIGMA 64175 1 L
Diethyl pyrocarbonate SIGMA D5758 100 mL
Lab Rotator LW Scientific Mod. LW210

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References

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जैव रसायन अंक १४० Coffea अरेबिक सेल सस्पेंशन कैफीन निष्कर्षण कैफीन सिंथेस गतिविधि CSS1 जीन एक्सप्रेशन टीएलसी-densitometry सेकंडरी चयापचयों
कैफीन निष्कर्षण, एंजाइमी गतिविधि और संयंत्र सेल सस्पेंशन से कैफीन सिंथेस की जीन अभिव्यक्ति
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Pech-Kú, R.,… More

Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Hernández-Sotomayor, S. M. T. Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions. J. Vis. Exp. (140), e58166, doi:10.3791/58166 (2018).

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