Summary
ويصف هذا البروتوكول وضع منهجية فعالة لاستخراج وتحديد كمية الكافيين في تعليق خلية للأم آرابيكا جيم- وهي عملية تجريبية لتقييم النشاط الأنزيمي من الكافيين synthase مع مستوى التعبير الجين الذي يشفر هذا الإنزيم.
Abstract
الكافيين (1,3,7-تريميثيلكسانثيني) قلويد البيورين في المشروبات شعبية مثل القهوة والشاي. ويعتبر هذا المستقلب الثانوية دفاع كيميائية لأنها نشاط الميكروبات وتعتبر مبيد حشري طبيعي. يمكن أن تنتج من الكافيين أيضا الآثار السلبية المانعة لمنع نمو النباتات المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، الناس في جميع أنحاء العالم تستهلك الكافيين لإثارة مسكن ومحفزة. سبب الاهتمام بالتطبيقات التكنولوجية من الكافيين، ازداد البحث في مسار السكروز من هذا المركب. هذه الدراسات قد ركزت أساسا على فهم الآليات الجزيئية والبيوكيميائية التي تنظم تخليق الحيوي الكافيين. وقد أصبحت زراعة الأنسجة في المختبر نظام مفيد لدراسة هذا المسار السكروز. هذه المادة سوف تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحديد الكمي للكافيين وقياس مستويات نسخة من الجينات (CCS1) ترميز الكافيين synthase (CS) في تعليق خلية L. C. آرابيكا ، فضلا عن نشاطها.
Introduction
الكافيين هو المستقلب ثانوية التي يتم بيوسينثيسيزيد من نباتات جنس كوفا1. هذا قلويد ينتمي إلى أسرة زانتين، وهو يعتبر هو دفاع عن مصنع الكيميائي نظراً لأنها يمكن أن تعمل ضد الآثار السلبية للعوامل الممرضة واكلات العشب2،3. وبالإضافة إلى ذلك، هذا المستقلب المسؤول عن خصائص محفزة لشرب القهوة، الذي هو عادة المستهلكة في العالم4،5. بسبب خصائصه، مجموعات بحثية عديدة مهتمة بدراسة مسار السكروز وتقويض الكافيين6،7. حاليا، يعمل المصنع في المختبر الثقافات الخلية/الأنسجة كبديل لتقييم الكافيين تراكم تحت مختلف الاستراتيجيات الحيوية وغير الحيوية8،9.
الكافيين الحيوي ينطوي على إطلاق سراح 7-زانتين هيدروليكي من نوكليوزيد الريبوز المقابلة متبوعاً بأمر N-ميثيليشنز في مناصب 3 و 1. -Adenosyl قمحددة ميثيونين (SAM)-تعتمد N-ميثيلترانسفيراسي (NMT) يحفز مثلايشن الموضع 7، بينما الثيوبرومين synthase (TS) و CS تشارك في 3-و 1-ميثيليشنز، على التوالي، إنتاج الثيوبرومين و الكافيين. وقد أتاح دراسة الجينات ترميز نمتس متميزة فهم الآلية التي ينظم الكافيين إنتاج10،11. خدمات العملاء، والذي ن-ميثيلترانسفيراسي النشاط، يحفز الأخيرين خطوات مسار السكروز من الكافيين11. في شتلات أشجار البن، فقد ثبت أن الإشعاعات الخفيفة يمكن زيادة النشاط CS، مما يؤدي إلى زيادة في التركيب الحيوي الكافيين. في الآونة الأخيرة، واظهرنا أن الحفاظ على تعليق خلية من آرابيكا C. L. تحت إشعاع الضوء هو الشرط الأمثل لتقييم الآثار التي تنتج عوامل الإجهاد اللاأحيائية المؤثرة في مسار السكروز من الكافيين8. المعلومات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات قد التطبيقات في علم الأحياء الهندسة ونظم الأيضية لتعظيم دراسة مسار السكروز الكافيين في هذه النظم في المختبر .
بالنظر إلى المزايا للحصول على نموذج مناسب لدراسة التركيب الحيوي الكافيين، نحن الأمثل شروط استخراج الكافيين في تعليق خلية آرابيكا جيم- ل. كما أنه من الممكن لوضع بروتوكول مفيدة لدراسة النشاط الأنزيمي، فضلا عن الخطوات المنهجية لتقييم مستوى الجينات محاضر كوفا الكافيين synthase 1 (CCS1) الترميز هذا الإنزيم. وهنا، نحن تقرير بروتوكول لاستخراج وتحديد كمية الكافيين في تعليق خلية آرابيكا جيم- كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وقياس كثافة (TLC-قياس كثافة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الكافيين الاستخراج في "تعليق خلية" من آرابيكا جيم- ل.
- استخدام تعليق خلية آرابيكا جيم- 9. المحافظة على أن الإيقاف بثقافات فرعية مرة كل أسبوعين في المتوسط موراشيجي وسكوغ في pH 4.3 مع ثابت 100 لفة في الدقيقة تهتز عند 25 درجة مئوية تحت ضوء مستمر (8.3 واط/م2).
- حصاد الخلايا تحت فراغ الترشيح باستخدام ورق الترشيح المسام ميكرومتر 11 وقمع بوخنر.
- تسجيل الوزن الطازج للخلايا التي تم جمعها باستخدام مقياس والتفاف عليها في رقائق الألومنيوم، وتجميدها في نيتروجين سائل وإبقائهم في-80 درجة مئوية حتى التحليل.
- ليوفيليزي مادة 72 ح الخلوية المجمدة.
- تسجيل وزن الخلايا المجففة بالتبريد من أجل تقدير العائد من الوزن الجاف.
- تخزين المواد مسحوق في أكياس البولي إيثيلين قابلة لإعادة الاستخدام (9 سم × 7.5 سم). مسرات المواد إلى مسحوق ناعم ومخزن في مجفف حتى الاستخدام.
- قياس 0.5 غرام المادة الجافة الخلوية بمقياس تحليلي وإضافته إلى قارورة زجاج (25 مل).
- أضف 10 مل الأسيتون في الخلايا المجففة بالتبريد وتخلط في خلاط دوامة لمدة 30 ثانية للتجانس. ثم ختم قارورة مع رقائق الألومنيوم.
- مزيج من 100 لفة في الدقيقة باستخدام المدورة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ح 5.
- نقل جميع المواد إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لأدنى 10 نقل السائل المرحلة إلى أنبوب جديد وتقلل بذلك جفاف في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.
- ريسوسبيند العينة مع 25 ميليلتر من الأسيتون.
2-شروط التقييم للكافيين برقيقة الطبقة اللوني (TLC)-قياس كثافة
- تطبيق 1 ميليلتر من استخراج الكافيين حراكه سابقا إلى مرحلة ثابتة.
ملاحظة: يتم استخدام لوحات هلام السليكا (F254) كمرحلة ثابتة. قبل تطبيق هذه العينات، ووضعت اللوحات مع 10 مل من كلوروفورم-الميثانول [9:1 v/v] في دائرة لوني (14 سم × 12 سم × 9.5 سم)، واللوحات تم تجفيفها في درجة حرارة الغرفة. خصائص لوحة الكروماتوغرافي التي تطبق فيها العينات مبينة في الشكل 1. وكان المشبعة الدائرة لمدة 30 دقيقة مع المذيب قبل وضع اللوحة. لوحات TLC ينبغي التعامل مع استخدام القفازات لتجنب التلوث. - تطوير TLC في قاعة الفصل اللوني مع 10 مل من المرحلة المتنقلة الحلقي-الأسيتون [40:50 v/v].
ملاحظة: يسمح هذا الخليط فصل الكافيين في معامل استبقاء 0.34 (Rf).- إزالة لوحة TLC من الدائرة وأتركها تجف تماما في درجة حرارة الغرفة.
- تصور الفرق الكافيين في الطول الموجي القصير الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية، 254 نانومتر). استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية مدمجة. بالإضافة إلى ذلك، أن استخدام نظارات لهذه الخطوة، مع الحماية من الأشعة فوق البنفسجية.
- قياس مستويات الكافيين بقياس كثافة في 273 شمال البحر الأبيض المتوسط. يتم التحكم في الصك مع البرمجيات اللوني.
3-الحمض النووي الريبي (الرنا) العزل
- أن تعليق خلية من الخطوة 1، 1 والفراغ فيلتراتي مع ورق الترشيح (حجم المسام ميكرومتر 11).
- جمع المواد الخلوية من ورق الترشيح وتزن بها 0.5 غرام مواد الخلوية على توازن التحليلي وحزمة في رقائق الألومنيوم. تجميد العينة مع سائل ن2.
- ماسيراتي العينة الخلية في قذيفة هاون خزف مع النتروجين السائل وإضافة 1 مل كاشف عزل الحمض النووي الريبي حتى تجانس.
ملاحظة: تعقيم هاون الخزف في فرن دثر في 300 درجة مئوية لكاشف العزلة h. 6 الحمض النووي الريبي يحتوي على الفينول و isothiocyanate غوانيدين والمكونات الأخرى.- نقل 500 ميليلتر من العينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة (1.5 مل). إضافة 300 ميليلتر من الكحول كلوروفورم-إيسواميل (24:1) و 300 ميكروليتر من الفينول متوازن (pH 8.0).
- خلط العينة مع خلاط دوامة وثم الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل 300 ميكروليتر المرحلة العليا لأنبوب ميكروسينتريفوجي. إضافة 200 ميكروليتر من الايزوبروبانول. احتضان الأنبوب ح 1 في-20 درجة مئوية.
- الطرد المركزي الأنبوب في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية، ومن ثم صب الطور السائل.
- أضف 1 مل إيثانول (70 في المائة) لتشكيل بيليه في الأنبوب. الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق، وصب. كرر هذه الخطوة مرتين.
- الجاف للعينة 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). ريسوسبيند استخراج الحمض النووي الريبي مع 25 ميكروليتر من ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-المياه المعالجة.
ملاحظة: لاستخراج الحمض النووي الريبي، استخدام المياه المعالجة مع 0.1% ديبك v/v.
4-الحضانة للحمض النووي الريبي نسخة مع ديوكسيريبونوكليسي (الدناز)
- في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة، إضافة استخراج 2 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي. أضف 1 ميكروليتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت (100 مم تريس-HCl، 25 مم مجكل2، 1 مم كاكل2). إضافة ميكروليتر 1 من 1 يو/ميليلتر الدناز.
- تحقيق رد الفعل على وحدة تخزين نهائي من 10 ميكروليتر مع المياه المعالجة ديبك. مزيج عينة وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز في 2,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- وقف رد الفعل مع إضافة 1 ميكروليتر من 50 مم ثنائي اتهيلينيديامينيتيتراسيتاتي ثنائي هيدرات (نا2يدتا) واحتضان العينة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحليل سلامة الجيش الملكي النيبالي بالتفريد [اغروس] هلام.
- إعداد 1% [اغروس] هلام قياسية ووصمة عار مع 1 ميليلتر من 3 × إينتيركالاتينج الحل وصمة عار الحمض النووي.
- تطبيق 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي [اغروس] هلام وتشغيل الهلام.
- تصور تكامل الجيش الملكي النيبالي باستخدام نظام توثيق صور هلام.
- استخدام الحمض النووي الريبي كالقالب لتوليف كدنا قبل المنتسخة العكسية.
5-يكمل الحمض الخلوي الصبغي (كدنا) التوليف
- إضافة 2.5 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي لأنبوب ميكروسينتريفوجي. أضف 1 ميكروليتر من التمهيدي اليغو-ديوكسيثيميني (dT) وملء الأنبوب إلى وحدة تخزين نهائي ميكروليتر 13 مع المياه خالية من نوكلاس. خلط العينة وثم الطرد المركزي س 2,000 ز لمدة 1 دقيقة.
- احتضان العينة على 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم على 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إضافة ميكروليتر 4 من 5 س رد فعل المخزن المؤقت المستخدم المنتسخة العكسية، 2 ميكروليتر من مزيج تريفوسفاتيس (دنتبس) ديوكسينوكليوتيدي (10 ملم لكل دنتب) وميكروليتر 1 لعكس المنتسخة (200 يو/ميليلتر). المزيج بلطف والطرد المركزي في س 2,000 ز لمدة 1 دقيقة.
- احتضان العينة عند 45 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ومن ثم على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قياس تركيز كدنا استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية.
- استخدام كدنا كالقالب البلمرة المتسلسل (PCR).
ملاحظة: استخدمت رد فعل المخزن المؤقت 10 × (الخطوة 4.1.1) وتتركز 5 x مرات (الخطوة 5، 3)، على التوالي.
6-في الوقت الحقيقي PCR الكمي (qPCR) لتضخيم الجين CCS1
- إضافة ميكروليتر 7.5 من "بوليميراز الدنا" بوليميراز 2 × (0.1 U/mL) و 0.1 ميكرو من 5-كاربوكسي-س-والرودامين (روكس) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي بكر.
ملاحظة: بوليميراز "الدنا بوليميراز" بداية ساخنة 2 x استخدمت كحل 2 × مركزة.- إضافة 5 ميكروليتر من المياه خالية من نوكلياسي.
- إضافة ميكروليتر 0.75 كل من 10 ميكرومترات إلى الأمام وعكس التمهيدي لتضخيم الجين CCS1 (AB086414) (إلى الأمام:-ككتجتاتككتجكجاتجاكا 5 '-3' وعكس:-آكاكتاتكاتاجاجككتتج 5 '-3'). استخدام كبسولة تفجير ل tubulin كالجين حفظ البيت في رد فعل منفصلة (إلى الأمام:-جتجكككاكتججتكا 5 '-3' وعكس: 5 '-ككتككتككاتاككتكاكك-3')9.
- إضافة 600 نانوغرام قالب كدنا.
- القيام برد فعل التضخيم عند 50 درجة مئوية لاحتضان 2 دقيقة و 95 درجة مئوية للحد الأدنى 5 رد فعل في نظام PCR الوقت الحقيقي لدورات 40 من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 s و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
- احتضان العينة عند 50 درجة مئوية عن 30 ثانية و 20 درجة مئوية لمدة 10 ق.
- تحليل البيانات مع البرنامج PCR.
- حساب التعبير النسبية من 2-وصف أسلوبΔΔCT ليفاك وشميتجين (2001)12.
ملاحظة: تحليل رد فعل على عنصر تحكم الذي يحتوي على كافة المكونات باستثناء القالب الحمض النووي (لا قالب التحكم، المجلس الوطني الانتقالي) الكواشف تجاهل الملوثة أو التضخيم مبلمر.
7-مجموع البروتين مقتطف من "تعليق خلية" من آرابيكا جيم- ل.
- تصفية تعليق خلية تحت الفراغ مع ورقة تصفية المسام المتوسطة.
- وزن 1 غرام مواد الخلوية وحزمة في رقائق الألومنيوم.
- تجميد العينة مع النتروجين السائل. ماسيراتي العينة في قذيفة هاون خزف معقمة للحصول على مسحوق ناعم.
- نقل العينة إلى قنينة زجاجية وإضافة 2.5 مل من استخراج المخزن المؤقت (400 مم تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني هيدروكلوريد (تريس-HCl)، على درجة الحموضة 8.0، التي تحتوي على 10 مم β-ميركابتوثانول، 5 ملم Na2يدتا واسكوربات الصوديوم 0.5% (w/v).
- مزيج من العينة في دوامة خلاط لمدة 2 دقيقة.
ملاحظة: من المهم أن يتم الاحتفاظ العينة على الجليد لمنع تمسخ البروتين.
- مزيج من العينة في دوامة خلاط لمدة 2 دقيقة.
- نقل 500 ميليلتر مختبرين في قنينات المبردة (2 مل) والطرد المركزي العينة في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تخزين العينات في-72 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- قياس تركيز البروتين العينة في 562 نانومتر في جهاز المطياف الضوئي استخدام مقايسة حمض بيسينتشونينيك مع ألبومين المصل البقري كالمعيار.
8. التحليل الأنزيمي للكافيين سينثاز
- إعداد خليط رد فعل في أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على 200 ميكرومتر سام، 4.07 بيكيريل من الميثيل [ح]3[--سام، 200 ميكرومتر الثيوبرومين، 200 ميكرومتر مجكل2، والكافيين 5 ميكرومتر. زيادة الحجم إلى 200 ميليلتر مع 100 ملم تريس-HCl في الرقم الهيدروجيني 8.0.
- الاحتفاظ بالانبوب ميكروسينتريفوجي على الجليد وإضافة وحدة تخزين القابلة للذوبان الكسر التي تحتوي على 7-9 ملغ بروتين. ثم، مزيج من دوامة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية في حمام/مدوار ترموستاتي. لمجموعة من عدة عينات، احتضان كل عينة في التكرارات في فترات 1 دقيقة لإعطاء وقت كاف لوقف ردود الفعل لجميع العينات في فترة وقت المحدد من 30 دقيقة.
- أضف 1 مل كلوروفورم التوقف عن رد فعل وثم هزة العينة مع خلاط دوامة. هزة العينة باستخدام خلاط دوامة لمدة 3 دقائق لإزالة الكافيين المشعة في المذيب.
- الطرد المركزي العينات في س 11,000 ز لمدة 5 دقائق واسترداد وحدة تخزين ميليلتر 900 بعناية. ثم قم بنقل العينات إلى قارورة التﻷلؤ.
- تتبخر كلوروفورم لإتمام جفاف في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية. إضافة 5 مل سائل التﻷلؤ إلى القنينة وخلط العينة.
- تحليل النشاط الإشعاعي تدمج الكافيين في عداد التﻷلؤ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحليل مقتطفات من الكافيين التي تم الحصول عليها عن طريق عملية المعروضة هنا بقياس كثافة TLC بإخضاع العينات للوحة اللوني وفقا للمخطط المبين في الشكل 1. لقياس مستويات الكافيين في مقتطفات الخلية، ومنحني بتركيزات مختلفة من المعايير التجارية لهذا المجمع كان يستخدم (الشكل 2A). وقد تم تحليل نمط امتصاص للكافيين في طيف الضوء المرئي (الأشعة فوق البنفسجية-VIS) استخدام امتصاص أقصى ذروته في 273 شمال البحر الأبيض المتوسط (الشكل 2)، وفصل الذروة الكافيين على صفيحة TLC أظهر الترددات اللاسلكية بين 0.34 و 0.39 (الشكل 2).
وأشارت إلى نشاط synthase الكافيين تقييمها باستخدام هذا البروتوكول نشاط معين لهذا الإنزيم بكات 1.2 (الجدول 1). وكان نشاط هذا الإنزيم مشابهة للتي ذكرت بالكتاب الآخرين الذين استخدموا البروتين المنقي.
كانت الخطوة الأولى قبل تقييم التعبير الجيني CCS1 عزل الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية. وتم تقييم نوعية مستخرج من الجيش الملكي النيبالي إجمالي المستمدة من تعليق خلية، وتجلى فصل مفارز الرنا الريباسي 28S و 18S 5S، مما يشير إلى أن الجيش الملكي النيبالي المستخرجة من عينات ذات جودة عالية (الشكل 3A). بيد أن هذه المقتطفات الجيش الملكي النيبالي أن تعامل مع إنزيم الدناز إزالة التلوث من الحمض النووي الجينوم (الشكل 3B)، التي تتعارض مع إعداد كدنا. وفي وقت لاحق، أجرى qPCR باستخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، ونتيجة لذوبان المنحنى أظهر منتج واحد تضخيم للجينات synthase الكافيين (الشكل 4).
رقم 1. مخطط المستخدم لتطبيق الكافيين استخراج العينات على صفيحة TLC. ويبين المخطط بعدا صفيحة السليكا (6 x 10 سم) التي تستخدم لتطبيق عينات يصل إلى ثمانية بما في ذلك معايير أو مقتطفات من الكافيين. النظر لمسافة 1 سم بين العينات في صفيحة TLC للحصول على أفضل قرار بفصل الفرقة الكافيين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. الكشف عن الكافيين من TLC-قياس كثافة في الخلية ومقتطفات من آرابيكا C. L. (أ) فصل مختلف تركيزات الكافيين القياسية (لين 1، 0.4؛ 2، 0.6؛ 3، 0.8؛ 4، 1، 5، 1، 2؛ و 6، 1.4 ميكروغرام) وفصل ذروتها في الصورة على اليمين. (ب) استخراج أنماط امتصاص الكافيين القياسي (خط أرجواني) والكافيين (الخط الأخضر) عند أطوال موجية مختلفة باستخدام أطياف امتصاص (الأشعة فوق البنفسجية والمرئية). (ج) استخراج ذروة فصل الكافيين في الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. استخراج من الجيش الملكي النيبالي إجمالي- تم تحليل الحمض النووي الريبي مقتطفات من المعلقات الخلوية من آرابيكا C. L. بالتفريد. (A) استخراج الحمض النووي الريبي، (التكرارات حارات 1-2)؛ (ب) عينات الحمض النووي الريبي تعرض للمعاملة مع الدناز. وأعدت 1% [اغروس] المواد الهلامية والملون مع 3 × إينتيركالاتينج الحل وصمة عار الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. انصهار منحنى المنتجة باستخدام البرمجيات قبكر وبيانات RT-قبكر- المنحنى باللون الأحمر هو منتج واحد تضخيم يتوافق مع الجين synthase الكافيين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مصنع | استخراج البروتين | نشاط محدد CS | مرجع |
| كوفا | |||
| تعليق خلية | النفط الخام | بكات 1.2 | هذا البروتوكول |
| السويداء | تنقية | بكات 5.7 | 12 |
| الشاي | |||
| أوراق | تنقية | بكات 11 | 13 |
| غرنا | |||
| بذور | تنقية | فكة 20 | 14 |
الجدول 1. مقارنة النشاط الخاصة بخدمات العملاء في المحاصيل المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن الحاضرين هنا الظروف المثلى لتقييم محتوى الكافيين، CS مستويات النشاط ومحاضر في في المختبر النباتية زراعة الأنسجة، مثل تعليق خلية من آرابيكا جيم. التقارير السابقة قد أكد أن الحفاظ على الخلايا تحت إشعاع الضوء وحضور الثيوبرومين في الأجلين المتوسط وثقافة المعايير المناسبة لزيادة مستوى الكافيين، مما يجعل من الممكن لتقييم طرق فصل الكافيين استخدام المرحلة عكس عالية الأداء اللوني السائل (RP-[هبلك]). حاليا، هناك عدد قليل من التقارير التي تستخدم أسلوب بسيط وسريع مع المزايا الاقتصادية لدراسة التركيب الحيوي الكافيين في تعليق خلية. هنا، أظهر تقييم بديلة طريقة فصل لاستخدام TLC-قياس كثافة، وتتسم بالكفاءة للتحليل الكمي للكافيين في الخلية مقتطفات من الكافيين. تقييم الكافيين في الخلايا، لم يكن من الضروري لتغذية الثيوبرومين بخلايا الثقافة كما ذكرت سابقا14،15.
وقد تم تقييم نشاط synthase الكافيين في الأنسجة النباتية عدة، بما في ذلك السويداء، والأوراق والبذور. في هذه الدراسات، تشمل أساليب لتحديد نشاط synthase الكافيين خطوة لتنقية البروتين الجزئية التي اقترح أنه من الضروري استخدام ال16،إنزيم المنقي17. وهنا، أجرينا بروتوكولا أمثل لدراسة النشاط الأنزيمي CS باستخدام خلاصة بروتين لذوبان دون الحاجة إلى اتخاذ خطوات تشمل تنقية البروتين. يمكن قياس النشاط CS في استخراج النفط الخام من تعليق خلية في وحدات بكات، كما أبلغت عن مؤلفين آخرين. نحن تقييم مستويات الكافيين والنشاط الأنزيمي في أوراق، ولديهم مستويات مماثلة لتلك الموجودة في الثقافة في المختبر .
وأخيراً، على الرغم من أن المؤلفين السابقين درسوا التعبير عن synthase الكافيين، عدة استخدمت زراعة الأنسجة المتباينة6،18. المنهجية المقدمة هنا مفيدة للحصول على الحمض النووي الريبي استخراج وتقييم مستويات تعبير الجينات CCS1 طريق الرايت قبكر في نماذج مختلفة في المختبر لتعليق الخلية النباتية، مثل الشاي والكاكاو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أعمال مختبرنا بتمويل من منحة من ذ Consejo ناسيونال دي العلوم التكنولوجيا (مبرزين 219893) إلى سمثس. وأيد هذه البحوث أيضا على زمالة منحته مبرزين والنظام ناسيونال دي إينفيستيجادوريس (4422) إلى رجبك (رقم 37938). يشكر المؤلفون سيتي لاستخدام منشآتها أثناء كتابة هذه المخطوطة. يتم توسيع شكر خاص إلى الدكتور فيكتور مانويل غونزاليس مندوزا لجميع التوصيات في قسم البيولوجيا الجزيئية وفالنتين مندوزا رودريغيز، والمؤسسة المالية الدولية، وجامعة المكسيك الوطنية المستقلة للمرافق أثناء تصوير هذه المادة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
