Summary
Ce protocole décrit une méthodologie efficace pour l’extraction et le dosage de la caféine dans des suspensions cellulaires de c. arabica L. et un processus d’expérimentation pour l’évaluation de l’activité enzymatique de synthase de caféine avec le niveau d’expression de le gène codant pour cette enzyme.
Abstract
Caféine (1,3,7-trimethylxanthine) est un alcaloïde de la purine présent dans les boissons populaires tels que le café et le thé. Ce métabolite secondaire est considéré comme un moyen de défense chimique, car il a une activité antimicrobienne et est considéré comme un insecticide naturel. Caféine peut également produire des effets allélopathiques négatifs qui empêchent la croissance des plantes environnantes. En outre, les gens partout dans le monde consomment caféine pour ses effets analgésiques et stimulants. En raison de l’intérêt pour les applications technologiques de la caféine, recherches sur la voie de biosynthèse de ce composé a augmenté. Ces études ont principalement porté sur la compréhension des mécanismes biochimiques et moléculaires qui régulent la biosynthèse de la caféine. Culture de tissus in vitro est devenu un système utile pour l’étude de cette voie de biosynthèse. Cet article décrit un protocole étape par étape pour la quantification de la caféine et de mesure des niveaux de transcription du gène (CCS1) codant synthase (CS) de la caféine dans des suspensions de cellules de c. arabica L. en plus de son activité.
Introduction
La caféine est un métabolite secondaire qui est biosynthétisée à partir de plantes du genre Coffea1. Cet alcaloïde appartient à la famille des méthylxanthines et est considéré comme une défense de l’usine de produits chimiques car il peut agir contre les effets néfastes des pathogènes et des herbivores,2,3. En outre, ce métabolite est responsable des propriétés stimulantes de la boisson de café, qui est couramment consommée dans le monde entier4,,5. En raison de ses propriétés, sont intéressés par plusieurs groupes de recherche étudie la voie de biosynthèse et de catabolisme de caféine6,7. Actuellement, des cultures de plantes in vitro cellules/tissus servent d’alternative pour évaluer l’accumulation de la caféine sous diverses stratégies biotiques et abiotiques8,9.
Biosynthèse de caféine implique la libération hydrolytique des 7-méthylxanthine de nucléoside ribose correspondante suivie d’ordonnée N-méthylations aux positions 3 et 1. Une spécifique S- adénosyl méthionine (SAM)-charge N-méthyltransférase (NMT) catalyse la méthylation en position 7, tandis que théobromine synthase (TS) et CS sont impliqués dans la 3 - et 1-méthylations, respectivement, produisant la théobromine et caféine. L’étude des gènes codant pour les territoires non métropolitains distincts a permis de comprendre le mécanisme qui régule la production de caféine10,11. CS, qui possède l’activité N -méthyltransférase, catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse de la caféine,11. Chez les plantules de caféier, il a été démontré que le rayonnement lumineux peut augmenter l’activité CS, qui se traduit par une augmentation dans la biosynthèse de la caféine. Récemment, nous avons montré que l’entretien des suspensions cellulaires de c. arabica L. sous irradiation lumineuse est la condition optimale pour évaluer les effets que produisent des facteurs de stress abiotique ayant une incidence sur la voie de biosynthèse de caféine8. Les renseignements obtenus dans ces études pourraient avoir des applications en biologie de systèmes et génie métabolique pour maximiser l’étude de la biosynthèse de la caféine dans de tels systèmes in vitro .
Étant donné les avantages d’obtenir un modèle approprié pour l’étude de la biosynthèse de la caféine, nous avons optimisé les conditions d’extraction de la caféine sur des suspensions cellulaires c. arabica L. Il était également possible d’élaborer un protocole utile pour l’étude de l’activité enzymatique, mais aussi les étapes méthodologiques permettant d’évaluer le niveau de transcription des gènes de Coffea caféine synthase 1 (CCS1) codant pour cette enzyme. Ici, nous présentons un protocole pour extraire et quantifier la caféine dans les suspensions de cellules de c. arabica par chromatographie sur couche mince et densitométrie (TLC-densitométrie).
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Protocol
1. caféine Extraction dans des Suspensions cellulaires c. arabica L.
- Utiliser c. arabica cellule suspensions9. Maintenir les suspensions de sous-cultures toutes les deux semaines dans le milieu de Murashige et Skoog à pH 4,3 avec constant 100 tr/min secouant à 25 ° C sous une lumière continue (8,3 W/m2).
- Récolter les cellules sous la filtration sous vide à l’aide de papier-filtre pore de 11 µm et d’un entonnoir de Buchner.
- Enregistrer le poids frais des cellules recueillies à l’aide d’une échelle, enveloppez-les dans du papier d’aluminium, congelez-les dans l’azote liquide et gardez-les à-80 ° C jusqu'à l’analyse.
- Lyophiliser le matériel cellulaire congelé pendant 72 h.
- S’inscrire à la masse des cellules lyophilisées afin d’estimer le rendement en poids sec.
- Stocker les matériaux en poudre dans des sacs de polyéthylène réutilisables (9 cm x 7,5 cm). Faire macérer le matériau à une poudre fine et un magasin dans un dessicateur jusqu'à utilisation.
- Mesurer 0,5 g de matière sèche de cellulaire sur la balance analytique et l’ajouter à une fiole de verre (25 mL).
- Ajouter 10 mL d’acétone aux cellules lyophilisées et mélanger dans un vortex pour 30 s pour l’homogénéisation. Puis, scellez la fiole avec du papier aluminium.
- Mélanger à 100 tr/min à l’aide d’un agitateur à température ambiante (25 ° C) pendant 5 h.
- Transférer tout le matériel dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min. transférer le liquide de phase dans un nouveau tube et ramènent à elle séchage à température ambiante dans la hotte.
- Remettre en suspension l’échantillon avec 25 µL d’acétone.
2. conditions pour l’évaluation de la caféine par la mince couche de chromatographie (TLC)-densitométrie
- Appliquer 1 µL de l’extrait de caféine préalablement remises en suspension à la phase stationnaire.
Remarque : les plaques de gel de silice (F254) sont utilisés comme la phase stationnaire. Avant d’appliquer les échantillons, les plaques ont été développés avec 10 mL de chloroforme-méthanol [9:1 v/v] dans une chambre de chromatographie (14 x 12 cm x 9,5 cm), et les plaques ont été séchés à température ambiante. Les caractéristiques de la plaque chromatographique où les échantillons sont appliquées sont indiquées à la Figure 1. La chambre était saturée pendant 30 min avec du solvant avant d’élaborer la plaque. Plaques de CCM doivent manipuler avec des gants pour éviter la contamination. - Développer le TLC dans la chambre de chromatographie avec 10 mL de la phase mobile cyclohexane-acétone [40:50 v/v].
Remarque : Ce mélange permet la séparation de la caféine à un facteur de rétention (Rf) de 0,34.- Retirez la plaque TLC de la chambre et laisser sécher à température ambiante.
- Visualiser les bandes de caféine dans l’ultraviolet de courte longueur d’onde (UV, 254 nm). Utiliser une lampe UV compacte. En outre, pour cette étape, utilisation des lunettes avec protection UV.
- Quantifier les niveaux de caféine par densitométrie à 273 nm. L’instrument est muni d’un logiciel de chromatographie.
3. l’acide ribonucléique (ARN) Isolation
- Prendre les suspensions cellulaires à l’étape 1.1 et vide filtrat avec filtre en papier (taille des pores 11 µm).
- Rassemble le matériel cellulaire du papier filtre, peser 0,5 g du matériel cellulaire sur une balance analytique et l’emballer dans du papier d’aluminium. Congeler l’échantillon liquide N2.
- Broyer l’échantillon cellulaire dans un mortier en porcelaine avec de l’azote liquide et ajouter 1 mL de réactif d’isolement ARN jusqu'à homogénéisé.
Remarque : Stériliser les mortiers de porcelaine dans un four à moufle à 300 ° C pour 6 h. RNA isolation réactif contient phénol, l’isothiocyanate de guanidine et autres composants.- Transférer 500 µL de l’échantillon dans un tube stérile microcentrifuge (1,5 mL). Ajouter 300 µL de chloroforme-isoamylique alcool (24:1) et 300 μl du mélange phénol (pH 8,0).
- Mélanger l’échantillon avec un vortex et centrifuger à 20 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Transférer 300 μL de la phase supérieure dans un tube de microcentrifuge. Ajouter 200 μL d’isopropanol. Incuber le tube pendant 1 h à-20 ° C.
- Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et décanter ensuite la phase liquide.
- Ajouter 1 mL d’éthanol (70 %) pour former une boulette dans le tube. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min et décanter. Répéter cette étape deux fois.
- Sécher l’échantillon pendant 1,5 h à température ambiante (25 ° C). Remettre en suspension l’extrait de RNA avec 25 μL de diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-l’eau traitée.
Remarque : Pour l’extraction de l’ARN, utiliser l’eau traitée DEPC 0,1 % v/v.
4. incubation de transcription de l’ARN avec désoxyribonucléase (DNase)
- Dans un tube de microcentrifuge stérile, ajouter l’extrait de 2 µg d’ARN total. Ajouter 1 μL de tampon de réaction 10 x (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Ajouter 1 μL de 1 U/µL DNase.
- Apporter la réaction pour un volume final de 10 μL, avec l’eau traitée DEPC. Mélanger l’échantillon et centrifuger brièvement à 2 000 x g pendant 1 min.
- Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min.
- Arrêter la réaction avec l’ajout de 1 μL de 50 mM disodique dihydraté de tétrasodium (Na2EDTA) et incuber l’échantillon à 65 ° C pendant 10 min.
- Analyser l’intégrité de l’ARN par électrophorèse sur gel d’agarose.
- Préparer un gel d’agarose à 1 % standard et souiller avec 1 µL de 3 x intercalant solution tache acide nucléique.
- Appliquer 500 ng d’ARN de l’agarose gel et exécutez le gel.
- Visualiser l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un système de documentation de photo de gel.
- Utiliser RNA comme modèle pour la synthèse de cDNA de la transcriptase inverse.
5. complémentaire (ADNc) synthèse d’acide désoxyribonucléique
- Ajouter 2,5 μg d’ARN total dans un tube de microcentrifuge. Ajouter 1 μL de primer oligo-deoxythymine (dT) et remplissez le tube pour un volume final de 13 μL d’eau exempte de nucléase. Mélanger l’échantillon et puis centrifuger un 2 000 x g pendant 1 min.
- Incuber les échantillons à 65 ° C pendant 5 min, puis à 4 ° C pendant 2 min.
- Ajouter 4 μL de 5 x tampon de réaction pour la transcriptase inverse, 2 μl du mélange de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs) (10 mM de chaque dNTP) et 1 μL de la transcriptase inverse (200 U/µL). Mélanger doucement et centrifuger à 2 000 g pendant 1 min.
- Incuber les échantillons à 45 ° C pendant 50 min, puis à 70 ° C pendant 10 min.
- Quantifier la cDNA concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV.
- Utiliser l’ADNc comme modèle pour la réaction en chaîne par polymérase (PCR).
Remarque : Le tampon de réaction a été utilisé comme 10 x (étape 4.1.1) et 5 x fois concentrée (étape 5.3), respectivement.
6. Real-time PCR Quantitative (qPCR) pour amplifier le gène CCS1
- Ajouter 7,5 μL de Taq DNA polymérase 2 x (0,1 U/mL) et 0,1 μM de 5-carboxy-X-rhodamine (ROX) dans un tube de microtubes PCR.
Remarque : Le démarrage à chaud Taq DNA polymérase 2 x a été utilisé comme une solution 2 x concentré.- Ajouter 5 μl d’eau exempte de nucléase.
- Ajouter 0.75 μL de 10 μM et inverses l’apprêt pour amplifier le gène CCS1 (AB086414) (vers l’avant : 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' et vers l’arrière : 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Utiliser les amorces de tubuline que le gène de ménager dans une réaction séparée (vers l’avant : 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' et vers l’arrière : 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
- Ajouter 600 ng de matrice d’ADNc.
- Effectuer la réaction d’amplification à 50 ° C pour 2 min et 95 ° C pendant 5 min. Incuber dans le système PCR en temps réel la réaction 40 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s.
- Incuber les échantillons à 50 ° C pour 30 s à 20 ° C pendant 10 s.
- Analyser les données avec le logiciel PCR.
- Calculer l’expression relative de la 2-ΔΔCT méthode décrite par Livak et Schmittgen (2001)12.
Remarque : Analyser une réaction du contrôle qui contient tous les composants sauf la matrice d’ADN (aucun contrôle de modèle, NTC) aux rejets contaminés réactifs ou amplification amorce-dimères.
7. total extrait de protéines de Suspensions cellulaires c. arabica L.
- Filtre des suspensions cellulaires sous vide avec un filtre en papier moyen-pore.
- Peser 1 g de matière cellulaire et l’emballer dans du papier d’aluminium.
- Congeler l’échantillon avec de l’azote liquide. Broyer l’échantillon dans un mortier de porcelaine stérilisé pour obtenir une poudre fine.
- Transférer l’échantillon dans un flacon en verre et ajouter 2,5 mL de tampon d’extraction (400 mM tris (hydroxyméthyl) aminométhane chlorhydrate (Tris-HCl), à pH 8,0, contenant 10 mM β-mercaptoéthanol, 5 mM Na2EDTA et ascorbate de sodium 0,5 % (p/v).
- Mélanger l’échantillon dans un Vortex pendant 2 min.
Remarque : Il est important que l’échantillon est conservé sur la glace pour éviter la dénaturation de la protéine.
- Mélanger l’échantillon dans un Vortex pendant 2 min.
- Centrifuger l’échantillon à 20 000 x g pendant 20 min à 4 ° C et transférer 500 µL d’extraits dans des flacons cryogéniques (2 mL). Conserver les échantillons à-72 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Mesurer la concentration de protéines de l’échantillon à 562 nm dans un spectrophotomètre à l’aide de dosage acide bicinchoninic avec l’albumine sérique bovine comme la norme.
8. Test enzymatique pour le Synthase de caféine
- Préparer un mélange réactionnel dans un tube de microcentrifuge contenant 200 µM SAM, 4,07 kBq de méthyle [3H]-SAM, 200 théobromine µM, 200 µM MgCl2et caféine 5 µM. Augmentez le volume à 200 µL avec 100 mM Tris-HCl à un pH de 8,0.
- Maintenir le tube de microcentrifuge sur la glace et ajouter un volume de la fraction soluble contenant 7-9 mg de protéine. Ensuite, mélanger en vortex et incuber 30 min à 30 ° C dans un bain thermostatique/circulateur. Pour un lot de plusieurs échantillons, incuber chaque échantillon en double dans les périodes de 1 min pour donner assez de temps pour arrêter les réactions de tous les échantillons dans un laps de temps exact de 30 min.
- Ajouter 1 mL de chloroforme pour arrêter la réaction et puis agiter l’échantillon avec un vortex. Agiter l’échantillon à l’aide d’un Vortex pendant 3 min pour éliminer la caféine radioactif dans le solvant.
- Centrifuger les échantillons à 11 000 x g pendant 5 min et soigneusement restaurer un volume de 900 µL. Ensuite, transférer les échantillons pour les flacons scintillation.
- Évaporer le chloroforme jusqu'à siccité dans le capot à la température ambiante de 25 ° C. Ajouter 5 mL de scintillation liquide dans le flacon et mélanger l’échantillon.
- Analyser la radioactivité incorporée dans la caféine dans un compteur à scintillation.
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Representative Results
Les extraits de caféine obtenus via le processus présenté ici ont été analysés par TLC-densitométrie en soumettant les échantillons pour la plaque de chromatographie selon le schéma illustré à la Figure 1. Pour quantifier les niveaux de caféine dans les extraits de cellules, une courbe avec différentes concentrations de norme commerciale pour ce composé a été utilisé (Figure 2 a). Le modèle de l’absorbance pour la caféine a été analysé dans le spectre de lumière visible (UV-VIS) à l’aide d’un pic d’absorption maximale à 273 nm (Figure 2 b) et la séparation de la crête de la caféine sur la plaque de TLC a montré un Rf entre 0,34 et 0,39 (Figure 2).
L’activité de la synthétase de caféine évaluée à l’aide de ce protocole indique une activité spécifique pour cette enzyme de 1,2 pkat (tableau 1). L’activité de cette enzyme a été similaire à celle rapportée par d’autres auteurs qui ont utilisé la protéine purifiée.
La première étape avant d’évaluer l’expression du gène CCS1 était l’isolement du RNA de haute qualité. La qualité de l’extrait de l’ARN total provenant de suspensions cellulaires a été évaluée, et la séparation des sous-unités d’ARNr 28 s, 18 s et 5 s a été démontrée, ce qui indique que l’ARN extrait d’échantillons a été de grande qualité (Figure 3 a). Toutefois, ces extraits de RNA devaient être traitée avec enzymatique DNase pour éliminer la contamination d’ADN génomique (Figure 3 b), qui interfère avec la préparation de l’ADNc. Par la suite, qPCR a été réalisée en utilisant le protocole décrit ci-dessus et le résultat de la courbe de fusion a montré un produit d’amplification unique pour le gène de la caféine synthase (Figure 4).
Figure 1. Extrait de schéma utilisé pour l’application de la caféine des échantillons sur une plaque de TLC. Le schéma montre une dimension plaque de silice (6 x 10 cm) qui sert à appliquer jusqu'à huit échantillons, y compris des extraits de caféine ou des normes. Considérons une distance de 1 cm entre les échantillons dans la plaque de TLC pour obtenir la meilleure résolution de la séparation de bande de caféine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Détection de la caféine par TLC-densitométrie dans cellule extraits c. arabica L. (A) la séparation des diverses concentrations standard de caféine (piste 1, 0,4 ; 2, 0,6 ; 3, 0,8 ; 4, 1 ; 5, 6 et de 1,2 ; 1,4 µg) et la séparation de leurs sommets de l’image sur la droite. (B) patrons d’absorbance d’un standard de caféine (ligne violette) et de la caféine extrait (ligne verte) à différentes longueurs d’onde à l’aide de spectres d’absorption (ultraviolets et visibles). (C) extrait de séparation le pic de caféine dans la cellule. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Extraction de l’ARN total. Les extraits de RNA des suspensions cellulaires c. arabica L. ont été analysés par électrophorèse. (A) extraction de l’ARN, (en double voies 1-2) ; (B) les échantillons d’ARN soumis à un traitement à la DNase. gels d’agarose de 1 % ont été préparés et colorés avec 3 x intercalant solution tache acide nucléique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Courbe de fusion produite à l’aide de logiciels de qPCR et RT-qPCR données. La courbe en rouge est un produit amplifié unique correspondant au gène de la synthase de caféine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Plante | Extrait de protéine | Activité spécifique de CS | Référence |
| Coffea | |||
| Suspension cellulaire | Pétrole brut | pkat 1,2 | Ce protocole |
| Endosperme | Purifiée | pkat 5,7 | 12 |
| Thé | |||
| Feuilles | Purifiée | pkat 11 | 13 |
| Guarana | |||
| Graines | Purifiée | fkat 20 | 14 |
Le tableau 1. Comparaison de l’activité CS spécifiques dans différentes cultures.
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Discussion
Nous présentons ici les conditions optimales permettant d’évaluer la contenu de caféine, niveaux d’activité et de transcription CS dans in vitro plant tissue culture, tels que des suspensions de cellules de c. arabica. Précédents rapports ont confirmé que les cellules maintien sous irradiation lumineuse et en présence de théobromine dans le milieu de culture sont les paramètres appropriés pour augmenter le niveau de caféine, ce qui permet d’évaluer les méthodes de séparation de caféine en utilisant la chromatographie liquide à haute performance phase inverse (CLHP-PI). Actuellement, il y a peu de rapports qui utilisent une méthode simple et rapide avec des avantages économiques pour l’étude de la biosynthèse de caféine dans les suspensions cellulaires. Ici, une autre évaluation a montré une méthode de séparation pour la caféine à l’aide de TLC-densitométrie, qui est efficace pour l’analyse quantitative de la caféine dans des extraits cellulaires. Pour évaluer la caféine dans les cellules, il n’était pas nécessaire alimenter les cellules en culture, tel que rapporté précédemment14,15théobromine.
Activité de synthase de caféine a été évaluée dans plusieurs tissus de la plante, y compris l’endosperme, les feuilles et les graines. Dans ces études, les méthodes pour la détermination de l’activité de caféine synthase incluent une étape de purification de protéine partielle qui a suggéré qu’il était nécessaire d’utiliser l’enzyme purifiée16,17. Ici, nous avons réalisé un protocole optimal pour l’étude de l’activité enzymatique de CS en utilisant un extrait de protéines solubles sans le besoin d’étapes impliquant la purification de la protéine. Activité de CS dans l’extrait brut de suspensions cellulaires peut être mesurée en unités de pkat, comme d’autres auteurs ont rapporté. Nous avons évalué les niveaux de caféine et de l’activité enzymatique dans les feuilles, et ils ont des niveaux similaires à ceux de la culture in vitro .
Enfin, bien que les auteurs précédents ont étudié l’expression de la caféine synthase, plusieurs ont utilisé différenciée des vitroplants6,18. La méthodologie présentée ici est utile pour obtenir un ARN extrait et d’évaluer les niveaux d’expression du gène CCS1 par RT-qPCR dans différents in vitro de modèles de suspensions de cellules végétales, telles que le thé et le cacao.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les travaux de notre laboratoire a été financée par une subvention par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) à SMTHS. Aussi, cette recherche a été financée par une bourse de recherche accordée à RJPK (no 37938) par CONACyT et le Sistema Nacional de Investigadores (4422). Les auteurs remercient CIATEJ pour l’utilisation de ses installations pendant l’écriture de ce manuscrit. Spécial remerciements à m. Víctor Manuel González Mendoza pour toutes les recommandations dans la section de biologie moléculaire et Rodríguez Mendoza Valentín, IFC, UNAM pour les installations pendant le tournage de cet article.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
