Summary
Aquí presentamos un nuevo método para medir con precisión las diferencias de temperatura del cuerpo en pasiva Anafilaxia sistémica (PSA) y modelos de ratón de alergia de alimentos utilizando un termómetro infrarrojo. Este procedimiento ha sido duplicado exactamente en resultados anteriores de PSA.
Abstract
Medición de temperatura corporal del ratón es de suma importancia para la investigación de las alergias y síntomas anafilácticos. Sondas rectales para las lecturas de temperatura es común, y se han demostrado para ser exacta y valiosa en este sentido. Sin embargo, este método de medición de la temperatura requiere los ratones anestesiados con el fin de introducir la sonda sin lesión al animal. Esto limita la capacidad de observar otros fenotipos del ratón al mismo tiempo. Para investigar otros fenotipos y medir la temperatura, sondas rectales no son ideales, y se desea otro método. Aquí, presentamos un método no invasivo de medición de la temperatura que renuncia el requisito para la anestesia del ratón manteniendo fiabilidad igual a las sondas rectales en la medición de la temperatura corporal. Usamos un termómetro infrarrojo que detecta la temperatura de la superficie corporal en rangos entre 2 y 150 milímetros. Este método de medición de la temperatura corporal tiene éxito en reproducir confiablemente las tendencias de cambio de temperatura durante los experimentos de anafilaxia pasiva sistema en ratones. Nos muestran que las temperaturas superficiales del cuerpo son aproximadamente 2,0 ° C inferiores a las mediciones de la sonda rectal, pero el grado de caída de temperatura sigue la misma tendencia. Además, utilizamos la misma técnica para observar los ratones en un modelo de alergia alimentaria para evaluar niveles de actividad y la temperatura simultáneamente.
Introduction
Medición de la temperatura corporal ha sido una parte esencial del control de los efectos de los síntomas anafilácticos en animales modelos1,2. Las diferencias de temperatura se han medido tradicionalmente por Termómetros de sonda rectal en ratones3,4. Con estas mediciones, los investigadores han retratado confiablemente las diferencias de temperatura entre las variables; sin embargo, este método es un procedimiento lento y causa señal de socorro a los ratones, que pueden aumentar la temperatura del núcleo corporal. Sondaje rectal también puede causar lagrimeo y la infección mucosa3. Por otra parte, los ratones se deben anestesiar para humanamente Introduzca la sonda rectal para medir la temperatura3. Este es un proceso lento, y prohíbe la medición de las temperaturas sucesivas dentro de un período corto de tiempo. Además, no se puede observar fenotipos de actividad de ratones durante este tiempo hasta que el anestésico se usa totalmente apagado, que es otro proceso desperdiciador de tiempo. Más recientemente, otros métodos confiables para medir la temperatura del cuerpo han utilizado etiquetas transpondedor infrarroja pasiva implantados subcutáneamente o transmisores de radio que incluyen un sensor de temperatura3,5,6. Aunque se aceptan como la práctica ideal por algunos investigadores, estos métodos no son ampliamente utilizados debido a los altos costos iniciales y la angustia a los ratones, debido a la implantación quirúrgica de un sensor de temperatura debajo de la piel u otra parte del cuerpo.
Para demostrar que una diferencia de temperatura es un reflejo exacto de los síntomas en una enfermedad modelo1,2, ratones deben estar despierto durante la medición de la temperatura y poder volver a su normal actividad fenotípica inmediatamente antes y después de la medición. Para ello, se buscó un método por el cual esto se podría conseguir.
Nuestro objetivo era conocer con precisión y a bajo costo la temperatura corporal del ratón, sin necesidad de anestesia y sin restricciones en la actividad, para permitir la observación de fenotipos conductuales durante y después del tiempo de medición de la temperatura. Para lograr este objetivo, era evidente que una técnica menos invasiva que la temperatura rectal estándar se requiere. Los termómetros infrarrojos se han utilizado durante décadas en medicina clínica, especialmente en pediatría, para obtener una lectura precisa de la temperatura. Ha sido un método alternativo que ha permitido a los clínicos en forma rápida y precisa obtener mediciones de temperatura en bebés y niños inquietos que son activamente móviles. Implementado esta misma técnica en ratones y han desarrollado un método exitoso para obtener temperaturas sin anestesia. Lo importante, nos demuestran que este método es capaz de replicar los resultados de Anafilaxia sistémica pasivo bien establecidas con respecto a cambios de temperatura, mientras que también siendo capaces de observar la actividad del ratón a través de la medición. Además, utilizamos el mismo método para evaluar temperaturas corporales de ratones alérgica a los alimentos, mientras al mismo tiempo investigar otros síntomas, para demostrar que la temperatura corporal es un fiel reflejo del nivel de actividad y fenotipo general de la ratón.
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Protocol
Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Comisión de uso del Institute de La Jolla y de Animal Care para Alergia e Inmunología.
1. ratón medición de temperatura corporal durante la anestesia
- Coloque el ratón en una caja de inducción de la anestesia. Anestesiar mediante el uso de flujo de 1 L/min de oxígeno con 5% de isoflurano.
Nota: La anestesia se confirma cuando el ratón deja de movimiento voluntario y ha estado inmóvil por más de 30 s. alternativamente, frecuencia respiratoria de monitor, y una vez ratones son respiración a 1 respiración por cada 2 s o más, se confirma la anestesia. - Mantenga el ratón por la nuca con un dedo índice y el pulgar y mantiene la cola con el dedo meñique para exponer la parte inferior del abdomen.
- Coloque el sensor del termómetro infrarrojo debajo de la parte baja del abdomen manteniendo el ratón con su cuerpo paralelo al suelo.
Nota: La superficie plana exterior del termómetro (no de la superficie del sensor) debe ser aproximadamente de 2 a 5 mm de la superficie del abdomen. Este replicar resultados de temperaturas medición mientras que los ratones no son anestesiados (descrito en la sección 2). Es importante determinar el sitio de destino del abdomen. Con el objetivo entre dos pezones superiores permite resultados consistentes. - Mantenga oprimido el gatillo para medir la temperatura. Asegurar la explotación estable del ratón y termómetro.
2. ratón medición de la temperatura del cuerpo sin anestesia
- Levante el ratón por el centro de la cola.
-
Exponer el abdomen del ratón.
- Permitir que el ratón a una superficie de borde recto, como el labio de una jaula abierta o la tapa de la jaula con sus patas delanteras.
Nota: Esto permite que el ratón estirar la parte superior del cuerpo y exponer el abdomen. - Por otra parte, permite el ratón para mantener el borde derecho superior del termómetro y hacer el ratón sentado sobre la superficie plana exterior del termómetro con su abdomen justo sobre el sensor de infrarrojos.
Nota: Cualquier momento que las patas traseras están descansando en la superficie del termómetro, asegúrese de que los pies no están obstruyendo el sensor de la superficie abdominal. Termómetros con pie obstrucción medirá una temperatura más baja que la del abdomen.
- Permitir que el ratón a una superficie de borde recto, como el labio de una jaula abierta o la tapa de la jaula con sus patas delanteras.
- Mantenga oprimido el gatillo para medir la temperatura.
Nota: Ratones tienden a moverse; Tenga cuidado en el mismo lugar del cuerpo de medición constantemente tomando mediciones de temperatura cuando los ratones son relativamente menos móviles.
3. pasiva Anafilaxia sistémica7
-
Día 0: Sensibilizar con la inmunoglobulina E (IgE).
- Preparar 200 μl (ratón) de IgE anti-dinitrofenilo (DNP) a una concentración de 100 μg/mL en PBS.
- Inyectar por vía intraperitoneal 200 μL de IgE anti-dinitrofenilo (DNP) preparado sólo en paso 3.1.1 o PBS (PBS-sólo es el control negativo). Use una aguja de 26 G para inyección. Realizar las inyecciones justo lateral a la línea media, aproximadamente entre los dos pezones más inferiores.
-
Día 1: Inducir anafilaxia con DNP-HSA.
- Preparar 100 μl (ratón) de DNP-HSA en una concentración de 10 mg/mL en 0.9% NaCl.
- Anestesiar los ratones como se describe en el paso 1.1.
- Medir la temperatura del cuerpo mediante la técnica descrita en el paso 1.
- Por vía intravenosa inyectar 100 μl de DNP-HSA preparado en el paso 3.2.1. Utilice una aguja de 30 G para la inyección. Realizar las inyecciones en el seno venoso retroorbital. Inserte la aguja en el lado medial del ojo en un ángulo bajo, con el objetivo de detrás del ojo.
- Después de la inyección, coloque los ratones en jaulas individuales. Asegúrese de que los ratones se recuperan de la anestesia. Observar que despertar y ser voluntariamente móviles.
- Medir la temperatura del cuerpo con el termómetro infrarrojo y observar su actividad cada 10 min durante 70 minutos.
4. ratón modelo de alimentos alergia8,9
Nota: El diagrama esquemático se muestra en la figura 2.
-
Día 0: Sensibilizar a los ratones con OVA/alum.
- Preparar 100 μl (ratón) de huevos (0.5 mg/mL) y alumbre (10 mg/mL) en PBS. Vórtice en el ajuste bajo durante 30 minutos.
- Anestesiar los ratones como se describe en el paso 1.1.
- Utilizando una aguja de 26 G, inyectar por vía intraperitoneal cada ratón con 100 μl de la mezcla de óvulos/alumbre preparada en el paso 4.1.1.
Nota: Vórtice la mezcla de óvulos/alumbre una vez más, brevemente antes de cada inyección, para mejor asegurar una mezcla homogeneizada. Ver paso 3.1.3 para más detalles en el sitio de inyección. - Después de la inyección, coloque ratones en sus jaulas originales. Asegúrese de que los ratones se recuperan de la anestesia. Observar que despertar y ser voluntariamente móviles.
-
Día 14: Realizar una sensibilización segundo con OVA/alum.
- Repita los pasos 4.1.1, 4.1.2 y 4.1.3.
-
Días 28-46: desafiar a los ratones con óvulos cada dos días.
- Preparar 100 μl (ratón) de óvulos en una concentración de 250 mg/mL en PBS.
Nota: La mezcla debe hacerse meciendo suavemente hacia adelante y hacia atrás con la mano en lugar de con un vórtex para minimizar la formación de burbujas.- Si está usando inhibidores de alergia alimentaria, preparar los inhibidores de la9. Preparar 100 μl (ratón) de inhibidor a una concentración de 1 mg/mL en PBS. Esto permite una entrega de 100 μg de inhibidor para cada ratón.
Nota: No exceda 100 μl de inhibidor por ratón, ya que los ratones sólo son capaces de manejar 200 μL de volumen total por sonda nasogástrica durante el día uno de los desafíos. Como necesario para afrontar el reto de óvulos también 100 μl, 100 μl es el máximo recomendado el volumen para el uso del inhibidor.
- Si está usando inhibidores de alergia alimentaria, preparar los inhibidores de la9. Preparar 100 μl (ratón) de inhibidor a una concentración de 1 mg/mL en PBS. Esto permite una entrega de 100 μg de inhibidor para cada ratón.
- Anestesiar los ratones como se describe en el paso 1.1.
- Por vía oral por sonda nasogástrica cada ratón con 100 μl de la solución de OVA (25 mg de OVA en 100 μl de PBS gavaged por ratón) que se preparó en el paso 4.3.1.
- Si está usando inhibidores de, utilizar las mismas técnicas que se describen en los siguientes pasos para la sonda de inhibidor (o control de PBS) preparado en el paso 4.3.1.1 30 minutos antes el desafío de la OVA. Después de 30 min, pasemos al siguiente paso.
- Utilice una aguja de la sonda con una jeringa de 1 mL. Tomar 100 μl de óvulos en la jeringa.
- Inserte la aguja en la boca; Luego, señalando la aguja hacia la izquierda o derecha de la garganta, deslice suavemente la aguja a través del esófago. Inyectar 100 μl de OVA.
Nota: Para asegurarse de que la aguja no está en la tráquea, observar activo de respiración antes de inyectar los óvulos. La inserción de la aguja también se resistió temprano si ha entrado en la tráquea en lugar de esófago.
- Coloque el ratón en sus jaulas individuales. Para la observación fácil de la calidad de la materia fecal, uso de jaulas sin ropa de cama.
- Garantizar la recuperación de la anestesia. Observar que los ratones despertaran y voluntariamente móviles.
- Medir la temperatura corporal de los ratones en los puntos de tiempo 10, 20, 40 y 60 min utilizando la técnica descrita en la sección 2.
- Preparar 100 μl (ratón) de óvulos en una concentración de 250 mg/mL en PBS.
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Representative Results
Anafilaxia sistémica pasiva: para inyección iv, 10 semanas viejo mujer ratones BALB/c fueron anestesiados. Antes de la inyección, medimos su temperatura del cuerpo (Video 1) como se describe en el paso 1. La figura 1 muestra la tendencia de la temperatura de ambas poblaciones después de la inyección iv. El ratón sensibilizados por IgE demostró una disminución de la temperatura máxima de 3,0 ° C en 20 min, mientras que el ratón de control PBS tenía una caída máxima de 1,1 ° C en 20 min7. Además, durante todo este proceso, se evaluaron puntuaciones de actividad basado en la movilidad de cada ratón. Ratones se observaron primero sin ninguna agitación. Entonces, se observaron con agitación introduciendo mano del evaluador en la jaula y haciendo contacto suave con el ratón. Basado en sus reacciones, los ratones se evalúan y se anotó en una escala de 1 a 3. Una puntuación de 1 indica un ratón que es inmóvil o móvil mínimamente con y sin agitación; una puntuación de 2 indica un ratón que es inmóvil sin agitación y con agitación sin hacer movimientos evasivos rápidos; y una puntuación de 3 indica un ratón que es móvil o inmóvil sin agitación y con agitación y hace movimientos rápidos evasivos. Videos 2 y 3 son ejemplos de los dos grupos que son un ejemplo de los métodos de medición de temperatura, así como las correspondientes mediciones de nivel de actividad. Uso del termómetro infrarrojo para medir la temperatura sin anestesia, que a su vez para la evaluación del fenotipo de comportamiento antes, durante y después de la medición de la temperatura; en cambio, una sonda rectal tradicional requiere anestesia y por lo tanto, excluye cualquier evaluación conductual dentro de varios minutos alrededor de las mediciones de temperatura.
Modelo murino de alergia de alimentos8: el esquema del modelo de ratón se muestra en la figura 2. Los ratones son ratones BALB/c mujeres de las edades de 8 a 10 semanas de edad en el momento de la sensibilización. Ratones se observaron en 10, 20, 40 y 60 min después de cada desafío de la temperatura corporal y actividad. Un resultado representativo se muestra en la figura 3 el cambio de temperatura durante el reto 7. Los ratones mostraron una disminución de temperatura máxima en 10 minutos; por lo tanto, las temperaturas de 10 min fueron utilizadas para correlacionar con las temperaturas del cuerpo en los niveles de actividad de 10 minutos (con puntaje según los criterios representados por encima). Temperatura y actividad puntuación caída mostró una correlación estadísticamente significativa (figura 4). Como se mencionó en la sección de pasivo Anafilaxia sistémica, se realizaron observaciones conductuales debido a la falta de anestesia, y se utilizó el termómetro infrarrojo. Por el contrario, sondas rectales prevenir cualquier comportamiento observaciones o evaluaciones durante el tiempo de medición de la temperatura. Cualquier momento que la temperatura y otra actividad se registrarán los fenotipos, es esencial utilizar un sistema de medición de temperatura que no requiere anestesia.
Figura 1 : Anafilaxis sistémica pasiva en ratones BALB/c. Dos ratones fueron inyectado con IgE anti-DNP en el día 0 de ip, entonces iv inyectado con solución salina normal o DNP-HSA el día 1. Temperatura corporal fue medida utilizando un termómetro infrarrojo antes de la inyección y cada 10 minutos después de la inyección durante 70 minutos haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Esquema de modelo de ratón de alergia de alimentos. En el día 0, ratones BALB/c fueron sensibilizada ip con óvulos y alumbre y nuevamente el día 14. En el día 28, 30 min antes de cada desafío, los ratones fueron gavaged por vía oral con un inhibidor de la alergia del alimento (factor liberador de histamina HRF-2CArecombinant con sus dos cisteínas intercambiada con alanines) o control de PBS9. Ratones fueron desafiados luego ig con 25 mg de OVA. Desafíos se realizaron cada dos días para los 9 desafíos. Ratones se observaron para la medición de la temperatura corporal y la actividad anotando en 10, 20, 40 y 60 min después del desafío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Modelo de alergia alimentaria en ratones BALB/c. Temperatura cambiar después el 7 º reto de óvulos fue supervisado por termómetro infrarrojo. Se muestran los resultados típicos de al menos cuatro experimentos independientes (**, p < 0.01 entre PBS y 2CA tratamientos de prueba t de Student; ns: no significativo). Barras de error = SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Correlación entre la actividad y la temperatura a 10 min en experimentos de alergia alimentos. Los resultados reflejan las mediciones de 4 conjuntos separados de experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: medición de la temperatura del cuerpo mientras que los ratones son anestesiados. Mediciones de temperatura de cuerpo de ratones pueden tomarse con o sin anestesia. Para obtener mediciones consistentes, es esencial apuntar siempre el termómetro en el mismo lugar del cuerpo. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 2: nivel de actividad en 40 min después de la inyección iv de DNP-HSA. Ratones se observan sin agitación inicialmente, luego con agitación. Basado en sus reacciones, los ratones fueron evaluados y anotó en una escala de actividad de 1 a 3. El ratón a la izquierda (ratón sensibilizado de anti-DNP) se da una puntuación de 1, mientras que el ratón a la derecha (PBS control de ratón) se da una puntuación de 3. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 3: medición de la temperatura en 40 min después de la inyección iv de DNP-HSA del cuerpo. Esta cifra demuestra la capacidad de termómetro infrarrojo de precisión y no invasor, medir la temperatura corporal sin anestesia. Por otra parte, las puntuaciones de actividad demostradas en Video 2 reflejan el grado de caída de temperatura medido en este video. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 4: errores en temperatura por hind obstrucción del sensor de la pata. Este video muestra la diferencia de temperaturas con y sin el pie dentro de la circunferencia del sensor. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
El protocolo descrito se estableció con el objetivo de medir la temperatura corporal sin utilizar anestesia. A pesar de su relativa facilidad con que la temperatura pueden obtenerse lecturas, hay varias advertencias que acomodar a esta técnica, además de los efectos más obvios tales como manejo de estrés y diferentes temperaturas.
En primer lugar, para mantener las lecturas de la temperatura constante durante todo el experimento, el lugar donde la temperatura se está midiendo debe ser predeterminado utilizando puntos de referencia anatómicas, y los investigadores deben ser capaces de replicar la medida de dicho cuerpo Ubicación. Asegurando patas delanteras del ratón sobre una superficie de borde recto, como el labio de una jaula o el borde del termómetro, el abdomen se expone fácilmente al sensor infrarrojo del termómetro. En general, el abdomen es un área de gran superficie que permite cierta flexibilidad para obtener resultados consistentes. Además, el abdomen tiene el pelo más dispersa que la superficie dorsal del ratón y por lo tanto permite una lectura más precisa de la temperatura de cuerpo.
En segundo lugar, las patas traseras deben controlarse siempre al tomar una medición de temperatura. Cuando el termómetro está cerca del abdomen, los ratones tienden a poner sus pies en el termómetro sí mismo. Cuando los pies o los dedos del pie están dentro de la circunferencia del sensor, la temperatura puede ser menor que la del abdomen, como se demuestra en el Video 4. Es importante permitir que el ratón a horcajadas con los pies a cada lado del sensor, manteniendo la circunferencia de cualquier partes del cuerpo u objetos además de la superficie abdominal.
En tercer lugar, la superficie abdominal de los ratones no puede ser mojada al tomar las mediciones. Una superficie húmeda que alterará la capacidad de termómetro para medir la temperatura con precisión; generalmente, la temperatura será inferior al valor real. Este problema puede evitarse al mantener los ratones en jaulas con cama fresca durante el curso del período de observación. Esto también asegura que la sequedad de la superficie abdominal se ha estandarizado cada vez que se miden las temperaturas.
Por último, los termómetros infrarrojos tienen un mayor margen de error de sondas rectales, aunque sólo ligeramente. El margen de error para las mediciones con sondas rectales es ± 0,1 ° C, mientras que para los termómetros infrarrojos, es de ± 0,2 ° C. Este margen de error fue mínimo en comparación con las diferencias generales en la gota de la temperatura entre poblaciones en el experimento PSA. Lo más importante, un proyecto que requiere una diferencia tan sutil como ± 0,1 ° C también pueden prever otros margen de cuestiones de error, independientemente de si un termómetro infrarrojo o sonda rectal se utiliza. Durante la preparación de este protocolo, se había también se ha demostrado que existe una correlación muy buena entre el núcleo cuerpo midiendo temperatura implantable transpondedores y temperatura de la superficie corporal medida por termómetros infrarrojos durante hipotermia inducida por lipopolisacárido6.
Caída de temperatura en el modelo de alergia de alimentos utilizado tenía no se ha observado previamente8,10. Había sido el estándar para la evaluación determinar la gravedad del fenotipo marcando de la diarrea; sin embargo, este método carecía de objetividad. Utilizando el termómetro infrarrojo, nos demostró que la temperatura sutil gotas podrían ser detectadas. Entonces fuimos capaces de correlacionar con los niveles de actividad, como los ratones no fueron anestesiados durante el procedimiento. Este método permite de una manera rápida, precisa, fácil de usar, no invasivo y barato medir la temperatura del cuerpo en ratones siendo capaces de observar otros fenotipos que de lo contrario pueden perderse si los ratones son anestesiados para las mediciones de la sonda rectal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Las becas de investigación en Kawakami laboratorio fue apoyado por los NIH: R01 AR064418-01A1, R01 HL124283-01, R21 AI 115534-01 y R41AI124734-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-contact infrared thermometer | SinoPie | DT-8861 | |
| Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE | Sigma Aldrich | D8406-.2MG | |
| PrecisionGlide 30 G needle | BD | 305128 | |
| PrecisionGlide 26 G needle | BD | 305111 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| Dinitrophenyl - human serum albumin | Biosearch Technologies | D-5059-10 | |
| Ovalbumin from chicken egg white | Sigma Aldrich | A5503-50G | |
| Imject Alum | ThermoFisher Scientific | 77161 | |
| Animal Feeding Needles, disposable | Fisher Scientific | 01-208-87 |
References
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