Summary
ここでパッシブ全身性アナフィラキシー (PSA) と赤外線放射温度計を用いた食品アレルギー マウス モデルのボディ温度差を正確に測定する手法を提案する.この手順は、以前の PSA の結果で正確に重複しています。
Abstract
マウスの体温測定はアレルギーとアナフィラキシー症状を調査するため非常に重要です。温度測定のため直腸プローブが一般的であり、彼らはこの点で正確で非常に貴重なと実証されています。ただし、この方法で温度測定動物に怪我なくプローブを挿入するために麻酔にマウスが必要です。これは同時にマウスの他の表現型を観察する能力が制限されます。温度を測定している間、他の表現型を調査するために直腸プローブは、理想的ではない、別の方法が望ましい。直腸体温を測定プローブに同等の信頼性を維持しながらマウス麻酔の必要性は犠牲になります温度測定の非侵襲的方法を紹介します。2 と 150 ミリメートルの間の範囲で体表面温度を検出する赤外線放射温度計を使用します。体温測定のこの方法は確実にマウスの受動システム アナフィラキシー実験中に温度変化の動向をレプリケートする場合に成功します。体表面温度が約 2.0 ° C 直腸プローブ測定よりも低いが、温度低下の程度次の同じ傾向を示します。さらに、同時に温度と活動のレベルを評価するのに食物アレルギー モデル マウスを観察するのに同じ方法を使用します。
Introduction
体温の測定は、モデル1,2の動物でアナフィラキシー症状の効果のモニタリングの重要な部分されています。温度差は、従来マウス3,4直腸プローブ温度計により計測されています。捜査官は、確実に変数間の温度の相違を描かこれらの測定では、ただし、このメソッドは、時間のかかるプロシージャ、ボディコア温度を高めることができるマウスに苦痛を引き起こします。プロービング ・直腸粘膜の断裂と感染3もあります。さらに、マウスは、人道的3温度を測定する直腸プローブを挿入するために麻酔する必要があります。これは遅いプロセスで、それは時間の短い期間内で連続した温度の測定を禁じています。さらに、マウスの活動の表現型は、麻酔が完全に磨り減る、別の時間のかかるプロセスであるまでこの時間の間に観測ができません。最近では、体の温度を測定するための他の信頼性の高い方法は皮下埋め込むパッシブ赤外線トランスポンダー タグまたは温度センサー3,5,6を含む無線送信機を使用しています。一部の研究者によって理想的な方法として許容される、データが広くこれらのメソッド高いイニシャル コストとマウス、皮膚や体の別の部分の下で温度センサーの外科的移植のために苦痛を与えないのために使用されません。
温度差が病気モデル1,2の症状の正確な反射であることを示すためにマウスする必要があります温度測定時に目を覚ましするおよび彼らの通常の表現活動に戻ることができます。測定の前後にすぐに。このため、我々 はこれを達成することができる方法を求めた。
私たちの目標は、正確にかつ安価、麻酔を必要とせず、温度測定の時間の前後の行動表現型の観察を可能にする活動に制限がなくマウスの体温を測定することでした。この目標を達成するために、低侵襲技術標準の直腸温度プローブよりもする必要があるは明らかだった。赤外線温度計は、正確な温度測定値を取得する臨床医学、特に小児科で何十年も使用されています。それは、迅速かつ正確に幼児と積極的にモバイルは、うるさい子供の温度測定を取得する臨床医を許可している別の方法をされています。マウスでこれと同じ手法を実装し、麻酔なしの温度を取得に成功した手法を開発しました。重要なは、このメソッドが測定中マウスの活動を観察することも温度変化に関する確立されたパッシブ全身性アナフィラキシーの結果を複製することがであることを示します。さらに、体温は確かに活動レベルの正確な反射との全体的な表現型であることを示すため、他の症状を同時に調査しながら食物アレルギー マウスの体温を評価する同じメソッドを使用して、マウス。
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Protocol
すべての動物実験は、免疫・ アレルギー、動物愛護とラ ・ ホーヤ所利用委員会によって承認されました。
1. マウス Anesthetization 中に体温測定
- 麻酔誘導ボックスにマウスを配置します。5% イソフルランと酸素の流れを 1 L/min を使用して麻酔します。
注: Anesthetization を確認マウスが随意運動を停止し、30 以上 s モニター呼吸レートの代わりに、ため、一度マウスがすべて 2 あたり 1 息呼吸にモバイルにずっと s またはより長く anesthetization が確認されました。 - 人差し指と親指で首の首筋でマウスを押したまま、下腹部を公開するために、小指を尾をホールドします。
- 地面に平行ボディとマウスを押しながら下腹部の下の赤外線温度計センサーを設置します。
注: 温度計 (センサーの表面ではない) の外側の平坦表面は約 2-5 mm の腹部の表面距離をする必要があります。温度のこの複製の結果は、マウスが (セクション 2 で説明) を麻酔してない間に測定しました。腹部のターゲット サイトを決定することが重要です。間に 2 つの上の乳首を目指して一貫性のある結果を得ることができます。 - 温度を測定するトリガーをホールド.マウスと温度計の安定したホールディングを確保します。
2. 麻酔なしマウス体温測定
- 尾の中でマウスを拾います。
-
マウスの腹部を公開します。
- 開くケージまたはその前足とケージ上部の唇などのストレート エッジ面に保持するマウスを許可します。
注: これはマウス、上半身を伸ばし、腹部を公開することができます。 - また、により、温度計の上端のまっすぐに保持するマウスとマウスの赤外線センサーのちょうど上腹部と温度計の外側平らな面の上に座る。
注: 任意の時間後足は前足が、温度計の表面に休んでいるは、足は腹部の表面からセンサーを妨害していないいるを確認します。足の閉塞と温度計は腹部のより低い温度を測定します。
- 開くケージまたはその前足とケージ上部の唇などのストレート エッジ面に保持するマウスを許可します。
- 温度を測定するトリガーをホールド.
注: マウスは動くために傾向があります。マウスが比較的より少なく移動式温度計測することで一貫して体の同じ場所を測定する際に注意してください。
3. パッシブ全身性アナフィラキシー7
-
0 日目: 免疫グロブリン E (IgE) と感光性を与えます。
- PBS 100 μ g/mL の濃度で抗-ジニトロフェニル (DNP) IgE (マウス) あたり 200 μ L を準備します。
- アンチ-ジニトロフェニル (DNP) IgE だけステップ 3.1.1 または PBS の準備の 200 μ L を腹腔内注入 (PBS だけはネガティブ コントロール)。注射用 26 G 針を使用します。正中線に, 約の間に 2 つの最も劣っている乳首のすぐ外側の注射を実行します。
-
1 日目: DNP hsa アナフィラキシーを誘導します。
- 準備 100 μ (マウス) あたり DNP HSA 0.9 %10 mg/mL の濃度で食塩。
- 手順 1.1 で説明されているように、マウスを麻酔します。
- 手順 1 で説明したテクニックを使用して体温を測定します。
- 3.2.1 準備した DNP HSA の 100 μ L を静脈内注入します。注射用 30 G の針を使用します。Retroorbital 静脈洞で注射を実行します。目の後ろを目指して、浅い角度で目の内側に針を挿入します。
- 注入後、個々 のケージにマウスを配置します。マウスが麻酔から回復することを確認します。彼らが目覚めさせ、自発的に移動式になることを確認します。
- 赤外線放射温度計を使用して体温を測定し、70 分を 10 分毎の活動を観察します。
4. マウス モデル食品のアレルギー8,9
注:図 2に回路図を示します。
-
0 日目: 敏感 OVA/ミョウバンを持つマウス。
- OVA (0.5 mg/mL) とミョウバン (10 mg/mL) PBS で一緒に (マウス) あたり 100 μ L を準備します。30 分の低設定の渦。
- 手順 1.1 で説明されているように、マウスを麻酔します。
- 4.1.1 準備した OVA/ミョウバン混合物の 100 μ L を 26 G 針を使用して、各マウスは注入腹腔内。
注意: 渦 OVA/ミョウバン混合物をもう一度、各注入の前に簡潔に最高に必ず均質混合物。注射部位の詳細については 3.1.3 の手順を参照してください。 - 注入後、戻って元檻の中でマウスを配置します。マウスが麻酔から回復することを確認します。彼らが目覚めさせ、自発的に移動式になることを確認します。
-
14 日目: OVA/ミョウバンと第 2 作を実行します。
- 4.1.1、4.1.2 と 4.1.3 の手順を繰り返します。
-
日 28 46: マウス卵子と一日おきに挑戦します。
- PBS で 250 Mg/ml の濃度で OVA の (マウス) あたり 100 μ を準備します。
注: 混合物は渦とよりもむしろ手で優しく前後にロッキング気泡を最小限に抑えるため行わする必要があります。- 食品アレルギー抑制剤を使用している場合は、阻害剤9を準備します。PBS の 1 Mg/ml の濃度で阻害剤 (マウス) あたり 100 μ L を準備します。これにより、それぞれのマウスの阻害剤の 100 μ g の配信。
注: マウス、課題の 1 つの日の間に合計強制経口投与量 200 μ L を処理できるマウスあたり阻害剤の 100 μ L を超えないようにします。100 μ L は、同様に OVA の挑戦のために必要な 100 μ L 阻害剤使用のためボリュームを推奨最大となります。
- 食品アレルギー抑制剤を使用している場合は、阻害剤9を準備します。PBS の 1 Mg/ml の濃度で阻害剤 (マウス) あたり 100 μ L を準備します。これにより、それぞれのマウスの阻害剤の 100 μ g の配信。
- 手順 1.1 で説明されているように、マウスを麻酔します。
- 口頭で各強制経口投与マウス ステップ 4.3.1 で調製した OVA 溶液 (100 μ L の PBS マウスあたり gavaged で OVA の 25 mg) 100 μ L で。
- 阻害剤を使用している場合は、準備手順 4.3.1.1 で 30 分 OVA 挑戦前に阻害剤 (または PBS コントロール) の強制経口投与のための次の手順で説明した同じ技術を利用します。30 分後に次の手順に進みます。
- 1 mL 注射器で強制経口投与の針を使用します。注射器に OVA の 100 μ L を取る。
- 口に針を挿入します。その後、食道に針を刺して喉の左右に向かって針を指して、カチッします。OVA の 100 μ L を注入します。
注: 針が気管内にないことを確認するには、アクティブな卵子を注入する前に呼吸を確認します。針の挿入は、それが食道ではなく気管に入った場合にも早期に抵抗されます。
- 彼らの個々 のケージにマウスを配置します。便質の簡単な観察は、寝具なしのケージを使用します。
- 麻酔からの回復を確認します。マウスが目覚めさせ、自発的に移動式になることを確認します。
- セクション 2 で説明する手法を使用して縦長 10、20、40、60 分でマウスの体温を測定します。
- PBS で 250 Mg/ml の濃度で OVA の (マウス) あたり 100 μ を準備します。
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Representative Results
パッシブ全身性アナフィラキシー: 静脈注射の 10 週古い女性 BALB/c マウス麻酔をかけられました。ステップ 1 で説明したよう、注入前に、体温 (ビデオ 1) を測定しました。図 1は、点滴後両方の人口の温度の傾向を示します。20 分7時 1.1 ° C の最大のドロップがあった PBS コントロール マウス IgE 感作マウスは 20 分で 3.0 ° C の最大温度低下を示した。さらに、このプロセスを通して、活動のスコアはそれぞれのマウスの移動に基づくを評価しました。マウスはあらゆる撹拌せず最初み。ケージにエバリュエーターの手を導入し、マウスとソフトの接触によって撹拌で、み。彼らの反応に基づいて、マウス評価、1 〜 3 のスケールで採点します。1 のスコアを示しますが動かないかと撹拌; せず最小限モバイル マウス2 のスコアを示すマウスを撹拌せずモバイルではないし、クイックのあいまいな動きすることがなく撹拌で携帯電話3 のスコアは携帯電話または撹拌、せず不動や撹拌でモバイル、迅速な回避の動きは、マウスを示します。動画 2と3は、対応するアクティビティのレベル測定と同様、温度測定方法を例示する 2 つのグループの例を示します。麻酔なしで、ことができる行動の表現型評価温度測定時に、前後の温度測定に使用できる赤外線放射温度計の使い方対照的に、伝統的な直腸プローブが麻酔を必要とし、したがって数分周囲温度測定任意の行動評価を排除します。
食品アレルギー8マウス モデル: マウス モデルの模式図、図 2に示します。マウスは、年齢 8 〜 10 週間の鋭敏化の時点で古い女性の BALB/c マウスです。マウスは、体温や活動の各課題後 10、20、40、60 分で観測しました。チャレンジ 7 時に温度変化の図 3に代表的な結果を示します。10 分; 最大温度低下を示したマウスしたがって、10 分温度は (上に示した基準に基づいて得点) 10 分活動レベルで体温を関連付けるに使用されました。アクティビティ スコアと温度は、統計的に有意な相関 (図 4) をドロップします。パッシブ全身性アナフィラキシーのセクションで述べたように、行動観察を麻酔科の不足のため行ったし、赤外線温度計を用いています。対照的に、直腸プローブ、未然に防ぐ行動観察や評価温度測定の時間の間に。いつでもその温度と他の活動の表現型を記録する必要があります、麻酔を必要としない温度測定システムを利用して不可欠です。
図 1: BALB/c マウスでパッシブ全身性アナフィラキシー 。2 つのマウス抗 DNP IgE、0 日目に投与した ip、iv は 1 日目に生理食塩水入りと DNP HSA 注入します。体温は、70 分の注入後注射前に、と 10 分毎の赤外線温度計を用いて測定したこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 食物アレルギー マウス モデル概略図。0 日 BALB/c マウス卵子とミョウバンと 14 日目に再び感作の ip でした。日 28、30 分それぞれの挑戦前にマウスがあった PBS コントロールまたは食品アレルギー抑制剤 (アラニンと交換の 2 つのシステイン HRF 2CArecombinant ・ ヒスタミン解放・ ファクター) のいずれかを口頭で gavaged9。マウスが挑戦した、25 mg の OVA のイグ。課題 9 課題の毎日を行った。マウスは、体温測定、挑戦後、10、20、40、60 分で得点の活動の観察されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BALB/c マウスで食品アレルギー モデル。第 7 回 OVA チャレンジは赤外放射温度計による入院後に温度を変更します。典型的な結果は、少なくとも 4 つの独立した実験から示されて (* *、p < 0.01 の学生の t-テストによって PBS と 2 ca 治療の間 ns: 重要ではない)。誤差 = SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 活動と食品アレルギーの実験では 10 分で温度相関します。結果は、実験 4 つのセットから取得された測定値を反映します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1: マウスを麻酔しながら体の温度測定します。マウス体内温度測定は、麻酔有無にかかわらずを撮影することができます。一貫した測定では、体の同じ場所に温度計を常に目指してが欠かせません。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2: DNP HSA iv 投与後 40 分で活動レベル。マウスが観察される撹拌せず最初に、し、撹拌で。彼らの反応をもとに、マウスは評価され、1 〜 3 の活動尺度の得点だった。左 (抗 DNP 感作マウス) の上にマウスが右側 (PBS コントロール マウス) マウスは 3 のスコアを与えられる間、1 のスコアを与えられます。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 3: DNP HSA iv 投与後 40 分で温度測定を体します。この図に赤外線温度計の能力を正確に示し、anesthetization せず体温を非侵襲的測定します。さらに、ビデオの 2で示した活動のスコアは、このビデオで測定温度低下の程度を反映しています。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 4: 温度ハインドによって読み取りでエラー足センサーの閉塞します。このビデオでは、センサーの周囲徒歩との気温の差を示します。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
説明されたプロトコルは、麻酔を使用せず体温を測定することを目標に設立されました。にもかかわらず、どれと温度の測定値を得ることができる比較的簡単、ストレスと異なる環境温下処理などのより明らかな効果に加えて、この手法に対応するいくつかの注意点があります。
まず、実験を通じて一貫性のある温度を維持するために、温度が測定されている場所する必要があります。 あらかじめ決められている解剖学的ランドマークを使用してと、調査官は言われた身体の測定をレプリケートできる必要があります。場所。マウスの前足、温度計のエッジまたはケージのリップなどのストレート エッジ面を確保することにより腹部は温度計の赤外線センサーに容易に公開されます。一般的に、腹部は、一貫性のある結果を得るのためのいくつかの柔軟性を可能にする表面の広い領域です。さらに、腹部はマウスの背側表面よりまばらな髪を持っているしより正確な体の温度の読書のためできます。
第二に、後足は前足は、温度測定を行うときに常に監視する必要があります。温度計が腹部に近づくと、マウスは、温度計自体に自分の足を配置する傾向があります。足やつま先、センサーの円周内にあるときビデオ 4で示されるように温度の読み込みは腹部のより低いかもしれません。円周の任意の体の部分や腹部の表面以外のオブジェクトの無料を維持しながら、センサーのいずれかの側にその足で跨ぐために、マウスを許可することが重要です。
第三に、測定値を撮影するときマウスの腹部の表面を湿式にすることはできません。濡れた路面の温度を正確に測定する温度計の機能が変更されます。通常、測定された温度は実際の値よりも低くなります。この問題は、観測期間中に新鮮な寝具を備えたケージの中でマウスを維持することで回避できます。これにより、温度が測定されるたびを腹部の表面の乾燥が標準化されています。
最後に、赤外線温度計直腸プローブより大きい許容誤差をあるだけでも少し。直腸プローブを用いた測定の誤差は ± 0.1 ° C、赤外線温度計は ± 0.2 の ° c.この許容誤差は最小限 PSA 実験集団間温度低下の全体的な違いを比較します。もっと重大に、± 0.1 ° C 可能性がありますエラーの問題の他の余白を予見しても微妙な差を必要とするプロジェクト、関係なくかどうか、赤外線温度計または直腸プローブ使用されます。このプロトコルの準備中、それまた示されていた埋込型温度トランスポンダーと中赤外線温度計を用いて体表面温度体コア温度の非常に良い相関があることリポポリサッカライド投与による低体温症6。
使用食品アレルギー モデルの温度低下みられていない以前8,10。評価のための標準は下痢の得点; で表現型の重症度を決定する以前にされていたただし、このメソッドは、客観性を欠いていた。我々 はその微妙な温度を示した赤外線放射温度計を用いた滴を検出できます。マウスがプロシージャの間に麻酔しないと活動レベルでは、これらを関連付けるしでした。このメソッドは、マウスは直腸プローブ測定を麻酔した場合は獲得できない他の表現型を観察することができますしながらマウスの体温を測定するための高速、正確、簡単に使用できる、非侵襲的、かつ安価な方法をことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ラボは、NIH によって支えられた川上で研究助成金: R01 AR064418 01A1 や R01 HL124283-01、R21 AI 115534-01 R41AI124734 01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-contact infrared thermometer | SinoPie | DT-8861 | |
| Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE | Sigma Aldrich | D8406-.2MG | |
| PrecisionGlide 30 G needle | BD | 305128 | |
| PrecisionGlide 26 G needle | BD | 305111 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| Dinitrophenyl - human serum albumin | Biosearch Technologies | D-5059-10 | |
| Ovalbumin from chicken egg white | Sigma Aldrich | A5503-50G | |
| Imject Alum | ThermoFisher Scientific | 77161 | |
| Animal Feeding Needles, disposable | Fisher Scientific | 01-208-87 |
References
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