Musen kropp temperaturmätning med infraröd termometer under passiva systemisk anafylaxi och mat allergi utvärdering

Summary

Här presenterar vi en ny metod att mäta kroppens temperaturskillnader i passiv systemisk anafylaxi (PSA) och mat allergi musmodeller med en infraröd termometer. Detta förfarande har duplicerats korrekt i tidigare PSA resultat.

Abstract

Musen kropp temperaturmätning är av avgörande betydelse för utredning av allergier och anafylaktiska symtom. Rektal sonder för temperaturmätningar är vanligt, och de har visat sig vara korrekt och ovärderlig i detta avseende. Dock kräver denna metod för temperaturmätning mössen att vara sövda för att infoga sonden utan skada för djuret. Detta begränsar möjligheten att iaktta andra fenotyper av musen samtidigt. För att undersöka andra fenotyper samtidigt mäta temperaturer, rektal sonder är inte perfekt, och en annan metod är önskvärt. Här introducerar vi en noninvasiv metod för temperaturmätning som avstår från kravet på mus anestesi bibehållen lika tillförlitlighet till rektal sonder i mätning av kroppstemperatur. Vi använder en infraröd termometer som upptäcker kroppen yttemperaturer på varierar mellan 2 och 150 mm. Denna metod för kroppen temperaturmätning är framgångsrik i tillförlitligt replikera temperatur förändring trender under passiva system anafylaxi experiment på möss. Vi visar att kroppen yttemperaturer är ca 2,0 ° C lägre än rektal sonden mätningar, men graden av temperatursänkning följer samma trend. Dessutom använder vi samma teknik för att iaktta möss i en mat allergi modell att utvärdera temperatur och aktivitetsnivå samtidigt.

Introduction

Mätning av kroppstemperatur har varit en viktig del av övervaka effekterna av anafylaktiska symtom hos djur modeller^1,2. Temperaturskillnader har traditionellt mätts av rektal sonden termometrar i möss^3,4. Med dessa mätningar, har utredarna tillförlitligt porträtteras temperaturskillnader mellan variabler; men denna metod är en tidskrävande procedur och orsakar lidande till möss, vilket kan öka den förkroppsliga kärnar ur temperaturen. Rektal sondering kan också orsaka slemhinne Riva och infektion³. Mössen bör dessutom vara sövda för att humant sätt i rektala sonden för att mäta temperaturen³. Detta är en långsam process och det förbjuder mätning av successiva temperaturer inom en kort tidsperiod. Dessutom kan inte möss aktivitet fenotyper observeras under den här tiden tills bedövningsmedlet bärs helt av, vilket är en annan tidskrävande process. Mer nyligen, andra tillförlitliga metoder för att mäta kroppstemperatur har använt subkutant implanterad passiv infraröd transponder taggar eller radiosändare som inkluderar en temperatur sensor^3,5,6. Även om de accepteras som den idealiska praxisen av några forskare, används dessa metoder inte på grund av höga initiala kostnader och nöd till möss, på grund av kirurgisk implantation av en temperatursensor under huden eller en annan del av kroppen.

För att demonstrera att en temperaturskillnad är en korrekt spegling av symtom på en sjukdom modell^1,2, måste möss vara vaken under temperaturmätning och kunna återgå till sin normala fenotypiska aktivitet omedelbart före och efter mätningen. Därför sökte vi en metod som detta skulle kunna uppnås.

Vårt mål var att noggrant och billigt mäta mus kroppstemperatur, utan behov av anestesi och utan begränsningar på aktivitet, att möjliggöra observation av beteendemässiga fenotyper under och efter tiden för temperaturmätning. För att uppnå detta mål, var det uppenbart att en teknik som är mindre invasiv än standard rektal temperatur sonder krävdes. IR termometrar har använts i årtionden i klinisk medicin, särskilt i pediatrik, för att erhålla korrekt temperaturavläsningar. Det har varit en alternativ metod som har tillåtit kliniker att snabbt och korrekt få temperaturmätningar hos spädbarn och kinkiga barn som är aktivt mobil. Vi genomfört denna samma teknik i möss och har utvecklat en framgångsrik metod för att få temperaturer utan bedövning. Ännu viktigare, visar vi att denna metod är kapabel att replikera väletablerade passiva systemisk anafylaxi resultaten avseende temperaturförändringar, samtidigt vara kunna observera aktiviteten av musen under hela mätningen. Dessutom vi använder samma metod för att utvärdera kroppstemperatur av mat-allergisk möss, samtidigt undersöka andra symtom, för att påvisa att kroppstemperaturen är verkligen en korrekt återspegling av aktivitetsnivån och övergripande fenotyp av den musen.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av djur vård och användning kommittén av La Jolla-Institutet för allergi och immunologi.

1. musen kropp temperaturmätning under Anesthetization

1. Placera musen i en låda för induktion av anestesi. Söva med 1 L/min flöde av syre med 5% isofluran.
   Obs: Anesthetization är bekräftad när musen upphör frivillig rörelse och har varit orörlig för över 30 s. Alternativt övervaka andningsfrekvens, och när möss andas på 1 andedräkt per varje 2 s eller längre, anesthetization bekräftas.
2. Håll musen av nacken av hångla med ett pekfinger och tumme och håll svansen med en lillfingret för att exponera nedre delen av buken.
3. Placera infraröd termometer sensorn under nedre delen av magen medan du håller musen med dess kropp parallellt med marken.
   Obs: Den yttre platta ytan av termometern (inte ytan på sensorn) bör vara cirka 2 – 5 mm från ytan av buken. Detta replikera resultaten av temperaturer mätas medan möss inte är sövd (beskrivs i avsnitt 2). Det är viktigt att fastställa webbplatsens mål i buken. Siktar mellan två övre Bröstvårtor möjliggör konsekvent resultat.
4. Håll avtryckaren för att mäta temperatur. Säkerställa stabila innehav av musen och termometer.

2. musen kropp temperaturmätning utan bedövning

1. Plocka upp musen i mitten av svansen.
2. Utsätta magen av musen.
   1. Låt musen att hålla fast vid en straight-edge yta, såsom läppen av en öppen bur eller bur-topp med dess framtassarna.
      Obs: Detta gör att musen att sträcka sin överkropp och exponera buken.
   2. Alternativt kan musen att hålla att raka-överkanten på termometern och gör musen sitta på den yttre platta ytan av termometern med dess buken precis över den infraröda sensorn.
      Obs: Helst hind tassarna vilar på ytan av termometern, se till att fötterna inte hindrar sensorn från buken ytan. Termometrar med foten obstruktion mäter en temperatur som är lägre än i buken.
3. Håll avtryckaren för att mäta temperatur.
   Obs: Möss tenderar att flytta; ta hand mäta på samma plats av kroppen konsekvent genom att ta temperaturmätningar när möss är relativt mindre rörlig.

3. passiv systemisk anafylaxi⁷

1. Dag 0: Medvetandegöra med immunglobulin E (IgE).
   1. Förbereda 200 µL (per mus) anti-Dinitrophenylen (DNP) IgE vid en koncentration på 100 µg/mL i PBS.
   2. Intraperitonealt injicera 200 µL anti-Dinitrophenylen (DNP) IgE beredd i steg 3.1.1 eller PBS endast (PBS-bara är den negativa kontrollen). Använd en 26 G nål för injektion. Utföra injektioner bara i sidled till mittlinjen, ungefärligt mellan de två mest sämre bröstvårtorna.
2. Dag 1: Framkalla anafylaxi med DNP-HSA.
   1. Förbereda 100 µL (per mus) av DNP-HSA vid en koncentration på 10 mg/mL 0,9% NaCl.
   2. Söva mössen som beskrivs i steg 1,1.
   3. Mäta kroppstemperaturen med den teknik som beskrivs i steg 1.
   4. Intravenöst Injicera 100 µL av DNP-HSA bereddes i steg 3.2.1. Använd en 30 G nål för injektion. Utföra injektioner på retroorbital venösa sinus. Stick in nålen på den mediala sidan av ögat på en flack vinkel, sikte bakom ögat.
   5. Efter injektionen, placera möss i enskilda burar. Säkerställa att mössen återhämta sig från anestesi. Observera att de vaknar upp och blir frivilligt mobila.
   6. Mäta kroppstemperatur som använder infraröda termometern och observera deras aktivitet varje 10 min för 70 min.

4. musmodell av mat allergi^8,9

Obs: Schematiskt visas i figur 2.

1. Dag 0: Medvetandegöra möss med ägg/alum.
   1. Förbereda 100 µL (per mus) ägg (0,5 mg/mL) och alun (10 mg/mL) tillsammans i PBS. Vortex på inställningen låg i 30 min.
   2. Söva mössen som beskrivs i steg 1,1.
   3. Använder 26 G nål, intraperitonealt injicera varje mus 100 µL av ägg/alum blandningen bereddes i steg 4.1.1.
      Obs: Vortex ägg/alum blandningen igen, kort före varje injektion, att bästa säkerställa en homogeniserad blandning. Se steg 3.1.3 för detaljer på injektionsstället.
   4. Efter injektionen, placera möss tillbaka i sin ursprungliga burar. Säkerställa att mössen återhämta sig från anestesi. Observera att de vaknar upp och blir frivilligt mobila.
2. Dag 14: Utföra en andra sensibilisering med ägg/alum.
   1. Upprepa steg 4.1.1, 4.1.2 och 4.1.3.
3. Dagar 28-46: utmana möss med ägg varannan dag.
   1. Förbereda 100 µL (per mus) ägg vid en koncentration på 250 mg/mL i PBS.
      Obs: Blandningen bör göras genom att försiktigt gunga fram och tillbaka för hand i stället för med en virvel att minimera bubbla bildandet.
      1. Om du använder mat allergi-hämmare, förbereda hämmare⁹. Förbereda 100 µL (per mus) hämmare i en koncentration av 1 mg/mL i PBS. Detta tillåter en leverans av 100 µg av hämmare för varje mus.
         Obs: Inte överstiger 100 µL av hämmare per mus, som möss är bara kunna hantera 200 µL totala sondmatning volym under en utmaning dag. 100 µL är nödvändiga för den OVA-utmaningen samt, är 100 µL maximal rekommenderad volym för hämmare användning.
   2. Söva mössen som beskrivs i steg 1,1.
   3. Oralt sondmatning varje mus med 100 µL av den OVA lösning (25 mg av ägg i 100 µL av PBS gavaged per mus) som utarbetades i steg 4.3.1.
      1. Om du använder hämmare, Använd samma metoder som beskrivs i följande steg för sondmatning hämmare (eller PBS kontroll) som bereddes i steg 4.3.1.1 30 minuter före OVA utmaningen. Efter 30 min, gå vidare till nästa steg.
      2. Använda en sondmatning nål med en 1 mL spruta. Ta upp 100 µL av ägg i sprutan.
      3. Stick in nålen i munnen; sedan pekar nålen mot vänster eller höger sida av halsen, Skjut försiktigt nålen genom matstrupen. Injicera 100 μl av ägg.
         Obs: För att se till att nålen inte i luftstrupen, iaktta aktiva andningen innan du injicerar ägg. Införandet av nålen kommer också motarbetas tidigt om det har gått in i luftstrupen i stället för i matstrupen.
   4. Placera möss i sina enskilda burar. För enkel observation av pall kvalitet, använda burar utan sängkläder.
   5. Säkerställa återhämtningen efter anestesi. Observera att mössen vakna och bli frivilligt mobil.
   6. Mäta kroppstemperatur av möss vid tidpunkter 10, 20, 40 och 60 min med den teknik som beskrivs i avsnitt 2.

Representative Results

Passiva systemisk anafylaxi: för iv injektion, 10 veckors gamla kvinnliga BALB/c-möss var sövd. Före injektionen mätte vi deras kroppstemperatur (Video 1) som beskrivs i steg 1. Figur 1 visar temperatur trenden för båda populationerna efter iv injektion. IgE-sensibiliserad musen visade en maximal temperatursänkning 3,0 ° c på 20 min, medan PBS kontroll musen hade en maximal droppe 1,1 ° C vid 20 min⁷. Dessutom hela processen utvärderades aktivitet noter baserat på rörlighet för varje mus. Möss observerades första gången utan någon agitation. Sedan observerades de med agitation genom att införa utvärderarens handen i buren och göra mjuk kontakt med musen. Baserat på deras reaktioner, mössen utvärderas och poäng på en skala från 1 till 3. 1 Poäng indikerar en mus som är orörliga eller minimalt mobil med och utan agitation; 2 Poäng indikerar en mus som är orörligt utan agitation och är mobil med agitation utan att göra snabb undanmanöver rörelser; och 3 Poäng indikerar en mus som är antingen mobil eller orörliga utan agitation, och mobil med agitation och gör snabb undanmanöver rörelser. Videoklipp 2 och 3 ger exempel på de två grupperna som exemplifierar metoderna för mätning av temperatur samt de motsvarande nivå Aktivitetsmätningar. Användning av infraröda termometern tillåtet för temperaturmätningar utan bedövning, vilket i sin tur tillåtet för beteendemässiga fenotyp utvärdering före, under och efter temperaturmätning; Däremot skulle en traditionell rektal sond kräver narkos och därmed omöjliggör någon beteendevetenskaplig utvärdering inom flera minuter omgivande temperaturmätningar.

Musmodell av mat allergi⁸: schematiskt av musmodell visas i figur 2. Möss är BALB/c honmöss i åldrar 8 till 10 veckor gammal vid tiden för sensibilisering. Möss observerades vid 10, 20, 40 och 60 min efter varje utmaning för kroppstemperatur och aktivitet. Representativa resultat visas i figur 3 i temperaturförändringen under utmaningen 7. Möss visade en maximal temperatursänkning 10 min; Därför användes temperaturerna som 10 min att korrelera med organ temperaturer på 10 min aktivitetsnivåer (med poängsättning utifrån de kriterier som skildras ovan). Aktivitet Poäng och temperatur droppe visade en statistiskt signifikant korrelation (figur 4). Som nämnts i avsnittet passiva systemisk anafylaxi, beteendemässiga observationer utfördes på grund av anestesi och infraröda termometern utnyttjades. Däremot skulle rektal sonder föregripa eventuella beteendemässiga observationer eller utvärderingar under tiden för temperaturmätning. Helst det temperaturen och annan verksamhet som fenotyper måste registreras, är det viktigt att utnyttja en temperaturmätning system som inte kräver narkos.

Figur 1 : Passiv systemisk anafylaxi hos BALB/c möss. Två möss var ip injiceras med anti-DNP IgE på dag 0, då iv injiceras med fysiologisk koksaltlösning eller DNP-HSA på dag 1. Kroppstemperatur mättes med en infraröd termometer före injektion och varje 10 min efter injektion för 70 min. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2 : Mat allergi mus modell Schematisk. Dag 0 var BALB/c-möss sensibiliserade ip med ägg och Alun, och igen på dag 14. Dag 28, 30 min före varje utmaning, möss var oralt gavaged med PBS kontroll eller en mat allergi hämmare (HRF-2CArecombinant histamin-releasing factor med dess två cysteines utbytt med alanines)⁹. Möss utmanades sedan ig med 25 mg av ägg. Utmaningar utfördes varannan dag för 9 utmaningar. Möss observerades för kroppen temperaturmätning och aktivitet scoring på 10, 20, 40 och 60 min efter utmaningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Mat allergi modell hos BALB/c möss. Temperaturen ändra efter 7 ägg utmaningen övervakades av infraröd termometer. Typiska resultat visas från minst fyra oberoende experiment (**, p < 0,01 mellan PBS och 2CA behandlingar av Students t-test; ns: inte signifikant). Felstaplar = SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4 : Sambandet mellan aktivitet och temperatur på 10 min i mat allergi experiment. Resultaten återspeglar mätningarna från 4 separata uppsättningar av experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: kropp temperaturmätning medan möss bedövas. Möss kropp temperaturmätningar kan utföras med eller utan bedövning. För konsekvent mätningar är det viktigt att alltid sikta termometern på samma kropp plats. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video 2: aktivitetsnivå på 40 min efter DNP-HSA iv injektion. Möss observeras utan agitation från början, sedan med agitation. Baserat på deras reaktioner, mössen utvärderades och poäng på en aktivitet skala från 1 till 3. Musen till vänster (anti-DNP sensibiliserade mus) ges en poäng 1, medan musen till höger (PBS kontroll mus) ges en poäng av 3. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video 3: Body temperaturmätning på 40 min efter DNP-HSA iv injektion. Denna siffra visar förmåga infraröda termometern till korrekt och mäta noninvasivt kroppstemperatur utan anesthetization. Dessutom återspeglar aktivitet poängen visade i Video 2 graden av temperatursänkning mätt i denna video. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video 4: fel i temperaturavläsningen av hind paw obstruktion av sensorn. Denna video visar skillnaden i temperaturer med och utan foten inom sensor omkrets. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Protokollet beskrivs grundades med målet att mäta kroppstemperatur utan användning av anestesi. Trots sin relativa lätthet med vilken temperatur avläsningar erhållas, finns det flera fallgropar att rymmer denna teknik, förutom de mer uppenbara effekterna såsom hantering av stress och olika omgivningstemperaturer.

Först för att upprätthålla konsekvent temperaturavläsningar hela experimentet, måste vara förutbestämt läge där temperaturen mäts med hjälp av anatomiska landmärken och utredare måste kunna replikera mätning av nämnda organ läge. Genom att säkra musens framtassarna på en straight-edge yta, såsom läppen av en bur eller kanten på termometern, är buken lätt utsatt för den infraröda sensorn av termometern. Buken är i allmänhet en stor yta som tillåter viss flexibilitet för konsekventa resultat. Dessutom buken har glesare hår än den dorsala ytan av musen, och därför möjliggör en mer exakt kropp temperaturavläsning.

För det andra måste hind tassar alltid övervakas när du tar en temperaturmätning. När termometern är nära buken, tenderar mössen att placera fötterna på termometern själv. När fötter eller tår är inom omkretsen av sensorn, kan temperaturvärdet vara lägre än i buken, vilket framgår i Video 4. Det är viktigt att låta musen för att gränsla med sina fötter på vardera sidan av sensorn, samtidigt hålla omkrets utan några kroppsdelar eller föremål förutom buken ytan.

För det tredje, buken ytorna på möss inte våta när tagande måtten. En våt yta kommer att förändra termometerns förmåga att mäta temperatur exakt; vanligtvis är blir den uppmätta temperaturen lägre än det faktiska värdet. Problemet kan undvikas genom att hålla mössen i burar med färska sängkläder under perioden observationsstudier. Detta garanterar också att torrheten buk ytan är standardiserat varje gång temperaturen mäts.

Slutligen, IR termometrar har en större felmarginal än rektal sonder, om än bara lite. Felmarginalen för mätningar med rektal sonder är ± 0,1 ° C, för IR termometrar, det är ± 0,2 ° C. Denna felmarginal var minimal jämfört med de generella skillnaderna i temperatursänkning mellan populationer i PSA experimentet. Viktigare, ett projekt som kräver en skillnad så subtila som ± 0,1 ° C kan också förutse andra marginal på fel problem, oavsett om en infraröd termometer eller rektal sonden används. Under beredningen av detta protokoll, hade det också visat att det finns en mycket god korrelation mellan kropp core temperaturer mäts av implanterbara temperatur transpondrar och kroppen yttemperaturer mätt med IR termometrar under lipopolysackarid-inducerad hypotermi⁶.

Temperatursänkning i mat allergi modellen används hade inte observerats tidigare^8,10. Standarden för utvärdering tidigare hade att avgöra hur allvarlig fenotyp av diarré scoring; men saknade denna metod objektivitet. Med hjälp av infraröd termometer, vi visade det subtila temperaturen kunde droppar detekteras. Vi kunde då att korrelera dessa med aktivitetsnivåer, som mössen inte var sövd under förfarandet. Denna metod möjliggör en snabb, exakt, lätt-till-använda, icke-invasiv och billigt sätt att mäta kroppstemperatur hos möss samtidigt kunna iaktta andra fenotyper som skulle annars missas om möss bedövas för rektal sonden mätningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-contact infrared thermometer	SinoPie	DT-8861
Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
PrecisionGlide 30 G needle	BD	305128
PrecisionGlide 26 G needle	BD	305111
1 mL syringe	BD	309659
Dinitrophenyl - human serum albumin	Biosearch Technologies	D-5059-10
Ovalbumin from chicken egg white	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
Animal Feeding Needles, disposable	Fisher Scientific	01-208-87