Summary
Aqui nós apresentamos um novo método para medir com precisão as diferenças de temperatura de corpo em anafilaxia sistêmica passiva (PSA) e modelos de rato de alergia alimentar usando um termômetro infravermelho. Este procedimento tem sido duplicado com precisão em resultados anteriores de PSA.
Abstract
Medição de temperatura de corpo do mouse é de suma importância para a investigação de alergias e sintomas de choque anafiláticas. Sondas retais para leituras de temperatura é comum, e eles têm provados ser precisos e inestimável a este respeito. No entanto, este método de medição da temperatura requer os ratos a ser anestesiada para inserir a sonda sem prejuízo para o animal. Isso limita a capacidade de observar outros fenótipos do mouse simultaneamente. A fim de investigar outros fenótipos durante a medição de temperaturas, sondas retais não são ideais, e um outro método é desejado. Aqui, apresentamos um método não invasivo de medição de temperatura que incorra a exigência de anestesia do mouse, mantendo a confiabilidade igual a sondas retais em medir a temperatura do corpo. Nós usamos um termômetro infravermelho que detecta as temperaturas de superfície de corpo em intervalos entre 2 e 150 mm. Este método de medição de temperatura do corpo é bem sucedido em confiantemente, replicando as tendências de mudança de temperatura durante experimentos de anafilaxia sistema passivo em camundongos. Nós mostramos que as temperaturas de superfície do corpo são aproximadamente 2,0 ° C inferior a medições da sonda retal, mas o grau de queda de temperatura segue a mesma tendência. Além disso, podemos usar a mesma técnica para observar ratos em um modelo de alergia alimentar para avaliar os níveis de temperatura e atividade simultaneamente.
Introduction
Medição da temperatura corporal tem sido uma parte essencial de monitorar os efeitos dos sintomas de choque anafiláticas em animal modelos1,2. Diferenças de temperatura tem sido tradicionalmente medidas pelo termômetros retal em ratos3,4. Com estas medidas, investigadores confiantemente tem retratado as diferenças de temperatura entre variáveis; no entanto, esse método é um procedimento demorado e faz com que a aflição de ratos, que podem aumentar a temperatura do corpo. Sondagem retal também pode causar na mucosa rasgando e infecção3. Além disso, os ratos devem ser anestesiados para humanamente inserir a sonda rectal para medir a temperatura3. Este é um processo lento, e proíbe a medição das temperaturas sucessivas dentro de um curto período de tempo. Além disso, fenótipos de atividade de ratos não podem ser observados durante esse tempo, até que o anestésico é completamente desgastado, que é outro processo demorado. Mais recentemente, outros métodos confiáveis para medir a temperatura do corpo tem usado implantado subcutaneamente transmissor infravermelho passivo tags ou transmissores de rádio que incluem uma temperatura sensor3,5,6. Embora eles são aceitos como a prática ideal por alguns pesquisadores, esses métodos não são amplamente utilizados por causa de altos custos iniciais e angústia aos ratos, devido a implantação cirúrgica de um sensor de temperatura sob a pele ou outra parte do corpo.
Para demonstrar que uma diferença de temperatura é um reflexo preciso de sintomas em um modelo de doença1,2, ratos devem ser acordado durante a medição de temperatura e ser capaz de voltar à sua atividade normal fenotípica imediatamente antes e após a medição. Nesse sentido, buscamos um método pelo qual isto poderia ser alcançado.
Nosso objetivo era exatamente e barata medir a temperatura do corpo do mouse, sem a necessidade de anestesia e sem restrições à atividade, para permitir a observação dos fenótipos comportamentais durante e após o tempo de medição de temperatura. Para atingir este objetivo, era evidente que uma técnica menos invasiva do que a temperatura retal padrão sondas foi necessária. Termometros infravermelho têm sido utilizados há décadas na medicina clínica, especialmente em pediatria, para obter leituras precisas da temperatura. Tem sido um método alternativo que permitiu que os clínicos com rapidez e precisão obter medições de temperatura em bebês e crianças exigentes que são ativamente móveis. Estamos implementado essa mesma técnica em ratos e desenvolveu um método bem sucedido para obter temperaturas sem anestesia. Importante, mostramos que esse método é capaz de replicar os resultados de anafilaxia sistêmica passiva bem estabelecida em relação a mudanças de temperatura, enquanto também ser capaz de observar a atividade do mouse durante a medição. Além disso, nós usamos o mesmo método para avaliar a temperatura do corpo dos ratos alimento-alérgica, enquanto simultaneamente investiga outros sintomas, para demonstrar que a temperatura do corpo é de fato um reflexo preciso do nível de atividade e fenótipo geral da rato.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo cuidado Animal e Comissão de utilização do Instituto de La Jolla para alergia e Imunologia.
1. medição de temperatura de corpo Mouse durante Anesthetization
- Coloque o mouse em uma caixa de indução de anestesia. ANESTHETIZE usando fluxo de 1 L/min de oxigênio com 5% de isoflurano.
Nota: Anesthetization é confirmada quando o mouse deixa o movimento voluntário e tem estado parado por mais de 30 s. Alternativamente, frequência respiratória de monitor, e uma vez que os ratos estão respirando em 1 respiração por cada 2 s ou mais, anesthetization é confirmada. - Segure o mouse pela nuca do pescoço com um dedo indicador e polegar e segurar a cauda com um dedo mindinho para expor a parte inferior do abdome.
- Coloque o sensor do termômetro infravermelho abaixo do abdômen inferior, mantendo o mouse com o seu corpo paralelo ao chão.
Nota: A superfície plana externa do termômetro (não a superfície do sensor) deve ser aproximadamente de 2 a 5 mm afastada da superfície do abdômen. Este replicar resultados das temperaturas medidos enquanto ratos não são anestesiados (descrito na secção 2). É importante determinar o local de destino do abdômen. Com o objetivo entre dois bocais superiores permite resultados consistentes. - Segure o gatilho para medir a temperatura. Assegure a exploração estável do mouse e termômetro.
2. medição de temperatura de corpo Mouse sem anestesia
- Pega o mouse no meio da cauda.
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Expor o abdômen do mouse.
- Permitir que o mouse se agarrar a uma superfície de borda reta, tais como o lábio de uma gaiola aberta ou gaiola-top com suas dianteiras.
Nota: Isto permite que o mouse esticar seu corpo superior e expor o abdome. - Alternativamente, permitir que o mouse segurar a borda reta superior do termómetro e fez com que o rato sente-se sobre a superfície plana exterior do termómetro com seu abdômen apenas sobre o sensor infravermelho.
Nota: Qualquer tempo que as patas traseiras estão descansando sobre a superfície do termómetro, certifique-se que os pés não estão obstruindo o sensor da superfície abdominal. Termômetros com obstrução de pé vão medir uma temperatura menor do que no abdômen.
- Permitir que o mouse se agarrar a uma superfície de borda reta, tais como o lábio de uma gaiola aberta ou gaiola-top com suas dianteiras.
- Segure o gatilho para medir a temperatura.
Nota: Os ratos tendem a mover-se; Cuide-se em medir o mesmo local do corpo consistentemente por medições de temperatura quando os ratos são relativamente menos móveis.
3. passivo anafilaxia sistêmica7
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Dia 0: Sensibilizar com imunoglobulina E (IgE).
- Prepare-se 200 µ l (por rato) de IgE anti-dinitrophenyl (DNP) na concentração de 100 µ g/mL de PBS.
- Intraperitonealmente injetar 200 µ l de IgE anti-dinitrophenyl (DNP), preparado na etapa 3.1.1 ou PBS apenas (somente PBS é o controle negativo). Use uma agulha 26G para injeção. Realize as injeções apenas lateral à linha média, aproximadamente entre os dois mamilos mais inferiores.
-
Dia 1: Induzi anafilaxia com DNP-HSA.
- Prepare-se 100 µ l (por rato) de DNP-HSA em uma concentração de 10 mg/mL em 0,9% NaCl.
- Conforme descrito na etapa 1.1, anestesia os ratos.
- Medir a temperatura do corpo, usando a técnica descrita na etapa 1.
- Injete por via intravenosa 100 µ l de DNP-HSA preparado no passo 3.2.1. Use uma agulha 30G para injeção. Realize as injeções no seio venoso retroorbital. Introduza a agulha no lado medial do olho em um ângulo raso, visando atrás do olho.
- Após a injeção, coloque os ratinhos em gaiolas individuais. Certifique-se de que os ratos se recuperar da anestesia. Observe que eles despertam e se tornam voluntariamente móveis.
- Medir a temperatura do corpo com o termômetro infravermelho e observar sua atividade a cada 10min para 70 min.
4. Mouse modelo de alimentos alergia8,9
Nota: O diagrama esquemático é mostrado na Figura 2.
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Dia 0: Sensibilizar os ratos com OVA/alum.
- Prepare-se 100 µ l (por rato) de óvulos (0,5 mg/mL) e alúmen (10 mg/mL) em PBS. Vórtice na configuração baixa por 30 min.
- Conforme descrito na etapa 1.1, anestesia os ratos.
- Usando uma agulha 26G, intraperitonealmente injete cada rato com 100 µ l da mistura preparada na etapa 4.1.1 OVA/alum.
Nota: Vortex novamente, a mistura de OVA/alum brevemente antes de cada injecção, para melhor garantir uma mistura homogeneizada. Consulte a etapa 3.1.3 para obter detalhes sobre o local da injeção. - Após a injeção, coloca ratos em jaulas originais. Certifique-se de que os ratos se recuperar da anestesia. Observe que eles despertam e se tornam voluntariamente móveis.
-
Dia 14: Realize uma segunda sensibilização com OVA/alum.
- Repita as etapas 4.1.1, 4.1.2 e 4.1.3.
-
Dias 28-46: desafiar os ratos com óvulos todos os dias.
- Prepare-se 100 µ l (por rato) de óvulos em uma concentração de 250 mg/mL em PBS.
Nota: A mistura deve ser feita pelo agite-o suavemente para frente e para trás com a mão, em vez de com um vortex para minimizar a formação de bolhas.- Se usando inibidores de alergia alimentar, prepare os inibidores9. Prepare-se 100 µ l (por rato) de inibidor em uma concentração de 1 mg/mL em PBS. Isto permite uma entrega de 100 µ g de inibidor para cada rato.
Nota: Não exceda 100 µ l de inibidor por rato, como os ratos só são capazes de lidar com 200 µ l de volume total gavage durante o dia de um desafio. Como 100 µ l são necessários para o desafio de óvulos também, 100 µ l é o máximo recomendado volume para uso de inibidor.
- Se usando inibidores de alergia alimentar, prepare os inibidores9. Prepare-se 100 µ l (por rato) de inibidor em uma concentração de 1 mg/mL em PBS. Isto permite uma entrega de 100 µ g de inibidor para cada rato.
- Conforme descrito na etapa 1.1, anestesia os ratos.
- Oralmente, gavage cada mouse com 100 µ l da solução de óvulos (25 mg de óvulos em 100 µ l de PBS gavaged por rato) que foi preparado no passo 4.3.1.
- Se usando inibidores, utilizam as mesmas técnicas descritas nas etapas a seguir para a gavagem de inibidor (ou controle de PBS) preparado na etapa 4.3.1.1 30 minutos antes do desafio de óvulos. Depois de 30 min, passar para a próxima etapa.
- Use uma agulha de gavagem com uma seringa de 1 mL. Ocupam-se 100 µ l de óvulos para a seringa.
- Insira a agulha na boca; em seguida, apontando a agulha para o lado esquerdo ou direito da garganta, deslize suavemente a agulha através do esôfago. Injete 100 µ l de óvulos.
Nota: Para assegurar que a agulha não é na traqueia, observe ativo de respiração antes de injetar os óvulos. A inserção da agulha também ser resistida cedo se tenha formulado a traqueia ao invés do esôfago.
- Coloque os ratinhos em gaiolas individuais. Para fácil observação da qualidade do tamborete, use gaiolas sem fundamento.
- Garantir a recuperação da anestesia. Observe que os ratos despertam e tornar-se voluntariamente móveis.
- Medir a temperatura do corpo dos ratos em momentos de 10, 20, 40 e 60 min usando a técnica descrita na secção 2.
- Prepare-se 100 µ l (por rato) de óvulos em uma concentração de 250 mg/mL em PBS.
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Representative Results
Anafilaxia sistêmica passiva: 10 semana para injeção iv, velhos camundongos BALB/c fêmeas foram anestesiados. Antes da injeção, medimos a temperatura do corpo (Video 1) conforme descrito na etapa 1. A Figura 1 mostra a tendência de temperatura de ambas as populações após injeção iv. O rato sensibilizados por IgE, mostrou uma queda de temperatura máxima de 3,0 ° C durante 20 min, enquanto o mouse de controle de PBS teve uma queda máxima de 1,1 ° C em 20 min7. Além disso, ao longo deste processo, golo de atividade foram avaliados com base na mobilidade de cada rato. Primeiro, os ratos observaram-se sem qualquer agitação. Em seguida, eles foram observados com agitação introduzindo a mão do avaliador na gaiola e fazendo contato suave com o mouse. Com base em suas reações, os ratos são avaliados e marcou numa escala de 1 a 3. Uma pontuação de 1 indica um mouse que é imóvel ou minimamente móvel com e sem agitação; um escore de 2 indica um mouse que é imóvel sem agitação e é móvel com agitação sem fazer movimentos evasivos rápidos; e um placar de 3 indica um mouse que é móvel ou imóvel, sem agitação e móvel com agitação e faz rápidos movimentos evasivos. Vídeos 2 e 3 fornecem exemplos dos dois grupos que exemplificam os métodos de medição de temperatura, bem como as medições de nível de atividade correspondente. Uso do termômetro infravermelho permitido para medições de temperatura sem anestesia, que por sua vez permitiu avaliação do fenótipo comportamental antes, durante e após a medição da temperatura; em contraste, uma sonda rectal tradicional que requerem anestesia e, portanto, impede qualquer avaliação comportamental dentro dos vários minutos que cercam as medições de temperatura.
Modelo do rato de alimentos alergia8: esquema do modelo do mouse é mostrado na Figura 2. Os ratos são camundongos BALB/c fêmeas de idades de 8 a 10 semanas de idade no momento da sensibilização. Os ratos foram observados em 10, 20, 40 e 60 min após cada desafio para a temperatura corporal e atividade. Um resultado representativo é mostrado na Figura 3 , a mudança de temperatura durante o desafio 7. Os ratos mostraram uma queda de temperatura máxima em 10 min; Portanto, as temperaturas de 10 min foram utilizadas para correlacionar com a temperatura do corpo a níveis de atividade de 10 min (com pontuação baseado nos critérios descritos acima). Temperatura e escore de atividade larga mostraram uma correlação estatisticamente significativa (Figura 4). Como mencionado na seção de anafilaxia sistêmica passiva, observações comportamentais foram realizadas devido à falta de anestesia, e foi utilizado o termômetro infravermelho. Em contraste, sondas retais iria antecipar eventuais observações comportamentais ou avaliações durante o tempo de medição de temperatura. Qualquer hora essa temperatura e outra actividade fenótipos devem ser gravados, é essencial utilizar um sistema de medição da temperatura que não requer anestesia.
Figura 1 : Passiva anafilaxia sistêmica em camundongos BALB/c. Dois ratos foram injetado com IgE anti-DNP no dia 0 de ip e, em seguida, iv injetado com solução salina normal ou DNP-HSA no dia 1. Temperatura corporal foi medida usando um termômetro infravermelho antes da injeção e a cada 10 min após a injeção de 70 min. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diagrama esquemático do modelo do rato alergia alimentos. No dia 0, camundongos BALB/c foram sensibilizada ip com óvulos e alum e novamente no dia 14. No dia 28, 30 min antes de cada desafio, os ratos foram gavaged por via oral com controle de PBS ou um inibidor de alergia alimentar (HRF-2CArecombinant fator liberador de histamina com suas duas cisteínas trocadas com alanines)9. Os ratos foram então desafiou ig com 25 mg de óvulos. Os desafios foram realizados todos os dias para 9 desafios. Os ratos foram observados para medição de temperatura do corpo e atividade pontuando em 10, 20, 40 e 60 min após o desafio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Modelo de alergia alimentar em camundongos BALB/c. Temperatura muda após o 7º desafio de óvulos foi monitorado por termômetro infravermelho. Resultados típicos são mostrados pelo menos quatro experimentos independentes (* *, p < 0,01 entre tratamentos PBS e 2CA pelo teste t de Student; ns: não significativo). Barras de erro = SEM. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Correlação entre a atividade e a temperatura a 10 min em experimentos de alergia alimentar. Os resultados refletem as medições efectuadas 4 conjuntos distintos de experiências. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: medição da temperatura do corpo enquanto ratos são anestesiados. Medidas de temperatura do corpo de ratos podem ser tomadas com ou sem anestesia. Para medições consistentes, é essencial para mirar sempre o termômetro no mesmo local do corpo. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Video 2: nível de atividade em 40 min após a injeção iv de DNP-HSA. Os ratos são observados sem agitação inicialmente, depois com agitação. Com base em suas reações, os ratos foram avaliados e marcou em uma escala de atividade de 1 a 3. O mouse da esquerda (rato sensibilizadas de anti-DNP) é atribuído uma pontuação de 1, enquanto o mouse à direita (mouse controle de PBS) é atribuído uma pontuação de 3. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 3: corpo de medição de temperatura em 40 min após a injeção iv de DNP-HSA. Esta figura demonstra a capacidade do termômetro infravermelho para precisão e canaliza a medir a temperatura do corpo sem anesthetization. Além disso, os escores de atividade demonstrados no vídeo 2 refletem o grau de queda de temperatura medido neste vídeo. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Video 4: erros de leitura por hind temperatura pata obstrução do sensor. Este vídeo demonstra a diferença de temperatura com e sem o pé dentro da circunferência do sensor. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
O protocolo descrito foi criado com o objetivo de medir a temperatura do corpo sem o uso de anestesia. Apesar de sua relativa facilidade com que temperatura leituras podem ser obtidas, existem várias advertências que acomodar esta técnica, além dos efeitos mais óbvios como lidar com stress e temperaturas ambientes diferentes.
Primeiro, a fim de manter as leituras de temperatura consistente durante todo o experimento, o local onde a temperatura está sendo medida deve ser predeterminado usando pontos de referência anatômicos e investigadores devem ser capazes de replicar a medição do corpo disse localização. Fixando dianteiras do mouse em uma superfície de borda reta, como o lábio de uma gaiola ou a ponta do termómetro, o abdômen é prontamente exposto ao infravermelho sensor do termómetro. Geralmente, o abdômen é uma grande área de superfície que permite alguma flexibilidade para resultados consistentes. Além disso, o abdômen tem o cabelo mais escassa do que a superfície dorsal do mouse e, portanto, permite uma leitura de temperatura do corpo mais precisa.
Em segundo lugar, as patas traseiras sempre devem ser monitoradas quando efectuar uma medição de temperatura. Quando o termômetro está perto do abdômen, os ratos tendem a colocar seus pés sobre o termómetro em si. Quando os pés ou dedos dos pés estão dentro da circunferência do sensor, a leitura da temperatura pode ser menor do que no abdômen, como demonstrado no vídeo 4. É importante permitir que o mouse para montar com seus pés em ambos os lados do sensor, mantendo a circunferência livre de quaisquer partes do corpo ou objetos além da superfície abdominal.
Em terceiro lugar, as superfícies abdominais de ratos não podem ser molhadas quando as medidas a tomar. Uma superfície molhada irá alterar a capacidade do termómetro para medir a temperatura com precisão; Normalmente, a temperatura medida será menor do que o valor real. Esse problema pode ser evitado mantendo-se os ratos em gaiolas com roupa de cama fresca no decurso do período de observação. Isso também garante que o ressecamento da superfície abdominal é padronizado cada vez que as temperaturas são medidas.
Por último, termometros infravermelho tem uma maior margem de erro de sondas retais, embora apenas ligeiramente. A margem de erro para medições com sondas retais é ± 0,1 ° C, enquanto que para termômetros infravermelhos, é de ± 0,2 ° C. Esta margem de erro era mínima comparado às diferenças na queda de temperatura globais entre as populações no experimento de PSA. Mais importante, um projeto que exige uma diferença tão sutil como ± 0,1 ° C também podem prever outra margem das questões de erro, independentemente de se um termômetro infravermelho ou sonda rectal é usada. Durante a preparação do presente protocolo, ele tinha também foi mostrado que existe uma correlação muito boa entre a temperatura do corpo medida pela temperatura implantável transponders e as temperaturas de superfície de corpo medidas pelos termômetros infravermelhos durante hipotermia induzida pelo lipopolissacarídeo6.
Queda de temperatura no modelo de alergia alimentar usado tinha não foi observada anteriormente8,10. O padrão para a avaliação tinha sido anteriormente determinar a severidade do fenótipo marcando diarreia; no entanto, esse método carecia de objetividade. Usando o termômetro infravermelho, mostramos essa temperatura sutil gotas poderiam ser detectadas. Então fomos capazes de correlacionar com níveis de atividade, como os ratos não foram anestesiados durante o procedimento. Este método permite uma rápido, exato, fácil de usar, não invasiva e barato maneira medir a temperatura do corpo em ratos enquanto ser capaz de observar outros fenótipos que caso contrário teria perdidos se os ratos são anestesiados para medições de sonda retal.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa no Kawakami lab foi apoiada pelo NIH concede: R01 AR064418-01A1, R01 HL124283-01, R21 AI 115534-01 e R41AI124734-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-contact infrared thermometer | SinoPie | DT-8861 | |
| Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE | Sigma Aldrich | D8406-.2MG | |
| PrecisionGlide 30 G needle | BD | 305128 | |
| PrecisionGlide 26 G needle | BD | 305111 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| Dinitrophenyl - human serum albumin | Biosearch Technologies | D-5059-10 | |
| Ovalbumin from chicken egg white | Sigma Aldrich | A5503-50G | |
| Imject Alum | ThermoFisher Scientific | 77161 | |
| Animal Feeding Needles, disposable | Fisher Scientific | 01-208-87 |
References
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