Summary
Nous présentons ici une nouvelle méthode pour mesurer avec précision les écarts de température du corps dans l’anaphylaxie systémique passive (PSA) et des modèles de souris allergie alimentaire à l’aide d’un thermomètre infrarouge. Cette procédure a été fidèlement reproduite dans les précédents résultats de PSA.
Abstract
Mesurer la température de corps souris est d’une importance primordiale pour enquêter sur les allergies et les symptômes anaphylactiques. Sondes rectales pour les lectures de température est commun, et ils sont est avérés pour être précis et précieux à cet égard. Toutefois, cette méthode de mesure de température exige les souris pour être anesthésiés afin d’y pour insérer la sonde sans nuire à l’animal. Cela limite la capacité d’observer simultanément les autres phénotypes de la souris. Afin d’enquêter sur d’autres phénotypes tout en mesurant les températures, les sondes rectales ne sont pas idéales, et une autre méthode est souhaitée. Ici, nous présentons une méthode non invasive de la mesure de la température qui renonce à l’exigence pour l’anesthésie de la souris tout en maintenant la fiabilité égale aux sondes rectales pour mesurer la température corporelle. Nous utilisons un thermomètre infrarouge qui détecte la température de surface de corps à des distances de 2 à 150 mm. Cette méthode de mesure de température de corps est réussie dans la reproduction fiable des tendances de changement de température au cours d’expériences d’anaphylaxie système passif chez les souris. Nous montrons que les températures de surface de corps sont environ 2,0 ° C inférieure à la mesure de la sonde rectale, mais le degré de chute de température suit la même tendance. En outre, nous utilisons la même technique pour observer les souris dans un modèle d’allergie alimentaire pour évaluer les niveaux de température et l’activité simultanément.
Introduction
Mesure de la température corporelle a été un élément essentiel de la surveillance des effets des symptômes anaphylactiques chez les animaux modèles1,2. Écarts de température ont été traditionnellement mesurées par les thermomètres sonde rectale en souris3,4. Avec ces mesures, les enquêteurs ont dépeint fiable de différences de température entre les variables ; Toutefois, cette méthode est une procédure longue et provoque la détresse à des souris, ce qui peuvent augmenter la température corporelle. Sonde rectale peut également provoquer larmoiement et infection muqueuse3. En outre, les souris devraient être anesthésiés pour humainement insérer la sonde rectale pour mesurer la température :3. Il s’agit d’un processus lent, et il interdit la mesure des températures successives dans un court laps de temps. En outre, les phénotypes de l’activité de souris ne peuvent être observées pendant cette période, jusqu'à ce que l’anesthésie est complètement dissipé, qui est un autre processus fastidieux. Plus récemment, autres méthodes fiables pour mesurer la température corporelle ont utilisé des balises transpondeur infrarouge passif implanté sous la peau ou des émetteurs de radio comprenant un capteur de la température3,5,6. Même si elles sont acceptées comme la pratique idéale par certains chercheurs, ces méthodes ne sont pas largement utilisés en raison des coûts initiaux élevés et de détresse chez la souris, en raison de l’implantation chirurgicale d’un capteur de température sous la peau ou une autre partie du corps.
Afin de démontrer qu’une différence de température est un reflet fidèle des symptômes à une maladie modèle1,2, souris doivent être éveillés pendant la mesure de la température et reprendre leurs activités normales phénotypique immédiatement avant et après la mesure. À cette fin, nous avons recherché une méthode par lequel cela pourrait se faire.
Notre objectif était pour mesurer la température corporelle de souris, sans la nécessité d’une anesthésie et sans restrictions à l’activité, pour permettre l’observation des phénotypes comportements pendant et après le temps de mesure de la température avec précision et à moindre coût. Pour atteindre cet objectif, il était évident qu’une technique moins invasive que les sondes de la température rectale normale était nécessaire. Les thermomètres infrarouges ont été utilisés pendant des décennies en médecine clinique, en particulier en pédiatrie, pour obtenir des lectures de température précis. Il a été une méthode alternative qui a permis aux cliniciens de rapidement et précisément obtenir des mesures de température chez les nourrissons et les enfants capricieux qui sont activement mobiles. Nous avons mis en place cette même technique chez des souris et ont mis au point une méthode efficace pour obtenir des températures sans anesthésie. Ce qui est important, nous montrons que cette méthode est capable de reproduire les résultats de l’anaphylaxie systémique passive bien établies concernant les changements de température, tout en étant en mesure d’observer l’activité de la souris tout au long de la mesure. En outre, nous utilisons la même méthode pour évaluer la température corporelle de souris allergiques aux aliments, tout en étudiant simultanément d’autres symptômes, afin de démontrer que la température du corps est en effet un reflet exact du niveau d’activité et le phénotype global de la souris.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme de l’Institut de La Jolla et animalier d’allergie et d’immunologie.
1. souris corps mesure de la température au cours de la Anesthetization
- Placez votre souris dans une boîte d’induction de l’anesthésie. Anesthésie à l’aide de 1 L/min débit d’oxygène à l’isoflurane 5 %.
Remarque : Anesthetization est confirmée lorsque la souris ne répond plus de mouvement volontaire et a été immobile pendant plus de 30 s. alternativement, fréquence respiratoire du moniteur, et une fois que la souris respirent au 1 insufflations par toutes les 2 s ou plus, anesthetization est confirmée. - Maintenez le pointeur de la souris par la nuque avec un index et votre pouce et maintenez la queue avec un petit doigt pour exposer le bas-ventre.
- Placez le capteur thermomètre infrarouge sous le bas de l’abdomen tout en maintenant la souris avec son corps parallèle au sol.
Remarque : La surface externe plate du thermomètre (pas la surface du capteur) devrait être environ de 2 à 5 mm de la surface de l’abdomen. Ce résultats répétés des températures mesurées tandis que les souris ne sont pas anesthésiés (voir section 2). Il est important de déterminer l’emplacement de la cible de l’abdomen. Visant entre deux mamelons supérieures permet des résultats cohérents. - Maintenez la gâchette pour mesurer la température. Assurer l’exploitation stable de la souris et le thermomètre.
2. mesure de température de corps souris sans anesthésie
- Soulevez la souris au milieu de la queue.
-
Exposer l’abdomen de la souris.
- Laissez la souris s’accrocher à une surface de droite, comme la lèvre d’une cage ouverte ou cage-dessus avec ses pattes de devant.
Remarque : Ceci permet à la souris étirer son corps supérieur et exposer l’abdomen. - Sinon, laisser la souris de tenir sur le bord supérieur droit du thermomètre et rendre la souris s’asseoir sur la surface externe plate du thermomètre avec son abdomen juste au-dessus du capteur infrarouge.
Remarque : N’importe quel moment que les pattes reposent sur la surface du thermomètre, veiller à ce que les pieds ne sont pas emmêlés dans le capteur de la surface abdominale. Thermomètres avec pied obstruction mesurera une température inférieure à celle de l’abdomen.
- Laissez la souris s’accrocher à une surface de droite, comme la lèvre d’une cage ouverte ou cage-dessus avec ses pattes de devant.
- Maintenez la gâchette pour mesurer la température.
Remarque : Les souris ont tendance à se déplacer ; Veillez à mesurer au même endroit du corps uniformément en prenant des mesures de température lorsque les souris sont relativement moins mobiles.
3. passif systémiques anaphylaxie7
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Jour 0 : Sensibiliser à l’immunoglobuline E (IgE).
- Préparez 200 µL (par souris) d’IgE anti-dinitrophényl (DNP) à une concentration de 100 µg/mL dans du PBS.
- Injecter par voie intrapéritonéale 200 µL d’IgE anti-dinitrophényl (DNP) préparé à l’étape 3.1.1 ou PBS seulement (PBS seule est le témoin négatif). Utiliser une aiguille 26 G pour injection. Effectuer les injections juste latéraux à la ligne médiane, entre les deux mamelons plus inférieures.
-
Jour 1 : Induire anaphylaxie avec DNP-HSA.
- Préparer 100 µL (par souris) de DNP-HSA à une concentration de 10 mg/mL dans 0,9 % NaCl.
- Anesthésier les souris comme indiqué au point 1.1.
- Mesurer la température du corps en utilisant la technique décrite à l’étape 1.
- Injecter par voie intraveineuse de 100 µL de DNP-HSA préparée à l’étape 3.2.1. Utiliser une aiguille de 30 G pour l’injection. Effectuer les injections sur le sinus veineux retroorbital. Insérez l’aiguille sur le côté médial de le œil à un angle faible, visant derrière le œil.
- Après l’injection, placez les souris dans des cages individuelles. Veiller à ce que les souris récupérer de l’anesthésie. Observer qu’ils réveillent et deviennent volontairement mobiles.
- Mesurer la température du corps avec le thermomètre à infrarouge et d’observer leur activité toutes les 10 min pendant 70 min.
4. Mouse Model of Food Allergy8,9
Remarque : Le schéma est illustré à la Figure 2.
-
Jour 0 : Sensibiliser les souris avec ovules/alun.
- Préparer 100 µL (par souris) d’ovules (0,5 mg/mL) et de l’alun (10 mg/mL) ensemble dans du PBS. Vortex à la faible intensité pendant 30 min.
- Anesthésier les souris comme indiqué au point 1.1.
- À l’aide d’une aiguille 26 G, injecter par voie intrapéritonéale chaque souris avec 100 µL du mélange OVA/alun préparé à l’étape 4.1.1.
NOTE : Vortex le mélange OVA/alun encore une fois, brièvement avant chaque injection, pour mieux assurer un mélange homogénéisé. Voir l’étape 3.1.3 pour plus de détails sur le site d’injection. - Après l’injection, replacez les souris dans leurs cages originales. Veiller à ce que les souris récupérer de l’anesthésie. Observer qu’ils réveillent et deviennent volontairement mobiles.
-
Jour 14 : Effectuer une deuxième sensibilisation avec ovules/alun.
- Répétez les étapes 4.1.1 et 4.1.2 4.1.3.
-
Jours 28-46 : défier les souris avec ovules tous les deux jours.
- Préparer 100 µL (par souris) d’ovules à une concentration de 250 mg/mL dans du PBS.
Remarque : Le mélange convient en poussant doucement en arrière à la main plutôt que sur un vortex pour minimiser la formation de bulles.- Si vous utilisez des inhibiteurs d’allergie alimentaire, préparer les inhibiteurs9. Préparer 100 µL (par souris) de l’inhibiteur à une concentration de 1 mg/mL dans du PBS. Cela permet un débit de 100 µg d’inhibiteur pour chaque souris.
NOTE : Ne pas dépasser 100 µL de l’inhibiteur par souris, car les souris ne sont en mesure de gérer 200 µL du volume total de gavage au cours de la journée-un défi. Puisque 100 µL sont nécessaires pour l’enjeu ovules ainsi, 100 µL est le maximum recommandé de volume pour l’utilisation de l’inhibiteur.
- Si vous utilisez des inhibiteurs d’allergie alimentaire, préparer les inhibiteurs9. Préparer 100 µL (par souris) de l’inhibiteur à une concentration de 1 mg/mL dans du PBS. Cela permet un débit de 100 µg d’inhibiteur pour chaque souris.
- Anesthésier les souris comme indiqué au point 1.1.
- Par voie orale de gavage chaque souris avec 100 µL de la solution d’ovules (25 mg d’ovules dans 100 µL de PBS gavés par souris) qui a été préparée à l’étape 4.3.1.
- Si vous utilisez des inhibiteurs, utilisent les mêmes techniques décrites dans les étapes suivantes pour le gavage d’inhibiteur (ou contrôle de PBS) préparé à l’étape 4.3.1.1 30 minutes avant l’enjeu ovules. Après 30 min, passez à l’étape suivante.
- Utiliser une aiguille de gavage avec une seringue de 1 mL. Ramasser 100 µL d’ovules dans la seringue.
- Insérer l’aiguille dans la bouche ; puis, pointant l’aiguille vers la gauche ou la droite de la gorge, faites doucement glisser l’aiguille dans le œsophage. Injecter 100 µL d’ovules.
Remarque : Pour s’assurer que l’aiguille n’est pas dans la trachée, observer active respirer avant d’injecter les ovules. L’insertion de l’aiguille sera également résister au début si il est entré dans la trachée au lieu de le œsophage.
- Placez les souris dans leurs cages individuelles. Pour la simple observation de la qualité des selles, utiliser des cages sans literie.
- S’assurer de l’anesthésie. Observer que les souris s’éveiller et deviennent volontairement mobiles.
- Mesurer la température du corps des souris à intervalles de 10, 20, 40 et 60 min en utilisant la technique décrite à l’article 2.
- Préparer 100 µL (par souris) d’ovules à une concentration de 250 mg/mL dans du PBS.
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Representative Results
Anaphylaxie systémique passive : injectable i.v., semaine 10 vieilles femelles BALB/c ont été anesthésiés. Avant l’injection, nous avons mesuré leur température corporelle (Video 1) tel que décrit à l’étape 1. La figure 1 illustre la tendance de la température des deux populations après injection intraveineuse. La souris sensibilisées IgE a montré une baisse de la température maximale de 3,0 ° C à 20 min, alors que la souris de contrôle PBS avait une baisse maximale de 1,1 ° C à 20 min de7. En outre, tout au long de ce processus, scores d’activité ont été évaluées basées sur la mobilité de chaque souris. Nous observons tout d’abord souris sans aucune agitation. Puis, ils ont été observés avec agitation en introduisant la main de l’évaluateur dans la cage et en faisant contact doux avec la souris. D’après leurs réactions, les souris sont évaluées et a marqué sur une échelle de 1 à 3. Un score de 1 indique une souris qui est immobile ou peu mobiles avec et sans agitation ; un résultat de 2 indique une souris qui est immobile sans agitation et est mobile avec agitation sans faire de rapides mouvements évasives ; et un score de 3 indique une souris qui est mobile ou immobile sans agitation et mobile avec agitation et fait des mouvements d’évitement rapides. Vidéos 2 et 3 sont des exemples des deux groupes qui illustrent les méthodes de mesure de température ainsi que les mesures de niveaux de l’activité correspondant. Utilisation du thermomètre infrarouge permis des mesures de température sans anesthésie, ce qui a permis à son tour pour l’évaluation de phénotype comportemental avant, pendant et après la mesure de la température ; en revanche, une sonde rectale traditionnelle serait nécessitent une anesthésie et interdit donc toute évaluation comportementale dans les quelques minutes qui entourent la mesure de la température.
Modèle murin d' allergie de nourriture8: le schéma du modèle souris est illustré à la Figure 2. Les souris sont des souris femelles BALB/c des âges 8 à 10 semaines au moment de la sensibilisation. Souris ont été observés à 10, 20, 40 et 60 min après chaque défi pour la température du corps et de l’activité. Un résultat représentatif est montré dans la Figure 3 de la variation de température au cours du défi 7. Les souris ont montré une baisse de la température maximale à 10 min ; par conséquent, les températures de 10 min servaient à mettre en corrélation avec la température du corps au niveau de l’activité 10 min (avec notation selon les critères décrits plus haut). Température et score d’activité goutte ont montré une corrélation statistiquement significative (Figure 4). Comme mentionné dans la section de l’anaphylaxie systémique passive, des observations comportementales ont été réalisées en raison de l’absence d’anesthésie, et le thermomètre infrarouge a été utilisé. En revanche, sondes rectales pourraient prévenir des observations comportementales ou les évaluations pendant le temps de mesure de la température. N’importe quel moment cette température et autre activité phénotypes doivent être enregistrés, il est essentiel d’utiliser un système de mesure de la température qui ne nécessite pas d’anesthésie.
Figure 1 : Passif systémique anaphylaxie chez des souris BALB/c. Deux souris ont ip injecté avec IgE anti-DNP au jour 0, puis iv injecté avec une solution saline normale ou DNP-HSA au jour 1. Température corporelle a été mesurée à l’aide d’un thermomètre infrarouge avant l’injection et toutes les 10 min après l’injection pour 70 min. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma de modèle alimentaire allergie souris. Jour 0, souris BALB/c ont été sensibilisée ip avec des ovules et de l’alun et de nouveau le jour 14. Le jour 28, 30 min avant chaque défi, les souris ont été oralement gavés avec contrôle de PBS ou un inhibiteur d’allergie alimentaire (facteur de libération de l’histamine HRF-2CArecombinant avec ses deux cystéines échangées avec biogénétiquement)9. Souris ont ensuite été contestées ig avec 25 mg d’ovules. Défis ont été réalisés tous les deux jours pour 9 défis. Souris ont été observées pour mesurer la température de corps et de l’activité marquant à 10, 20, 40 et 60 min après le défi. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Modèle d’allergie alimentaire chez des souris BALB/c. Changement de la température après que le 7e défi ovules ont été suivi par thermomètre infrarouge. Résultats typiques sont présentés depuis au moins quatre expériences indépendantes (**, p < 0,01 entre traitements PBS et 2 ca de test t de Student ; ns : non significatif). Barres d’erreur = SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Corrélation entre l’activité et la température à 10 min dans les expériences d’allergie alimentaire. Les résultats reflètent les mesures prises à partir de 4 ensembles distincts d’expériences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : mesure de la température du corps tandis que les souris sont anesthésiés. Mesures de température de corps souris peuvent être pris avec ou sans anesthésie. Pour des mesures cohérentes, il est essentiel de toujours viser le thermomètre au même endroit du corps. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2 : niveau d’activité, 40 min après injection intraveineuse de DNP-HSA. Souris sont observés sans agitation au départ, puis avec agitation. D’après leurs réactions, les souris ont été évaluées et a marqué à l’échelle de l’activité de 1 à 3. La souris sur la gauche (souris sensibilisées anti-DNP) reçoit un score de 1, tandis que la souris sur la droite (souris de contrôle PBS) reçoit un score de 3. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 3 : corps de mesure de la température à 40 min après injection intraveineuse de DNP-HSA. Ce chiffre démontre la capacité du thermomètre à infrarouge avec précision et non invasive de mesurer la température corporelle sans anesthetization. En outre, les scores d’activité démontrées dans Video 2 reflètent le degré de baisse de la température mesuré dans cette vidéo. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 4 : erreurs de température lecture hind patte d’obstruction de la sonde. Cette vidéo montre la différence de température avec ou sans pied à la circonférence du capteur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Le protocole décrit a été créé dans le but de mesurer la température de corps sans l’utilisation de l’anesthésie. Malgré sa relative facilité avec laquelle la température lectures peuvent être obtenus, il y a plusieurs mises en garde qui s’adapter cette technique, en plus des effets plus évidents tels que gestion de stress et températures ambiantes différentes.
Tout d’abord, afin de maintenir les lectures de température constante tout au long de l’expérience, l’endroit où la température est mesurée doit être prédéterminé à l’aide de repères anatomiques et enquêteurs doivent être en mesure de reproduire la mesure de l’organe emplacement. En sécurisant les pattes de la souris sur une surface de droite, comme la lèvre d’une cage ou le bord du thermomètre, l’abdomen est facilement exposé au capteur infrarouge du thermomètre. L’abdomen est généralement une grande surface qui permet une certaine souplesse pour des résultats uniformes. En outre, l’abdomen a une chevelure clairsemée que la face dorsale de la souris et permet donc une lecture de température de corps plus précise.
Deuxièmement, pattes doivent toujours surveiller lors de la prise d’une mesure de la température. Lorsque le thermomètre se trouve à proximité de l’abdomen, les souris ont tendance à placer leurs pieds sur le thermomètre lui-même. Lorsque les pieds ou les orteils sont trouvent la circonférence du capteur, la lecture de la température peut être inférieure à celle de l’abdomen, comme illustré dans la vidéo 4. Il est important de laisser la souris à chevaucher avec ses pieds de chaque côté du capteur, tout en gardant la circonférence exempte de parties du corps ou des objets en dehors de la surface abdominale.
Troisièmement, les surfaces abdominales de souris ne peut pas être mouillés lors de la prise des mesures. Une surface mouillée modifiera capacité le thermomètre pour mesurer la température avec précision ; habituellement, la température sera inférieure à la valeur réelle. Ce problème peut être évité en gardant les souris dans des cages avec des litières fraîches au cours de la période d’observation. Cela garantit également que le degré de séchage de la surface abdominale est normalisé à chaque fois que les températures sont mesurées.
Enfin, les thermomètres infrarouges ont une plus grande marge d’erreur de sondes rectales, quoique seulement légèrement. La marge d’erreur pour les mesures avec sondes rectales est ± 0,1 ° C, tandis que pour les thermomètres infrarouges, il est de ± 0,2 ° C. Cette marge d’erreur est minime par rapport à la différence générale en baisse de température entre les populations dans l’expérience PSA. Plus important encore, un projet nécessitant une différence aussi subtile que ± 0,1 ° C peut également prévoir autre marge des enjeux de l’erreur, indépendamment de savoir si un thermomètre infrarouge ou la sonde rectale est utilisé. Lors de l’élaboration du présent protocole, il avait également été démontré qu’il y a une très bonne corrélation entre température corps mesurée par transpondeurs implantables température et température de surface de corps mesurée par les thermomètres infrarouges pendant hypothermie induite par le lipopolysaccharide6.
Chute de température dans le modèle d’allergie alimentaire utilisé n'avait pas été observée auparavant8,10. La norme d’évaluation était auparavant pour déterminer la sévérité du phénotype en marquant de diarrhée ; Toutefois, cette méthode manquait d’objectivité. En utilisant le thermomètre infrarouge, nous avons montré que la température subtile des gouttes peuvent être décelées. Nous étions alors en mesure de mettre en corrélation avec les niveaux d’activité, comme les souris n’étaient pas anesthésiés au cours de la procédure. Cette méthode permet un rapide, précis, facile à utiliser, non invasif et peu coûteux moyen mesurer la température corporelle chez la souris tout en étant en mesure d’observer les autres phénotypes qui seraient incomprises par ailleurs si les souris sont anesthésiés pour les mesures de la sonde rectale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Subventions de recherche dans le Kawakami lab a été pris en charge par les NIH : R01 AR064418-01 a 1, R01 HL124283-01, R21 AI 115534-01 et R41AI124734-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-contact infrared thermometer | SinoPie | DT-8861 | |
| Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE | Sigma Aldrich | D8406-.2MG | |
| PrecisionGlide 30 G needle | BD | 305128 | |
| PrecisionGlide 26 G needle | BD | 305111 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| Dinitrophenyl - human serum albumin | Biosearch Technologies | D-5059-10 | |
| Ovalbumin from chicken egg white | Sigma Aldrich | A5503-50G | |
| Imject Alum | ThermoFisher Scientific | 77161 | |
| Animal Feeding Needles, disposable | Fisher Scientific | 01-208-87 |
References
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