Musen krop temperaturmåling ved hjælp af infrarøde termometer under passiv systemisk anafylaksi og mad allergi evaluering

Summary

Her præsenterer vi en ny metode til nøjagtigt at måle kroppens temperaturforskelle i passiv systemisk anafylaksi (PSA) og mad allergi musemodeller ved hjælp af et infrarødt termometer. Denne procedure har været præcist duplikeret i tidligere PSA resultater.

Abstract

Musen krop temperaturmåling er af afgørende betydning for at undersøge allergier og anafylaktisk symptomer. Rektal sonder til temperaturmålinger er fælles, og de har bevist for at være nøjagtige og uvurderlige i denne henseende. Denne metode til temperaturmåling kræver imidlertid mus at blive bedøvede for at indsætte sonde uden skade for dyret. Dette begrænser evnen til at iagttage andre fænotyper af musen samtidigt. For at undersøge andre fænotyper mens måle temperaturer, rektal sonder er ikke ideel, og en anden metode ønskes. Her introducerer vi en invasiv metode af temperaturmåling, der foregoes krav til musen anæstesi samtidig opretholde lige pålidelighed til rektal sonder i måling af kropstemperaturen. Vi bruger en infrarødt termometer, der registrerer krop overfladetemperaturer på afstande mellem 2 og 150 mm. Denne metode af kroppen temperaturmåling er vellykket i pålideligt replikerende temperatur ændring tendenser under passivt system anafylaksi eksperimenter i mus. Vi viser, at kroppen overfladetemperatur er omkring 2,0 ° C lavere end rektal sondens målinger, men graden af temperaturfald følger den samme tendens. Derudover bruger vi den samme teknik til at observere mus i en fødevare allergi model at evaluere temperatur og aktivitet niveauer samtidigt.

Introduction

Måling af kropstemperaturen har været en væsentlig del af overvågning af virkningerne af anafylaktisk symptomer i dyre modeller^1,2. Temperaturforskelle er traditionelt blevet målt ved rektal sonde termometre i mus^3,4. Med disse målinger, har efterforskere pålideligt portrætteret forskelle i temperatur mellem variabler; men denne metode er en tidskrævende procedure og forårsager nød til mus, som kan øge kroppens kernetemperatur. Rektal sondering kan også forårsage slimhinde tåreflåd og infektion³. Desuden, musene bør være bedøvede for humant indsætte den rektal sonde til at måle temperatur³. Dette er en langsom proces, og det forbyder måling af successive temperaturer inden for en kort periode. Derudover observeres mus aktivitet fænotyper ikke i løbet af denne tid indtil narkose er helt slidt ud, hvilket er en tidskrævende proces. Mere nylig, andre pålidelige metoder til at måle kropstemperaturen har brugt subkutant implanterede passiv infrarød transponder tags eller radiosendere, der omfatter en temperatur sensor^3,5,6. Selv om de er accepteret som den ideelle praksis af nogle forskere, er disse metoder ikke almindeligt anvendt på grund af høje indledende omkostninger og nød til mus, på grund af kirurgisk implantation af en temperaturføler under huden eller en anden del af kroppen.

For at vise, at en temperaturforskel er en nøjagtig afspejling af symptomer på en sygdom model^1,2, skal mus være vågen under temperaturmåling og være i stand til at vende tilbage til deres normale fænotypiske aktivitet umiddelbart før og efter måling. Med henblik herpå søgte vi en metode, hvormed det kan opnås.

Vores mål var at præcist og billigt måle mus kropstemperatur, uden behov for anæstesi og uden restriktioner på aktivitet, at muliggøre observation af adfærdsmæssige fænotyper under og efter tidspunktet for temperaturmåling. For at nå dette mål, var det tydeligt, at en mindre invasiv teknik end den standard rektal temperatur sonder var påkrævet. Infrarøde termometre har været brugt i årtier i klinisk medicin, især i pediatrics, for at opnå præcise temperaturmålinger. Det har været en alternativ metode, der har tilladt klinikere hurtigt og nøjagtigt hente temperaturmålinger i spædbørn og kræsne børn, der er aktivt mobile. Vi gennemført denne samme teknik i mus og har udviklet en succesfuld metode til at opnå temperaturer uden bedøvelse. Vigtigere er, viser vi, at denne metode er i stand til at replikere veletablerede passiv systemisk anafylaksi resultater med hensyn til ændringer i temperatur, mens også være i stand til at observere aktiviteten af musen hele målingen. Desuden bruger vi samme metode til at evaluere krop temperaturer på mad-allergisk mus, mens samtidig at undersøge andre symptomer, for at vise, at kropstemperaturen er faktisk en nøjagtig afspejling af aktivitetsniveauet og samlede Fænotypen af den musen.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care og brug Udvalget af La Jolla Institute for allergi og Immunologi.

1. mus kroppen temperaturmåling under Anesthetization

1. Placer musen på en anæstesi induktion boks. Bedøver ved hjælp af 1 L/min. flow af ilt med 5% isofluran.
   Bemærk: Anesthetization er bekræftet, når musen ophører med frivillig bevægelse og har været immobile for over 30 s. Alternativt monitor respirationsfrekvens, og når mus vejrtrækning på 1 ånde pr. hver 2 s eller længere, anesthetization er bekræftet.
2. Hold musen i nakken med en pegefinger og tommelfinger og holde halen med en pinky finger for at udsætte den nedre abdomen.
3. Placer den infrarøde termometer sensor nedenfor underlivet mens du holder musen med sin krop parallelt med jorden.
   Bemærk: Den ydre flade del af termometer (ikke overfladen af sensoren) skal være ca 2-5 mm fra overfladen af maven. Denne Repliker resultaterne af temperaturer målt mens mus ikke er bedøvede (beskrevet i afsnit 2). Det er vigtigt at fastlægge målwebstedet af maven. Sigter mellem to øverste brystvorter giver ensartede resultater.
4. Hold triggeren nede for at måle temperaturen. Sikre stabile afholdelsen af mus og termometer.

2. mus kroppen temperaturmåling uden bedøvelse

1. Afhente musen i midten af halen.
2. Udsætte maven af musen.
   1. Tillad musen til at holde på en straight-kant overflade, såsom læbe af en åben bur eller bur-top med sin forepaws.
      Bemærk: Dette giver musen for at strække sin overkrop og udsætte maven.
   2. Alternativt tillade musen til at holde på den øvre lige kant af termometeret, og gør musen sidde på den ydre flade del af termometeret med sit underliv lidt over den infrarød sensor.
      Bemærk: Enhver tid bagpoterne hviler på overfladen af termometeret, sikre, at fødderne ikke blokerer sensoren fra den abdominale overflade. Termometre med foden obstruktion vil måle en lavere temperatur end i maven.
3. Hold triggeren nede for at måle temperaturen.
   Bemærk: Mus har tendens til at flytte; tage sig i at måle den samme placering af kroppen konsekvent ved at tage temperaturmålinger, når musene er relativt mindre mobile.

3. passive systemisk anafylaksi⁷

1. Dag 0: Bevidstgøre med immunglobulin E (IgE).
   1. Forberede 200 µL (pr. mus) af anti-dinitrophenyl (DNP) IgE ved en koncentration på 100 µg/mL i PBS.
   2. Intraperitoneal injicere 200 µL af anti-dinitrophenyl (DNP) IgE udarbejdet i trin 3.1.1 eller PBS kun (PBS-kun er den negative kontrol). Bruge en 26 G kanyle til injektion. Udføre injektioner lige lateralt for midterlinjen, ca mellem de to mest ringere brystvorter.
2. Dag 1: Fremkalde anafylaksi med DNP-HSA.
   1. Forberede 100 µL (pr. mus) af DNP-HSA ved en koncentration på 10 mg/mL i 0,9% NaCl.
   2. Bedøver musene, som beskrevet i trin 1.1.
   3. Måle kropstemperaturen ved hjælp af den teknik beskrevet i trin 1.
   4. Intravenøst indsprøjtes 100 µL af DNP-HSA forberedt i trin 3.2.1. Brug 30 G nål til injektion. Udføre injektionerne på retroorbital venøse sinus. Indsætte nålen på den mediale side af øjet i en flad vinkel, sigter bag øjet.
   5. Efter injektion, skal du placere mus i individuelle bure. Sikre, at musene tilbagesøge anæstesi. Observere at de vågne op og blive frivilligt mobile.
   6. Måle krop temperaturer ved hjælp af den infrarøde termometer og observere deres aktivitet hver 10 min for 70 min.

4. musemodel af mad allergi^8,9

Bemærk: Skematiske vist i figur 2.

1. Dag 0: Bevidstgøre mus med æg/alun.
   1. Forberede 100 µL (pr. mus) af æg (0,5 mg/mL) og alum (10 mg/mL) i PBS. Vortex på den simpel nedgang i 30 min.
   2. Bedøver musene, som beskrevet i trin 1.1.
   3. Bruger en 26 G kanyle, intraperitoneal indsprøjtes hver mus med 100 µL af æg/alun blanding forberedt i trin 4.1.1.
      Bemærk: Vortex æg/alun blandingen igen, kort før hver injektion, man bedst sikre en homogeniseret blanding. Se trin 3.1.3 for detaljer på injektionsstedet.
   4. Efter injektion, skal du placere mus tilbage i deres oprindelige bure. Sikre, at musene tilbagesøge anæstesi. Observere at de vågne op og blive frivilligt mobile.
2. Dag 14: Udføre en anden sensibilisering med æg/alun.
   1. Gentag trin 4.1.1, 4.1.2 og 4.1.3.
3. Dage 28-46: udfordre mus med æg hver anden dag.
   1. Forberede 100 µL (pr. mus) af æg ved en koncentration på 250 mg/mL i PBS.
      Bemærk: Blandingen bør foretages af blidt rokkende frem og tilbage i hånden i stedet for med en vortex at minimere boble dannelse.
      1. Hvis du bruger mad allergi hæmmere, forberede hæmmere⁹. Forberede 100 µL (pr. mus) af inhibitor i en koncentration på 1 mg/mL i PBS. Dette giver mulighed for en levering af 100 µg af inhibitor til hvert mus.
         Bemærk: Ikke overstige 100 µL af inhibitor pr. mus, som musene er kun i stand til at håndtere 200 µL af samlede sonde volumen under en udfordring dag. 100 µL er nødvendige for æg udfordring samt, er 100 µL den maksimale anbefalede volumen for hæmmer skik.
   2. Bedøver musene, som beskrevet i trin 1.1.
   3. Mundtligt sonde hver mus med 100 µL af æg løsning (25 mg af æg i 100 µL af PBS gavaged pr. mus), som blev udarbejdet i trin 4.3.1.
      1. Hvis du bruger hæmmere, Udnyt de samme teknikker beskrevet i de følgende trin til sonde af inhibitor (eller PBS kontrol) udarbejdet i trin 4.3.1.1 30 minutter før æg udfordring. Efter 30 min, gå videre til næste trin.
      2. Bruge en sonde nål med en 1 mL sprøjte. Tage op 100 µL af æg ind i sprøjten.
      3. Indsætte nålen ind i munden; derefter peger nål mod venstre eller højre side af halsen, blidt skub nål gennem spiserøret. Indsprøjtes 100 µL af æg.
         Bemærk: For at sikre, at nålen ikke er i luftrøret, observere aktiv vejrtrækning før injektion i æg. Indsættelse af nålen vil også blive modstået tidligt hvis det er angivet i luftrøret frem for spiserøret.
   4. Placere mus i deres individuelle bure. For nem observation af afføring kvalitet, brug bure uden strøelse.
   5. Sikre inddrivelse fra anæstesi. Observere at musene genopstå og blive frivilligt mobile.
   6. Måle krop temperaturer på mus timepoints 10, 20, 40 og 60 min. ved hjælp af den teknik beskrevet i afsnit 2.

Representative Results

Passiv systemisk anafylaksi: til iv injektion, 10 uger gammel BALB/c hunmus blev bedøvede. Før injektion målte vi deres krop temperaturer (Video 1) som beskrevet i trin 1. Figur 1 viser temperatur-trenden for begge populationer efter iv injektion. IgE-sensibiliseret mus viste en maksimal temperaturfald på 3,0 ° C i 20 min, mens PBS kontrol mus havde en maksimal dråbe 1,1 ° C i 20 min.⁷. Desuden i hele denne proces, blev aktivitet score evalueret baseret på mobilitet for hver mus. Mus blev første gang observeret uden nogen agitation. Derefter blev de observeret med agitation ved at indføre evalueringsekspertens hånden ind i buret og gøre blød kontakt med musen. Baseret på deres reaktioner, er musene evalueret og scoret på en skala fra 1 til 3. En score på 1 angiver en mus, der er immobile eller minimalt mobile med og uden agitation; en score på 2 angiver en mus, der er immobile uden agitation og mobile med agitation uden at foretage hurtig undvigende bevægelser; og en score på 3 angiver en mus, der er mobile eller immobile uden agitation og mobile med agitation og gør hurtig undvigende bevægelser. Videoer 2 og 3 give eksempler på de to grupper, der eksemplificerer temperatur måling metoder samt de tilsvarende aktivitet niveau målinger. Brugen af infrarøde termometer tilladt for temperaturmålinger uden bedøvelse, hvilket igen tilladt for adfærdsmæssige fænotype evaluering før, under og efter temperaturmåling; Derimod ville en traditionel rektal sonde kræver anæstesi og derfor udelukker enhver adfærdsmæssige evaluering inden for flere minutter omgivende temperaturmålinger.

Musemodel af mad allergi⁸: skematisk af musen model er vist i figur 2. Mus er BALB/c hunmus af aldre 8-10 uger gammel på tidspunktet for sensibilisering. Mus blev observeret på 10, 20, 40 og 60 min. efter hver udfordring for kroppens temperatur og aktivitet. Et repræsentativt resultat er vist i figur 3 forandringens temperatur under challenge 7. Mus viste en maksimal temperaturfald på 10 min. Derfor, 10 min temperaturer blev brugt til at korrelere med krop temperaturer på 10 min. aktivitetsniveauer (med score baseret på de kriterier, der er afbildet ovenfor). Aktivitet score og temperatur drop viste en statistisk signifikant sammenhæng (figur 4). Som nævnt i afsnittet passiv systemisk anafylaksi, adfærdsmæssige observationer blev udført på grund af manglende anæstesi, og den infrarøde termometer blev udnyttet. Derimod ville rektal sonder foregribe eventuelle adfærdsmæssige observationer eller evalueringer i løbet af temperaturmåling. Enhver tid, temperatur og andre aktivitet fænotyper skal registreres, det er vigtigt at udnytte en måling af temperatur system, der ikke kræver bedøvelse.

Figur 1 : Passiv systemisk anafylaksi i BALB/c mus. To mus blev ip injiceres med anti-DNP IgE på dag 0, derefter iv injiceret med enten normale saltvand eller DNP-HSA på dag 1. Kroppens temperatur blev målt ved hjælp af et infrarødt termometer før injektion og hver 10 min efter injektion til 70 min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Mad allergi musen model skematisk. På dag 0 var BALB/c mus overfølsomme over ip med æg og alum, og igen på testens 14. Dag 28, 30 min før hver udfordring, mus var oralt gavaged med enten PBS kontrol eller en fødevare allergi inhibitor (HRF-2CArecombinant histamin-releasing faktor med sine to cysteines udveksles med alanines)⁹. Mus blev derefter udfordret ig med 25 mg af æg. Udfordringer blev udført hver anden dag for 9 udfordringer. Mus blev observeret for kroppen temperaturmåling og aktivitet score på 10, 20, 40 og 60 min. efter udfordringen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Mad allergi model i BALB/c mus. Temperaturen ændre efter 7 æg udfordringen blev overvåget af infrarødt termometer. Typiske resultater er vist fra mindst fire uafhængige eksperimenter (**, p < 0,01 mellem PBS og 2CA behandlinger af Student's t-test; ns: ikke signifikant). Fejllinjer = SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Sammenhæng mellem aktivitet og temperaturen på 10 min i mad allergi eksperimenter. Resultaterne afspejler maalinger fra 4 separate sæt af eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: legeme temperaturmåling, mens mus er bedøvede. Mus krop temperaturmålinger kan tages med eller uden bedøvelse. Sammenhængende målinger er det vigtigt at tilstræber altid termometer på den samme krop placering. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 2: aktivitetsniveau på 40 min. efter DNP-HSA iv injektion. Mus er observeret uden agitation i første omgang, derefter med agitation. Baseret på deres reaktioner, blev musene evalueret og scorede på en aktivitet skala fra 1 til 3. Musen til venstre (anti-DNP overfølsomme over musen) er givet en score på 1, mens musen til højre (PBS kontrol mus) er givet en score på 3. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 3: Body temperaturmåling på 40 min. efter DNP-HSA iv injektion. Denne figur viser evne til den infrarøde termometer til præcist og måler noninvasively kropstemperaturen uden anesthetization. Desuden afspejler aktivitet score demonstreret i Video 2 graden af temperaturfald målt i denne video. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 4: fejl i temperaturmåling af hind paw obstruktion af sensoren. Denne video viser forskellen i temperaturer med og uden at foden inden for sensor omkreds. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

Protokollen beskrevet blev etableret med formålet at måle kropstemperaturen uden brug af anæstesi. Trods sin relative lethed med hvilken temperatur målinger kan fås, er der flere forbehold, at rumme denne teknik, ud over de mere oplagte effekter såsom håndtering af stress og forskellige omgivende temperaturer.

Først, for at opretholde konsekvent temperaturmålinger i hele forsøget, det sted, hvor temperaturen måles skal være forudbestemt ved hjælp af anatomiske landemærker, og efterforskere skal være i stand til at replikere måling af nævnte organ beliggenhed. Ved at sikre musens forepaws på en straight-kant overflade, såsom læbe af et bur eller kanten af termometeret, er maven let udsat for den infrarøde sensor af termometeret. Maven er generelt et stort overfladeareal, der giver mulighed for fleksibilitet for ensartede resultater. Derudover maven har sparsommere hår end den dorsale overflade af musen, og derfor giver mulighed for en mere præcis krop temperatur læsning.

For det andet skal bagpoterne altid overvåges, når du tager en temperaturmåling. Når termometeret er tæt på maven, mus har en tendens til at placere deres fødder på termometeret, selv. Når fødder eller tæer er inden for omkredsen af sensoren, kan temperatur læsning være lavere end for maven, som demonstreret i Video 4. Det er vigtigt at give mus til straddle med sine fødder på hver side af sensoren, samtidig holde omkreds fri for enhver kropsdele eller objekter udover den abdominale overflade.

For det tredje kan ikke de abdominale overflader af mus være våd, når de måltagning. En våd overflade vil ændre termometers evne til at måle temperatur præcist; normalt, vil den målte temperatur være lavere end den faktiske værdi. Dette problem kan undgås ved at holde mus i bur med frisk sengetøj i løbet af perioden observationelle. Dette sikrer også, at tørhed af abdominal overfladen er standardiseret hver gang temperaturen måles.

Endelig, infrarøde termometre har en større margin for fejl end rektal sonder, omend kun lidt. Fejlmargin til målinger med rektal sonder er ± 0,1 ° C, til infrarøde termometre, det er ± 0,2 ° C. Denne margen af fejl var minimal sammenlignet med temperaturfald samlede forskellene mellem befolkningerne i PSA eksperiment. Endnu vigtigere, et projekt der kræver en forskel så subtil som ± 0,1 ° C kan også forudse andre margenen af fejl spørgsmål, uanset om et infrarødt termometer eller rektal sonde bruges. Under udarbejdelsen af denne protokol, havde det også været vist at der er en meget god sammenhæng mellem krop core temperaturer målt af implantabelt temperatur transpondere og krop overflade temperaturer målt ved infrarøde termometre under LPS-induceret hypotermi⁶.

Temperaturfald i modellen mad allergi bruges havde ikke været observeret tidligere^8,10. Standard for evaluering havde tidligere været at bestemme fænotype sværhedsgraden af diarré scoring; men denne metode manglede objektivitet. Ved hjælp af den infrarøde termometer, vi viste at subtile temperaturen kunne dråber påvises. Vi kunne derefter at korrelere disse med aktivitetsniveau, som musene ikke var bedøvede under proceduren. Denne metode giver mulighed for en hurtig, nøjagtig, nem at bruge, noninvasive og billigt måde at måle kropstemperaturen i mus samtidig være i stand til at iagttage andre fænotyper, der ellers ville blive savnet, hvis musene er bedøvede ved rektal sondens målinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-contact infrared thermometer	SinoPie	DT-8861
Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
PrecisionGlide 30 G needle	BD	305128
PrecisionGlide 26 G needle	BD	305111
1 mL syringe	BD	309659
Dinitrophenyl - human serum albumin	Biosearch Technologies	D-5059-10
Ovalbumin from chicken egg white	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
Animal Feeding Needles, disposable	Fisher Scientific	01-208-87