Musen måling av kroppstemperatur bruke infrarød termometer under passiv systemisk anafylaksi og mat allergi evaluering

Summary

Her presenterer vi en ny metode for å måle kroppen temperaturforskjeller i passiv systemisk anafylaksi (PSA) og mat allergi musen modeller med en infrarød termometer. Denne prosedyren har vært nøyaktig dupliseres i forrige PSA resultater.

Abstract

Musen måling av kroppstemperatur er av avgjørende betydning for å undersøke allergier og anafylaktisk symptomer. Rektal sonder for temperaturavlesninger er vanlig, og de har vist seg for å være nøyaktig og uvurderlig i denne forbindelse. Denne metoden for temperaturmåling krever imidlertid at mus til å være anesthetized for å sette inn sonden uten skade dyr. Dette begrenser muligheten til å observere andre fenotyper museklikk samtidig. For å undersøke andre fenotyper mens å måle temperaturer, rektal probes er ikke ideelt, og en annen metode er ønsket. Her introduserer vi en noninvasive metode for temperaturmåling som foregoes kravet for musen anestesi samtidig opprettholde samme påliteligheten til rektal sonder måle kroppstemperatur. Vi bruker en infrarød termometer som oppdager kroppen overflatetemperaturer på områder mellom 2 og 150 mm. Denne metoden for måling av kroppstemperatur er vellykket i pålitelig replikere temperatur endring trender under passivt system anafylaksi eksperimenter i mus. Vi viser at kroppen overflatetemperaturer rundt 2.0 ° C lavere enn endetarms sonde målinger, men graden av temperatur dråpe følger den samme trenden. Videre bruke vi samme teknikk for å observere mus i en mat allergi modell å evaluere temperatur og aktivitet nivåer samtidig.

Introduction

Måling av kroppstemperatur har vært en viktig del av å overvåke effekten av anafylaktisk symptomer i dyr modeller^1,2. Temperatur har tradisjonelt vært målt ved endetarms sonde termometre i mus^3,4. Med disse målingene, har etterforskere pålitelig portrettert forskjeller i temperatur mellom variabler; men denne metoden er en tidkrevende prosedyre og forårsaker smerte til mus, som kan øke kroppstemperaturen kjernen. Rektal undersøkelser kan også forårsake mucosal rive og infeksjon³. Videre bør musene være anesthetized for å Human sette inn endetarms sonden å måle temperaturen³. Dette er en langsom prosess, og den forbyr måling av påfølgende temperaturer i en kort periode. Videre kan mus aktivitet fenotyper observeres i denne perioden før anesthetic er helt slitt av, som er en tidkrevende prosess. Andre pålitelige metoder for å måle kroppstemperatur har nylig brukt subcutaneously implantert Passiv Infrarød transponder koder eller radiosendere med en temperatur sensor^3,5,6. Selv om de blir akseptert som det ideelle av noen forskere, brukes ikke disse metodene mye på grunn av høye innledende kostnader og nød å mus, på grunn av kirurgiske implantering av en temperatursensor under huden eller en annen del av kroppen.

For å vise at en temperaturforskjell er en nøyaktig refleksjon av symptomene på en sykdom modell^1,2, må mus være våken under temperaturmåling og kunne gå tilbake til sine normale fenotypiske aktivitet like før og etter måling. Dette søkte vi en metode som dette kan oppnås.

Målet vårt var å presist og inexpensively måle musen kroppstemperatur, uten behov for anestesi og uten restriksjoner på aktivitet, aktivere observasjon av atferdsmessige fenotyper under og etter temperaturmåling. For å oppnå dette målet, ble det klart at en teknikk mindre invasiv enn standard endetarms temperatur sonder var nødvendig. Infrarød termometer har blitt brukt i flere tiår i klinisk medisin, spesielt i pediatri, for å få nøyaktig temperatur målinger. Det har vært en alternativ metode som har tillatt klinikere å raskt og nøyaktig få temperaturmålinger hos spedbarn og masete barn som er aktivt mobile. Vi implementert denne samme teknikken i mus og har utviklet en vellykket metode for å få temperaturer uten bedøvelse. Viktigere, viser vi at denne metoden er i stand til å replikere veletablerte passiv systemisk anafylaksi resultatene om temperaturendringer, samtidig være stand til å observere aktiviteten av musen gjennom måling. Videre, vi bruker samme metode for å vurdere kroppen temperaturer på mat-allergisk mus, og samtidig også andre symptomer, for å demonstrere at kroppstemperatur er faktisk en nøyaktig refleksjon av aktivitetsnivået og generelle fenotypen av den musen.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Care og bruk komité i La Jolla Institutt for allergi og immunologi.

1. musen måling av kroppstemperatur under Anesthetization

1. Plass musen i en bedøvelse induksjon boksen. Bedøve ved hjelp av 1 L/min strømmen av oksygen med 5% isoflurane.
   Merk: Anesthetization er bekreftet når musen slutter frivillig bevegelse og har vært immobile for over 30 s. eventuelt skjermen pustefrekvens, og når mus puster på 1 pusten per hver 2 s eller lenger, anesthetization er bekreftet.
2. Hold musen i nakken med pekefingeren og tommelen og holder halen med en pinky finger slik at nedre del av magen.
3. Plass infrarød termometer sensoren under nedre del av magen mens du holder musen med kroppen parallelt med bakken.
   Merk: Flat ytterveggen termometeret (ikke overflaten av sensor) skal være ca 2-5 mm fra overflaten av magen. Denne Repliker resultatene av temperaturer målt mens mus ikke er anesthetized (beskrevet i § 2). Det er viktig å bestemme målområdet av magen. Sikter mellom to øvre brystvortene gir konsistente resultater.
4. Hold avtrekkeren å måle temperaturen. Sikre stabil holde musen og termometer.

2. musen måling av kroppstemperatur uten bedøvelse

1. Plukke opp musen ved midten av halen.
2. Utsett magen av mus.
   1. La musen for å holde på en rett kant overflate, for eksempel av en åpne buret eller bur-topp med sin forepaws.
      Merk: Dette lar musen til å strekke sine overkroppen og utsette magen.
   2. Alternativt kan musen for å holde på den øvre rett kanten av termometer, og gjøre musen sitte på flat ytterveggen termometer med buken drøyt sensoren.
      Merk: Når bakben paws hviler på overflaten av termometeret, sikre at føttene ikke hindre sensoren fra abdominal overflaten. Termometre med foten obstruksjon måler en temperatur lavere enn for magen.
3. Hold avtrekkeren å måle temperaturen.
   Merk: Mus pleier å flytte; ta vare på måling på samme sted kroppen konsekvent ved å ta temperaturmålinger når mus er relativt mindre mobile.

3. passiv systemisk anafylaksi⁷

1. Dag 0: Sensitize med immunglobulin E (IgE).
   1. Forberede 200 µL (per mus) av anti-dinitrophenyl (DNP) IgE i en konsentrasjon av 100 µg/mL i PBS.
   2. Intraperitoneally injisere 200 µL av anti-dinitrophenyl (DNP) IgE utarbeidet i trinn 3.1.1 eller PBS bare (PBS-bare er kontrollen negative). Bruk en 26 G nål for injeksjon. Utføre injeksjoner bare lateralt midtlinjen, ca mellom to mest dårligere brystvorter.
2. Dag 1: Indusere anafylaksi med DNP-HSA.
   1. Forberede 100 µL (per mus) av DNP-HSA i en konsentrasjon av 10 mg/mL i 0,9% NaCl.
   2. Bedøve musene som beskrevet i trinn 1.1.
   3. Mål kroppstemperaturen bruker teknikken er beskrevet i trinn 1.
   4. Intravenøst injisere 100 µL av DNP-HSA forberedt i trinn 3.2.1. Bruk en 30 G nål for injeksjon. Utføre injeksjoner på retroorbital venøs sinus. Sett inn nålen på medial side av øyet i grunt vinkel, sikter bak øyet.
   5. Etter injeksjon, plassere musene i individuelle bur. Kontroller at mus gjenopprette bedøvelsen. Observere at de vekke og bli frivillig transportabel.
   6. Måle kroppen temperaturer bruke infrarød termometer og observere deres aktivitet hvert 10 min for 70 min.

4. mus modell av mat allergi^8,9

Merk: Skjematiske er vist i figur 2.

1. Dag 0: Sensitize mus med OVA/alum.
   1. Forberede 100 µL (per mus) OVA (0,5 mg/mL) og Alun (10 mg/mL) sammen på PBS. Vortex på lav innstilling i 30 min.
   2. Bedøve musene som beskrevet i trinn 1.1.
   3. Bruker en 26 G nål, intraperitoneally injisere hver musen med 100 µL av OVA/Alun blandingen i trinn 4.1.1.
      Merk: Vortex OVA/Alun blandingen igjen, kort før hver injeksjon, til beste sikre en homogenisert blanding. Se trinn 3.1.3 for detaljer på injeksjonsstedet.
   4. Etter injeksjon, plassere mus i deres opprinnelige burene. Kontroller at mus gjenopprette bedøvelsen. Observere at de vekke og bli frivillig transportabel.
2. Dag 14: Utfør en andre sensibilisering med OVA/alum.
   1. Gjenta 4.1.1, 4.1.2 og 4.1.3.
3. Dager 28-46: utfordre mus med OVA annenhver dag.
   1. Forberede 100 µL (per mus) av OVA i en konsentrasjon av 250 mg/mL i PBS.
      Merk: Blandingen bør gjøres av forsiktig rocking frem og tilbake for hånd enn med en vortex å minimere boble formasjon.
      1. Hvis bruker mat allergi hemmere, forberede hemmere⁹. Forberede 100 µL (per mus) av hemmer i en konsentrasjon av 1 mg/mL i PBS. Dette gir en levering av 100 µg av inhibitor for hver musen.
         Merk: Ikke overstige 100 µL av hemmer per mus, mus er bare håndtere 200 µL av totalt gavage volum dagtid en utfordring. Som 100 µL er nødvendig for OVA challenge også, er 100 µL maksimal anbefalt volum for hemmer behandling.
   2. Bedøve musene som beskrevet i trinn 1.1.
   3. Muntlig gavage hver musen med 100 µL OVA løsningen (25 mg av OVA i 100 µL av PBS gavaged per mus) som ble utarbeidet i trinn 4.3.1.
      1. Hvis bruker hemmere, bruke samme teknikkene som beskrives i følgende trinn for gavage hemmer (eller PBS kontroll) utarbeidet i trinn 4.3.1.1 30 minutter før OVA utfordringen. Etter 30 min, kan du gå videre til neste trinn.
      2. Bruk en gavage nål med en 1 mL sprøyte. Tar opp 100 µL av OVA i sprøyten.
      3. Sette inn nålen inn i munnen; deretter peker nålen mot venstre eller høyre side av halsen, skyv nålen gjennom spiserøret. Sette inn 100 µL av OVA.
         Merk: For å sikre at nålen ikke er i luftrøret, observere aktive puste før injisere OVA. Innsetting av nålen vil også bli motstått tidlig Hvis den har blitt luftrøret i stedet for spiserøret.
   4. Plass musene i deres individuelle bur. For enkel observasjon av avføring kvalitet, bruke burene uten sengetøy.
   5. Sikre utvinning fra anestesi. Observere at mus vekke og bli frivillig transportabel.
   6. Måle kropp temperatur av mus timepoints 10, 20, 40 og 60 minutter ved hjelp av teknikken beskrevet i del 2.

Representative Results

Passiv systemisk anafylaksi: For iv injeksjon, 10 uke gamle kvinnelige BALB/c mus var anesthetized. Før injeksjon målte vi deres kropp temperatur (Video 1) som beskrevet i trinn 1. Figur 1 viser temperaturen trenden i populasjonene etter iv injeksjon. IgE-sensitivisert musen viste en maksimum temperatur dråpe 3.0 ° C på 20 minutter, mens PBS kontroll musen hadde en maksimal dråpe 1.1 ° C på 20 min⁷. Videre i denne prosessen ble aktivitet score vurdert basert på mobilitet for hver musen. Mus ble først observert uten noen agitasjon. Da var de observert med agitering ved presenterer evaluator's hånd i buret og myk kontakt med musen. Basert på deres reaksjoner, musene evalueres og scoret på en skala fra 1 til 3. En score på 1 angir en mus som er immobile eller minimal mobil med og uten agitering; en score på 2 angir en mus som er immobile uten agitering og er mobil med agitering uten å gjøre rask unnvikende bevegelser; og en score på 3 angir en mus som er enten mobil eller immobile uten agitering og mobile med agitasjon og gjør rask unnvikende bevegelser. Videoer 2 og 3 gir eksempler på de to gruppene som eksemplifiserer målemetoder temperatur samt tilsvarende aktivitet nivå målinger. Bruk av infrarød termometer tillatt for temperaturmålinger uten bedøvelse, som i sin tur tillot atferdsmessige fenotypen evaluering før, under og etter temperaturmåling; derimot vil en tradisjonell endetarms sonde krever narkose og derfor utelukker eventuelle atferdsproblemer vurdering innen minuttene rundt temperaturmålinger.

Musemodell av mat allergi⁸: skjematisk av musemodell er vist i figur 2. Mus er kvinnelige BALB/c mus i alderen 8-10 uker gammel på tidspunktet for allergi. Mus ble observert på 10, 20, 40 og 60 min etter hver utfordring for kroppstemperatur og aktivitet. En representant resultatet blir vist i Figur 3 temperatur endring under challenge 7. Mus viste maksimal temperatur dråpe på 10 min; 10 min temperaturene ble derfor brukt å korrelere med kroppen temperaturer på aktivitetsnivå 10 min (med scoring basert på kriteriene avbildet ovenfor). Aktivitet score og temperaturen slipp viste en statistisk signifikant sammenheng (Figur 4). Som nevnt i delen passiv systemisk anafylaksi, atferdsmessige observasjoner ble utført på grunn av mangel på anestesi, og det infrarød termometeret ble benyttet. Derimot vil endetarms sonder forkjøpet noen atferdsdata observasjoner eller vurderinger i løpet av temperaturmåling. Helst som temperatur og annen aktivitet fenotyper må registreres, er det viktig å bruke en-måler system som ikke krever narkose.

Figur 1 : Passive systemisk anafylaksi i BALB/c mus. To mus var ip injisert med anti-DNP IgE dag 0, så iv injisert med vanlig saltvann eller DNP-HSA på dag 1. Kroppstemperatur ble målt ved hjelp av en infrarød termometer før injeksjon og hvert 10 min etter injeksjon for 70 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Mat allergi mus modell skjematisk. På dag 0 var BALB/c mus sensitivisert ip med OVA og Alun, og igjen på dag 14. På dag 28, 30 min før hver utfordring, mus var muntlig gavaged PBS kontroll eller en mat allergi hemmer (HRF-2CArecombinant histamin-slippe faktor med sine to cysteinene med alanines)⁹. Mus ble deretter utfordret ig med 25 mg av OVA. Utfordringer ble utført annenhver dag 9 utfordringer. Mus ble observert for måling av kroppstemperatur og aktivitet scoring på 10, 20, 40 og 60 min etter utfordringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Mat allergi modell i BALB/c mus. Temperatur endre etter 7 OVA utfordringen ble overvåket av infrarød termometer. Typiske resultater vises fra minst fire uavhengige eksperimenter (**, p < 0,01 mellom PBS og 2CA behandlinger av Student t-test; ns: ikke signifikant). Feilfelt = SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Sammenhengen mellom aktivitet og temperaturen på 10 min mat allergi eksperimenter. Resultatene reflekterer målinger tatt fra 4 separate sett av eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1: Body temperaturmåling mens mus er anesthetized. Mus kropp temperaturmålinger kan tas med eller uten anestesi. For konsekvent målinger er det viktig å alltid sikte på termometeret på samme kroppen sted. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2: aktivitetsnivå på 40 min etter DNP-HSA iv injeksjon. Mus er observert uten agitering først, deretter med agitering. Basert på deres reaksjoner, ble musene evaluert og scoret på en aktivitet skala fra 1 til 3. Musen til venstre (anti-DNP sensibilisert mus) er gitt en poengsum på 1, mens musen til høyre (PBS kontroll mus) er gitt en poengsum på 3. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 3: Body temperaturmåling på 40 min etter DNP-HSA iv injeksjon. Dette tallet demonstrerer evne av infrarød termometer til nøyaktig og måler noninvasively kroppstemperaturen uten anesthetization. Videre gjenspeiler aktivitet poengene i Video 2 graden av temperatur dråpe målt i denne videoen. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 4: feil i temperatur lesing av hind pote obstruksjon av sensoren. Denne videoen viser forskjellen i temperaturer med og uten foten innenfor sensor omkrets. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Protokollen beskrevet ble grunnlagt med mål å måle kroppstemperatur uten bruk av anestesi. Til tross for sin relativt lett med hvilken temperatur målinger kan fås, er det flere begrensninger som denne teknikken, i tillegg til de mer åpenbare effektene som stress og forskjellige temperaturer.

Først for å opprettholde konsekvent temperaturavlesninger hele eksperimentet, plasseringen der temperaturen måles må er angitt ved hjelp av anatomiske landemerker, og etterforskere må kunne replikere måling av sa kroppen beliggenhet. Ved å sikre musen er forepaws på en rett kant overflate, for eksempel av en bur eller kanten av termometeret, er magen lett utsatt for sensoren på termometeret. Magen er generelt et stort område som gir noen fleksibilitet for konsistente resultater. Videre magen har enklere hår enn dorsal overflaten av musen, og derfor gir en mer nøyaktig kropp temperatur lesing.

Dernest må bakben paws alltid overvåkes når du tar en temperaturmåling. Når termometeret er nær magen, pleier musene å plassere føttene på termometeret selv. Når føtter eller tærne er innenfor omkretsen av sensoren, være temperaturen lese lavere enn magen, som vist i videoen 4. Det er viktig at musen til å skreve med føttene på hver side av sensoren, samtidig omkretsen noen kroppsdeler eller objekter foruten abdominal overflaten.

For det tredje, abdominal overflater av mus ikke være våt når tar målinger. En våt overflate vil endre termometerets evne til å måle temperaturen nøyaktig; vanligvis blir målt temperaturen lavere enn den faktiske verdien. Dette problemet kan unngås ved å holde musene i bur med friskt sengetøy i løpet av observasjonsstudier perioden. Dette sikrer også at tørrhet av abdominal overflaten er standardisert hver gang temperaturen er målt.

Til slutt, infrarød termometer har en større feilmargin enn endetarms sonder, men bare litt. Feilmarginen for målinger med endetarms sonder er ± 0,1 ° C, mens for infrarød termometer, er det ± 0,2 ° C. Denne feilmarginen var minimal i forhold til samlede forskjellene i temperatur dråpe mellom populasjoner i PSA eksperimentet. Enda viktigere, et prosjekt som krever en forskjell som subtile som ± 0,1 ° C kan også forutse andre margin problemer, uavhengig av om en infrarød termometer eller endetarms probe brukes. Under utarbeidelsen av denne protokollen, hadde det også vært vist at det er en veldig god sammenheng mellom kroppen core temperaturer målt ved implanterbare temperatur energi og kroppen overflatetemperaturer målt ved infrarød termometer under lipopolysakkarid-indusert nedkjøling⁶.

Temperatur dråpe i mat allergi modellen brukes hadde ikke observert tidligere^8,10. Standarden for evaluering hadde vært å avgjøre fenotypen alvorlighetsgraden av diaré scoring; men manglet denne metoden objektivitet. Drops kan oppdages ved hjelp av infrarød termometer, vi viste den subtile temperaturen. Vi var så klare å relatere disse med aktivitetsnivå, som mus ikke var anesthetized under prosedyren. Denne metoden gir en rask, nøyaktig, lett-å-bruke, noninvasive og billig måte å måle kroppstemperatur i mus mens kunne observere andre fenotyper som ellers ville være savnet hvis mus er anesthetized for endetarms sonde målinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-contact infrared thermometer	SinoPie	DT-8861
Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
PrecisionGlide 30 G needle	BD	305128
PrecisionGlide 26 G needle	BD	305111
1 mL syringe	BD	309659
Dinitrophenyl - human serum albumin	Biosearch Technologies	D-5059-10
Ovalbumin from chicken egg white	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
Animal Feeding Needles, disposable	Fisher Scientific	01-208-87