Summary
Her beskriver vi de væsentlige skridt for hele-celle patch-klemme optagelser foretaget fra substantia gelatinosa (SG) neuroner i rygmarven skive i vitro . Denne metode giver den iboende membran egenskaber, synaptisk transmission og morfologiske karakterisering af SG neuroner som skal undersøges.
Abstract
Nylige hele-celle patch-klemme undersøgelser fra substantia gelatinosa (SG) neuroner har givet et stort antal oplysninger om de underliggende sensoriske transmission, nociceptive regulering og kronisk smerte eller kløe udvikling spinal mekanismer. Implementeringer af elektrofysiologiske optagelser med morfologiske undersøgelser baseret på nytte af akut rygmarven skiver er yderligere forbedret vores forståelse af neuronal egenskaber og sammensætning af lokale kredsløb i SG. Vi præsenterer her, en detaljeret og praktisk vejledning til forberedelse af rygmarven skiver og Vis repræsentative hele-celle optagelse og morfologiske resultater. Denne protokol tillader ideelle neuronal bevarelse og kan efterligne i vivo betingelser til en vis grad. I Resumé, evnen til at opnå en in vitro- forberedelse af rygmarven skiver giver stabil strøm - og spænding-klemme optagelser og kunne dermed lette detaljerede undersøgelser af de iboende membran egenskaber, lokale kredsløb og neuronal struktur ved hjælp af forskellige eksperimentelle metoder.
Introduction
Substantia gelatinosa (SG, lamina II af spinal dorsal Hornet) er et ubestrideligt vigtigt relæ center for fremsendelse og regulering af sensorisk information. Det er sammensat af excitatoriske og hæmmende interneurons, der modtager input fra de primære afferente fibre, lokale interneurons og den endogene faldende hæmmende system1. I de seneste årtier, har udvikling af akut rygmarven skive forberedelse og fremkomsten af hele-celle patch-klemme optagelse aktiveret forskellige undersøgelser på de iboende elektrofysiologiske og morfologiske egenskaber af SG neuroner2, 3 , 4 samt undersøgelser af lokale kredsløb i SG5,6. Desuden ved hjælp af in vitro- rygmarven skive forberedelse, forskere kan fortolke ændringer i neuronal excitabilities7,8, funktionen af ion-kanaler9,10, og Synaptic aktiviteter11,12 forskellige patologiske betingelser. Disse undersøgelser har uddybet vores forståelse af den rolle, som generalsekretæren neuroner spille i udviklingen og vedligeholdelse af kroniske smerter og neuropatiske klør.
Det væsentlige, den vigtigste forudsætning for at opnå en klar visualisering af neuronal soma og ideelle hele-celle lappe ved hjælp af akut rygmarven skiver er at sikre den fremragende kvalitet af skiver så sunde og patchable neuroner kan opnås. Forberede rygmarven skiver indebærer imidlertid flere trin, som udfører en ventrale laminektomi og fjerne pia-arachnoid membran, der kan være forhindringer i at opnå sund skiver. Selv om det ikke er let at tilberede rygmarven skiver, har udfører optagelser i vitro på rygmarven skiver flere fordele. I forhold til celle kultur præparater, kan rygmarven skiver delvis bevare iboende synaptiske forbindelser, der er i en fysiologisk relevante tilstand. Derudover kunne hele-celle patch-klemme optagelse ved hjælp af rygmarven skiver kombineres med andre teknikker, såsom dobbelt patch klemme13,14, morfologiske undersøgelser15,16 og encellede RT-PCR 17. derfor, denne teknik giver flere oplysninger om kendetegner de anatomiske og genetiske forskelle inden for et bestemt område og giver mulighed for undersøgelse af sammensætningen af lokale kredsløb.
Her give vi et grundlæggende og detaljeret beskrivelse af vores metode til at forberede akut rygmarven skiver og erhverve hele-celle patch-klemme optagelser fra SG neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller er beskrevet blev godkendt af dyr etiske udvalg af Nanchang University (Nanchang, PR Kina, etisk No.2017-010). Alle bestræbelser var lavet til at minimere stress og jag i de eksperimentelle dyr. De elektrofysiologiske optagelser udføres her blev gennemført ved stuetemperatur (RT, 22-25 ° C).
1. dyr
- Bruge Sprague-Dawley rotter (3-5 uger gamle) af begge køn. Hus dyr under en 12t lys-mørke cyklus og give dem ad libitum adgang til tilstrækkelig mad og vand.
2. udarbejdelsen af løsninger og materialer
- Løsninger
- Forberede kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) (i mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucose, 0,4 ascorbinsyre og 2 natrium pyruvat. Se tabel 1.
- Forberede saccharose-ACSF (i mM): 240 saccharose, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0,4 ascorbinsyre og 2 natrium pyruvat. Se tabel 2.
- Forberede K+-baseret intracellulære løsning (i mM): 130 K-gluconat, 5 KCl, 10 Na2-fosforkreatin, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP og 0,3 Li-GTP. Se tabel 3.
- Forberede Cs+-baseret intracellulære løsning (i mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-fosforkreatin, 5 tetraethylammonium (te) - Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP og 0,3 Li-GTP. Se tabel 4.
Bemærk: Alle løsninger skal være forberedt bruge destilleret vand. ACSF og saccharose-ACSF skal være carbogenated (95% O2 og 5% CO2 blanding) inden det anvendes til at opretholde en optimal pH-værdi omkring 7,4 og osmolalitet af disse to løsninger bør justeres til 300-310 mOsm. Fordi ascorbinsyre kunne påvirke calcium kanaler, skal denne agent udelades, hvis man gerne vil optage calcium strømme. Osmolalitet og pH af intracellulære løsninger skal være målt og justeret til 290-300 mOsm og 7,2-7.3, henholdsvis. Det anbefales at filtrere de intracellulære løsninger med 0,2 µm filtre og gemme løsningerne som 1 mL alikvoter ved-20 ° C. CS+ og te anvendes i Cs+-baseret intracellulære løsning til blok kalium kanal, som er befordrende for ved hjælp af forstærkeren til at holde membranen potentielle støt på 0 mV ved registrering af hæmmende postsynaptiske strømme (IPSCs). - Forberede 0,05% neurobiotin 488 løsning. Opløs 2 mg neurobiotin 488 i 4 ml af K+-baseret intracellulære løsning og justere osmolalitet til 290-300 mOsm ved hjælp af destilleret vand eller saccharose, hvis nødvendigt.
Bemærk: 1 mM af saccharose øger osmolaritet af 1 mOsm. - Forbered 3% agar som en blok på rygmarven. Opløses 7,5 g agar i 250 mL renset vand i et glas bægerglas, og derefter bruge en mikrobølgeovn til at varme den, indtil kogende og klare. Swirl løsningen og hæld blandingen i en 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm plastik kasse for størkning bagefter. Holde agaren ved 4 ° C før anvendelsen.
- Forberede immunhistokemiske behandling 4% PARAFORMALDEHYD (PFA). Mix 40 g af PFA pulver til ~ 800 mL opvarmet (ca. 60 ° C) 1 x PBS løsning (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Langsomt justere pH ved tilsætning af 1 N NaOH dråber indtil PFA pulveret er helt opløst. Når løsningen er blevet klart, justere det samlede volumen på 1 L med 1 x PBS. Justere pH til 7.2-7.4 ved hjælp af 1 N HCl når det er nødvendigt, derefter 4% PFA Opløsningen filtreres og opbevar den ved-20 ° C indtil brug.
Bemærk: PFA er giftige, så det er nødvendigt at bære masker samt handsker og sikkerhedsbriller. Udføre processen med at forberede 4% PFA inde i en ventileret hætte. PFA pulver kan være fuldstændig opløst ved en pH på ca. 9-10.
-
Instrumenter
- For en typisk elektrofysiologiske system, bruge en opretstående mikroskop udstyret med infrarøde differential interferens kontrast (IR-DIC) og en høj opløsning vand-fordybelse mål, en CCD/CMOS kamera, en patch-clamp forstærker, en mikropipette indehaveren og en micromanipulator giver mulighed for finjustering af positionen pipette. Et XY Stadium er også nødvendig for at flytte mikroskop.
- Montere alt udstyr på en vibration isolation bordet omgivet af et Faraday bur. Tilslut en video skærm til videokamera til at observere neuronerne og visualisere Mikropipetter.
-
Mikropipetter
- Gøre optagelsen elektroder fra borsilikatglas kapillærer ved hjælp af en mikropipette puller. Typiske pipette modstand varierer fra 3-6 MΩ når fyldt med intracellulære løsning.
-
Agar blok
- Forberede en 1,2 cm x 1,5 cm x 2,0 cm agar blok. Trimme blokken i de figurer, der er vist i figur 1 som krævet.
3. akut rygmarven skive forberedelse
Bemærk: Tværgående eller parasagittal rygmarven skiver tilberedes som tidligere beskrevet18,19,20.
- Før transcardial perfusion og rygmarven udvinding, forberede ~ 500 mL saccharose-ACSF ekvilibreres med 95% O2 og 5% CO2 og cool løsning til iskolde (0-4 ° C).
- Køle ned alle dissektion værktøjerne (f.eks., dissekere saks, iris saks, tandede pincet, fine pincet, buet pincet) på isen. Diagram over forberedelsen af akut rygmarven udsnit er vist i figur 1.
- Transcardial perfusion
- Efter en enkelt injektion (intraperitoneal, i.p.) af urethan (1,5 g/kg), vente 2-3 min, og vurdere anæstesi dybden af rotter ved at teste tå eller hale knivspids svar. Når en kirurgisk flyet af anæstesi opretholdes, placere rotten på knust is i den liggende stilling.
Bemærk: For at producere dyb anæstesi tilstrækkeligt for opfattelsen af smerte under torakotomi, Følg din lokale IACUC retningslinjer. - Gøre et snit (3-4 cm) gennem huden fra formet som et sværd proces at kravebenet, og derefter foretage en tværgående snit under niveauet for formet som et sværd proces.
- Forstå og hæve formet som et sværd proces med et par af buet pincet til at eksponere mellemgulvet helt. Lave et tværgående snit gennem mellemgulvet, og derefter skære igennem brystkassen mellem brystbenet og ribben bilateralt at åbne brysthulen. Bruge buet pincet til at forstå formet som et sværd processen, så brystkassen er fast, og hjertet er tilstrækkeligt udsat.
- Hold hjertet med en anden buet pincet forsigtigt, og derefter indsætte en 22 G nål gennem den venstre ventrikel til bunden af aortabuen.
- Skær højre atrium med fine saks straks, og start derefter perfusion af iskold, iltet saccharose-ACSF gennem en tyngdekraft system.
Bemærk: Hurtig og tilstrækkelig transcardial perfusion med iskold saccharose-ACSF kan lette den hurtige afkøling af rygmarven, mens lav natrium og calcium koncentration kan hjælpe lindre excitatoriske toksicitet og beskytte neuronal funktion. Derudover vil clearing røde blodlegemer være gavnligt for at reducere baggrund farvning af biocytin, når du udfører en morfologisk undersøgelse. Perfusion anses tilstrækkelig og tilfreds som væsken spændende højre atrium er klare og farve af rottens leveren og poter er bleg. Spidsen af 22 G nålen skal være stump at undgå brud hjerte og aortabuen.
- Efter en enkelt injektion (intraperitoneal, i.p.) af urethan (1,5 g/kg), vente 2-3 min, og vurdere anæstesi dybden af rotter ved at teste tå eller hale knivspids svar. Når en kirurgisk flyet af anæstesi opretholdes, placere rotten på knust is i den liggende stilling.
- Rygmarven dissektion og udskæring
- Lave en langsgående indsnit (5 cm) på bagsiden huden fra caudale til rostralt, derefter skære igennem brystkassen mellem rygsøjlen og ribben på hver side i tilstanden af perfusion.
- Gøre et snit i caudale slutningen af rygsøjlen, bruge saks til at skære væk omkringliggende væv, og isolere lumbosacral segment af rygsøjlen hurtigt.
- Overføre lumbosacral segment til et glasfad med iskold saccharose-baseret ACSF. Med den ventrale side opad, skal du bruge fine saks til at skære igennem den vertebrale pedicle bilateralt og udsætte rygmarven omhyggeligt. Isolere en 2-cm lang rygmarven med lumbosacral udvidelsen (L1-S3) og overføre den spinal sektion til en anden glasskål fyldt med koldt saccharose-ACSF.
- Fjerne meninges og pia-arachnoid membran under et dissekere mikroskop. Skære alle de ventrale og dorsale rødderne væk så hurtigt som muligt.
- Placer rygmarven på en tidligere trimmet agar blok. At forberede tværgående skiver, tillægger agaren den ventrale side af rygmarven og lad den dorsale side mod bladet. For at forberede parasagittal skiver, tillægge den ventrale side med superglue agar i lodret retning som vist i figur 1. Derefter montere agar blok til en platform for en vibratome med superlim. Forberede 300-500 µm tværgående eller parasagittal skiver med en advance hastighed på 0,025 mm/s og en vibration frekvens på 80 Hz.
- Brug en plastik-trimmet pipette til at overføre skiver på nylon mesh i en opbevaring afdeling der indeholder løbende iltet ACSF ved 32 ° C i mindst 30 min før optagelse.
Bemærk: sørge for at undgå skade på rygmarven, især den dorsale horn, når du fjerner meninges og spinale rødder. Rygmarven bør være skåret dorsale ventrally. For de bedste resultater, bør være forberedt skiver hurtigt (inden for 15-20 min). Tykkelsen af en spinal skive bør ikke mere end 600 µm at tilfredsstille celle synlighed. Desuden, kan den teknik beskrevet ovenfor bruges til at få vandrette spinal skiver.
4. hele-celle Patch-klemme optagelser
- For at gennemføre hele-celle patch-klemme optagelser fra SG neuroner, bruge K+-baseret intracellulære løsning i de fleste tilfælde, optagelse, mens anvendelse Cs+-baseret løsning kun til optagelse af hæmmende postsynaptiske strømninger.
- Forsigtigt flytte en rygmarv skive til optagelse kammer, og derefter opretholde det med en U-formet platin wire fastgjort med nylon tråde fast for optimal skive stabilitet. Støt perfuse skive med boblede ACSF på RT gennem en tyngdekraft system og indstille perfusion sats på 2-4 mL/min. til at opnå tilstrækkelig iltning.
- Identificere regionen i SG (en gennemskinnelig bandet) ved hjælp af en lav opløsning mikroskop linse, vælge en sund neuron ved hjælp af høj opløsning målet som målcellen og justere det til midten af video skærmen.
- Fyld en mikropipette med en passende mængde af K+-baseret eller Cs+-baseret intracellulære løsning efter behov, indsætte mikropipette i elektrode indehaveren, og sikre at den intracellulære løsning er at kontakte sølvtråd inde i indehaveren.
- Bringe mikropipette i fokus og fordybe den i ACSF ved hjælp af en micromanipulator, og anvend derefter en mild overtryk (~ 1 psi målt med et manometer) at tvinge mikropipette fra snavs og debris.
- Flytte mikropipette mod målrettede neuron gradvist. Frigive de overtryk, når pipetten tilgange neuron og en meget lille dimple formularer på neuronal membran til at danne en gigaseal.
- Ændre bedriften potentielle til -70 mV, som tæt på de fysiologiske hvilende membran potentiale (RMP) af en celle. Derefter, anvende en forbigående og blide suge til mikropipette til at briste membranen og skabe en god hele-celle konfiguration.
Bemærk: Efter overførsel skive ind i optagelse kammeret, sikre stabil perfusion i mindst 5 min. til at klare snavs på skive overflade. Det er værd at bemærke, at evnen til at skelne mellem sunde og usunde/døde neuroner er altafgørende for god forsegling og stabil optagelse. En usund/døde neuron har et hævede eller indskrumpet udseende, sammen med en synlig store kerne, mens en sund neuron er karakteriseret ved en 3-dimensionel (3D) figur med en lyse og glatte membran, og dens kerne er usynlige. For at opnå en konfiguration, hele-celle, er det afgørende at kompensere for hurtig eller langsom kapacitans trinvis når det er nødvendigt. På RT, flydende krydset potentielle beregnes for at være 15.1-15.2 mV og 4.3-4.4 mV i K+-baseret og Cs+-baseret intracellulære løsning, henholdsvis. I vores undersøgelser, var de registrerede data ikke korrigeret for flydende junction potentiale. - Optagelser af iboende membran egenskaber
- Optage passiv iboende membran egenskaber: post RMP straks (inden for 20 s) efter pause i. Bestemme den neuronal input modstand ved at måle spænding svar på en depolariserende nuværende (10 pA, 500 ms) på RMP i strøm-clamp tilstand.
- Optag fyring egenskaber: teste hvert neuron fyring mønster i strøm-klemme med en serie af 1 s depolariserende nuværende pulser (25 – 150 pA med 25 pA increment) på RMP. Måle den tærskel, amplitude og halv-bredden for en enkelt aktionspotentialet offline.
- Optage subthreshold nuværende: for at vurdere de somatiske subthreshold strømninger, holde membranen potentiale på -50 mV i spænding-clamp tilstand. Derefter anvende en række hyperpolarizing spænding pulser af 1 s varighed fra -60 mV til -120 mV og med en 10-mV formindske.
- Optage excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSCs): Record EPSCs med K+-baseret intracellulære løsning i spænding-clamp tilstand på en bedrift potentiale -70 mV.
- Optag IPSCs: Anvende Cs+-baseret intracellulære løsning til at optage IPSCs. Når konfigurationen af hele-celle er etableret, holde membranen potentiale på -70 mV for ~ 5 min, og derefter ændrer den bedrift potentielle til 0 mV gradvist. Vent et par minutter til stabilisering, og derefter begynde at optage IPSC begivenhederne.
Bemærk: Kun neuroner med en RMP mindre end-50 mV og viser overskridelse bør vælges til yderligere undersøgelse. Serien modstand i vores undersøgelse er typisk 10-30 MΩ, og en optagelse bør udelukkes, når serien modstanden ændrer sig med mere end 20%. EPSCs kunne bekræftes med et bad anvendelsen af 50 µM APV og 20 µM CNQX, mens IPSCs kunne bekræftes med 10 µM bicuculline og 1 µM stryknin.
5. morfologiske undersøgelse
- Til eksperimenter med morfologiske, bruge en K+-baseret intracellulære løsning indeholdende 0,05% neurobiotin 488.
- Efter at opretholde en stabil elektrofysiologiske optagelse i mindst 20 min., langsomt fjerner mikropipette i opadgående retning tillade cellemembranen til at forsegle og overføre rygmarven skive til en container fyldt med 4% PFA. Lave skiverne i 4% PFA på RT for 1 h og derefter ved 4° C natten over.
- Skyl skiver i PBS, og derefter nedsænke dem i 50% ethanol i 30 min. Efter en anden tre vasker i PBS, skal du montere skiver i deres oprindelige tykkelse på dias med en montering medium.
- Bruge en Konfokal mikroskop (Se Tabel af materialer) for image erhvervelse og neuronal 3D rekonstruktion. Skan neuroner gennem en 20 X linse med en z-stak 1,5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akut rygmarven skiver var tilberedt efter diagrammet vist i figur 1. Efter udskæring og nyttiggørelse, blev en rygmarv skive overført til optagelse kammer. Sund neuroner blev identificeret baseret på soma udseende ved hjælp af IR-DIC mikroskopi. Næste, SG neuroner handling potentialer blev fremkaldt af en serie af depolariserende nuværende pulser (1 s varighed) da neuroner blev afholdt på RMP. Som vist i figur 2, affyring mønstre observerede i SG neuroner inkluderet tonic-fyring, forsinket-fyring, gap-fyring, indledende-burst, phasic-brister, single-spike og tilbageholdende med-fyring, som er blevet beskrevet og kategoriseret af tidligere undersøgelser.
Gennemføre denne forberedelse, indspillet vi også subthreshold strømninger og spontant vises strømninger i spænding klemme. Repræsentative spor af subthreshold strømme, herunder hyperpolarisering-aktiveret nuværende (jegh), T-type calcium nuværende (jegT) og A-type kalium nuværende (IA), er angivet i figur 3A. Disse strømninger blev opnået ved at holde cellerne i -50 mV og gradvist træde i 10-mV formindsker fra -60 til -120 mV. Jegh blev aktiveret af hyperpolarizing spænding trin. Men jegT og IA blev aktiveret af hyperpolarizing prepulses til at frigive fra inaktivering efterfulgt med et depolarized spænding. Figur 3B 3 C Vis repræsentant spontane EPSCs (sEPSCs) og IPSCs (sIPSCs) optaget fra SG neuroner, henholdsvis. Amplitude og frekvens af disse synaptic begivenheder kunne analyseres ved hjælp af mini analyse software offline.
For at karakterisere neuronal morfologiske træk, blev parasagittal skiver anvendt fordi de fleste af SG neuronerne har betydeligt rostrocaudal spredning af dendritiske træer, og neurobiotin 488 blev føjet til intracellulære løsninger. Størrelsen af neuronal soma og omfang og dimensioner af deres dendritiske processer blev evalueret efter konfokalmikroskopi billeddannelse. Som rapporteret tidligere, SG neuroner viser morfologiske forskelle og kunne kategoriseres i centrale celler, radial celler, lodret celler, ø-celler og uklassificerede celler. Repræsentative micrographs af disse celler er vist i figur 4.
Figur 1: Diagram for akut rygmarven skive forberedelse. Efter at være dybt bedøvede med urethan (i.p.), er rats transcardially perfunderet med iskold carbogenated saccharose-ACSF. Rygsøjlen er derefter hurtigt dissekeret, og en ventral laminektomi udføres. Den meninges, pia-arachnoid membran og vedlagte spinal nerve rødder er fjernet. Derefter, rygmarven modellen er monteret på en Agarosen blok. Tværgående eller parasagittal skiver skæres med en vibratome efter behov. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: affyring mønstre af SG neuroner. Fyring mønstre bestemmes ved at indsprøjte en serie af 1 s depolariserende nuværende pulser ind i en SG neuron på RMP. Affyring mønstre kan klassificeres som tonic-fyring, forsinket-fyring, gap-fyring, indledende-burst, phasic-brister, single-spike og tilbageholdende med-fyring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: spænding-clamp optagelser i SG neuroner. (A) repræsentative spor viser svar til hyperpolarizing aktuelle injektion klassificeret som jegh, IA og IT. Nederste panel viser fremkaldelsen protokollen for sub tærskel strømninger i spænding-klemme. (B) repræsentative spor af sEPSCs indspillet fra SG neuroner på -70 mV i mangel og tilstedeværelsen af 50 μM APV og 20 μM CNQX. Lavere træk spor, som er vist i en udvidet tidsskala før (venstre) og under (højre) handlingen af APV og CNQX, svarer til en periode, der er angivet med en bar vist nedenfor diagram optagelse. (C) repræsentative spor af sIPSCs indspillet fra SG neuroner i fravær og tilstedeværelsen af 10 μM bicuculline og 1 μM stryknin på 0 mV. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative morfologi af rotte SG neuroner. Soma størrelser og dendrit egenskaber vist i konfokalmikroskopi billeder, kan SG neuroner klassificeres som central celle (A), radial celle (B), lodret celle (C), islet celle (D) og uklassificerede celle (E ). V: ventral; D: dorsale; R: rostralt; C: halefinne. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | Molekylær vægt | Koncentration (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glukose | 180 | 11 | 1,98 |
| Ascorbinsyre | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium pyruvat | 110 | 2 | 0,22 |
Tabel 1: Opskrift på ACSF.
| Komponent | Molekylær vægt | Koncentration (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glukose | 180 | 11 | 1,98 |
| Ascorbinsyre | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium pyruvat | 110 | 2 | 0,22 |
Tabel 2: Opskrift på saccharose-ACSF.
| Komponent | Molekylær vægt | Koncentration (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconat | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37.28 |
| Na2-fosforkreatin | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19,02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tabel 3: Opskrift på K+-baseret intracellulære løsning.
| Komponent | Molekylær vægt | Koncentration (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-fosforkreatin | 453.38 | 10 | 453.38 |
| TE-Cl | 165.71 | 5 | 82.86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19,02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tabel 4: Opskrift på Cs+-baseret intracellulære løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol detaljer trin for at forberede skiver, rygmarv, som vi har brugt med succes, når du udfører hele-celle patch-klemme eksperimenter på SG neuroner18,19,20,21. Ved at implementere denne metode, vi for nylig rapporteret, at minocycline, en anden generation af tetracyklin, kan markant forbedre hæmmende synaptisk transmission via en præsynaptiske mekanisme i SG neuroner19. Derudover kunne denne agent sænke amplituden af jegh og yderligere hæmme ophidselse af SG neuroner21. Til støtte for disse offentliggjorte data og de repræsentative resultater, at vi viser her, de i øjeblikket beskrevne metode er egnet til brug i en bred vifte af elektrofysiologiske undersøgelser.
Som vi tidligere bemærket, er transcardial perfusion et afgørende element for at opnå sunde eksemplarer. Først bruger vi iskold løsning for perfusion så rygmarven kan køles hurtigt og neuronal stofskiftet kan være bremset22. Andet, saccharose-substituerede ACSF, en "beskyttende skære" løsning med lav Na+ koncentration, kan rette op på passiv Na+ tilstrømning og dermed mindske neuronal ødem gennem vand posten23. For det tredje er det gavnligt at indhente og analysere neuronal morfologi, fordi perfusion kunne minimere baggrunden forårsaget af biocytin22. For vellykket præparater er det også vigtigt at bruge nogle antioxidanter til at mindske oxidative skader, som tillader neuronal bevarelse24. Derfor, i vores protokol, vi supplere ascorbinsyre og natrium pyruvat, som er kraftige antioxidanter og kan forbedre ødem i rygmarven skiver effektivt, i både ACSF og saccharose-ACSF. Også, i vores erfaringer, vi kan få sunde rygmarven skiver med succes fra neonatal samt 3 – 10 uger gamle SD rotter. Således, for denne protokol skal blive en succes, vi anbefaler at bruge SD rotter, der er mindre end 10 uger gammel.
Mens udfører 'ventrale' laminektomi og fjerne meninges og spinal nerver, bør være tålmodige og omhyggelige med at undgå skæring, strække eller opdele rygmarven. I nogle undersøgelser, rygmarven skiver med vedlagte dorsale rødder er blevet brugt til at vurdere den synaptiske transmission SG neuroner modtaget perifert25,26. Proceduren for fjernelse af pia-arachnoid membran er tekniske vanskeligheder i denne sag, og det kræver en masse tålmodighed.
Denne skive forberedelse teknik også har nogle begrænsninger. En klar ulempe er, at selv om akut skiver bevare rigelige synaptiske forbindelser, ikke kunne det afspejle den virkelige tilstand og tage, hvad der præcist sker in vivo. Dermed, nogle undersøgelser har gennemført i vivo optagelser, der normalt udføres 'blind'27,28,29. Men denne i vivo tilgang er teknisk udfordrende, og det er svært at fortælle om en optagelse udføres fra soma eller dendrit uden tilstrækkelig erfaring. En anden begrænsning af vores nuværende metode er at saccharose-ACSF ikke kan være tilstrækkeligt for neuronal bevarelse, når du forbereder skiver fra aging gnavere. Opdaterede tilgang ved hjælp af N-methyl-D-glucamine, som en Na+ erstatning er blevet foreslået, og denne optimerede metode kan markant forbedre morfologiske og funktionelt bevarelse af neuroner i akut skiver30,31 ,32,33. Endelig viser SG neuroner forskellige morfologiske og elektrofysiologiske egenskaber3. Det synes vanskeligt at fortolke data indhentet fra hele-celle optagelser med udsigt over heterogeniteten. Denne begrænsning kan omgås af yderligere kontrollere de morfologiske detaljer af indspillede neuroner5 eller ved hjælp af Transgene mus, som kunne hjælpe forskerne med at identificere specifikke neuroner20,34. Derudover kunne optogenetics, en roman værktøj giver mulighed for kontrol med en delpopulation af celler35, kombineres med hele-celle patch-klemme optagelse at studere rollen specifikke Ionkanaler eller proteiner og undersøge specifikke neuronal kredsløb.
Samlet set er denne forberedelse teknik en ideel måde at undersøge SG neuroner, suppleret med patch-clamp optagelse, immunfluorescent farvning, specifikke elektrofysiologiske, morfologiske, farmakologiske og biologiske egenskaber agonister eller antagonister og encellede RT-PCR teknik. Desuden, denne tilgang kan anvendes sammen med parret patch-clamp optagelser eller optogenetics, og det er således et værdifuldt værktøj til belysning af neuronal mikrokredsløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den National Natural Science Foundation of China (nr. 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
