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Neuroscience

Substantia Gelatinosa न्यूरॉन्स में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए तीव्र रीढ़ की हड्डी के स्लाइस की तैयारी

Published: January 18, 2019 doi: 10.3791/58479
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 2,3
1Department of Pain, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 2Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 3Center for Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Nanchang University

Summary

यहाँ, हम पूरे सेल पैच के लिए आवश्यक कदम का वर्णन-substantia gelatinosa (एसजी) न्यूरॉन्स से निर्मित में इन विट्रो रीढ़ की हड्डी टुकड़ा से बना रिकॉर्डिंग दबाना. इस विधि आंतरिक झिल्ली गुण, synaptic संचरण और एसजी न्यूरॉन्स के रूपात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है अध्ययन किया जाना है ।

Abstract

हाल ही में पूरे सेल पैच-substantia gelatinosa (एसजी) न्यूरॉन्स से clamping अध्ययन रीढ़ की हड्डी में अंतर्निहित के बारे में जानकारी का एक बड़ा शरीर प्रदान की है संवेदी संचरण, nociceptive विनियमन, और पुराने दर्द या खुजली विकास । electrophysiological रिकॉर्डिंग के कार्यांवयन तीव्र रीढ़ की हड्डी की उपयोगिता के आधार पर रूपात्मक अध्ययन के साथ एक साथ और अधिक ंयूरॉन गुण और एसजी में स्थानीय सर्किट की संरचना के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है । यहां, हम रीढ़ की हड्डी स्लाइस और शो प्रतिनिधि पूरे सेल रिकॉर्डिंग और रूपात्मक परिणाम की तैयारी के लिए एक विस्तृत और व्यावहारिक गाइड प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल आदर्श ंयूरॉन संरक्षण परमिट और vivo परिस्थितियों में एक निश्चित सीमा तक नकल कर सकते हैं । संक्षेप में, करने के लिए एक इन विट्रो में रीढ़ की हड्डी के स्लाइस की तैयारी को प्राप्त करने की क्षमता स्थिर वर्तमान और वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है और इस प्रकार आंतरिक झिल्ली संपत्तियों में विस्तृत जांच की सुविधा सकता है, स्थानीय सर्किट और विविध प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर ंयूरॉन संरचना ।

Introduction

substantia gelatinosa (एसजी, लेमिना रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग के द्वितीय) एक निर्विवाद रूप से महत्वपूर्ण प्रसारण और संवेदी सूचना विनियमन के लिए रिले केंद्र है । यह उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स से बना है, जो प्राथमिक afferent फाइबर, स्थानीय न्यूरॉन्स, और अंतर्जात उतरते निरोधात्मक प्रणाली1से आदानों प्राप्त करते हैं. हाल के दशकों में, तीव्र रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी के विकास और पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के आगमन के आंतरिक electrophysiological और रूपात्मक गुण पर विभिंन अध्ययनों एसजी ंयूरॉंस2सक्षम है, 3 , 4 एसजी5,6में स्थानीय सर्किट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन । इसके अलावा, इन विट्रो में रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने न्यूरॉन excitabilities में परिवर्तन की व्याख्या कर सकते हैं7,8, आयन चैनल के समारोह9,10, और synaptic गतिविधियों11,12 विभिन्न रोग की स्थिति के अंतर्गत । इन अध्ययनों की भूमिका की हमारी समझ गहरा है कि एसजी ंयूरॉंस के विकास और पुराने दर्द और neuropathic खुजली के रखरखाव में खेलते हैं ।

अनिवार्य रूप से, कुंजी शर्त के लिए एक स्पष्ट दृश्य प्राप्त करने के लिए ंयूरॉन सोमा और आदर्श पूरे-कोशिका पैचिंग तीव्र रीढ़ की हड्डी के स्लाइस का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए उत्कृष्ट गुणवत्ता के स्लाइस इतना स्वस्थ और patched ंयूरॉंस प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि, रीढ़ की हड्डी के स्लाइस की तैयारी एक ventral laminectomy प्रदर्शन और पिया-रेशेदार झिल्ली, जो स्वस्थ स्लाइस प्राप्त करने में बाधा हो सकती है हटाने के रूप में कई कदम, शामिल है । हालांकि यह रीढ़ की हड्डी स्लाइस तैयार करने के लिए आसान नहीं है, रीढ़ की हड्डी के स्लाइस पर इन विट्रो में रिकॉर्डिंग प्रदर्शन कई फायदे हैं । सेल संस्कृति की तैयारी की तुलना में, रीढ़ की हड्डी स्लाइस आंशिक रूप से अंतर्निहित synaptic कनेक्शन है कि एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हालत में है संरक्षित कर सकते हैं । इसके अलावा, पूरे सेल पैच-दबाना रीढ़ की हड्डी स्लाइस का उपयोग कर रिकॉर्डिंग ऐसे डबल पैच क्लैंप के रूप में अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है13,14, रूपात्मक अध्ययन15,16 और एकल सेल आरटी-पीसीआर 17. इसलिए, इस तकनीक को एक विशिष्ट क्षेत्र के भीतर संरचनात्मक और आनुवंशिक विचलन निस्र्पक पर अधिक जानकारी प्रदान करता है और स्थानीय सर्किट की संरचना की जांच के लिए अनुमति देता है ।

यहां, हम तीव्र रीढ़ की हड्डी के स्लाइस तैयार करने और एसजी न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारे विधि का एक बुनियादी और विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं ।

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Protocol

वर्णित सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल नानचांग विश्वविद्यालय (नानचांग, पीआर चाइना, एथिकल No. 2017-010) की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे । प्रायोगिक पशुओं के तनाव और दर्द को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए । electrophysiological रिकॉर्डिंग यहां प्रदर्शन कमरे के तापमान (आरटी, 22-25 डिग्री सेल्सियस) पर किए गए थे ।

1. पशु

  1. या तो सेक्स के Sprague-Dawley चूहों (3-5 सप्ताह पुरानी) का उपयोग करें । एक 12 ज प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत जानवरों के घर और उंहें पर्याप्त भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum पहुंच दे ।

2. समाधान और सामग्री तैयार करना

  1. समाधान
    1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) तैयार करें (मिमी में): ११७ NaCl, ३.६ KCl, १.२ णः2पो4·2H 2o, २.५CaCl 2· 2H2हे, १.२ MgCl2· 6H2हे, 25 NaHCO3, 11 डी-ग्लूकोज, ०.४ ascorbic एसिड, और 2 सोडियम पाइरूवेट । तालिका 1देखें ।
    2. तैयार सुक्रोज-ACSF (मिमी में): २४० सुक्रोज, २.५ KCl, १.२५ णः2पो4· 2H2o, ०.५ CaCl2· 2H2हे, ३.५ MgCl2· 6H2हे, 25 NaHCO3, ०.४ Ascorbic एसिड, और 2 सोडियम पाइरूवेट । तालिका 2देखें ।
    3. तैयार k+-आधारित intracellular समाधान (मिमी में): १३० k-gluconate, 5 KCl, 10 Na2-phosphocreatine, ०.५ EGTA, 10 HEPES, 4 मिलीग्राम-एटीपी, और ०.३ ली-GTP. तालिका 3देखें ।
    4. Cs+-आधारित intracellular समाधान तैयार करें (मिमी में): ९२ CsMeSO4, ४३ CsCl, 10 Na2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (चाय)-सीएल, ०.५ EGTA, 10 HEPES, 4 एमजी-एटीपी, और ०.३ ली-GTP. तालिका 4देखें ।
      नोट: सभी समाधान आसुत जल का उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए । ACSF और सुक्रोज-ACSF carbogenated होना चाहिए (९५% O2 और 5% सह2 मिश्रण) से पहले लगभग ७.४ के एक इष्टतम पीएच बनाए रखने के लिए उपयोग करने के लिए, और इन दोनों के समाधान के परासरणीयता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए 300 – 310 mOsm. क्योंकि ascorbic एसिड कैल्शियम चैनलों को प्रभावित कर सकता है, इस एजेंट अगर एक कैल्शियम धाराओं रिकॉर्ड करना चाहते है लोप किया जाना चाहिए । intracellular समाधानों के परासरणीयता और pH को क्रमशः 290 – 300 mOsm और 7.2 – 7.3 तक मापा और समायोजित किया जाना चाहिए । यह ०.२ µm फिल्टर के साथ intracellular समाधान फिल्टर और 1 मिलीलीटर aliquots पर-20 डिग्री सेल्सियस के रूप में समाधान की दुकान की सिफारिश की है । सीएस+ और चाय cs+-आधारित intracellular समाधान में लागू कर रहे हैं पोटेशियम चैनल ब्लॉक करने के लिए, जो एम्पलीफायर का उपयोग करने के लिए अनुकूल है 0 एमवी पर स्थिर जब रिकॉर्डिंग निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (IPSCs) पकड़.
    5. ०.०५% neurobiotin ४८८ समाधान तैयार करें । भंग 2 K के 4 मिलीलीटर में neurobiotin ४८८ के मिलीग्राम+-आधारित intracellular समाधान और परासरणीयता को समायोजित 290-300 mOsm आसुत जल या सुक्रोज का उपयोग करके यदि आवश्यक हो तो ।
      नोट: 1 mOsm के सुक्रोज से osmolarity बढ़ाता है ।
    6. रीढ़ की हड्डी के लिए एक ब्लॉक के रूप में 3% आगर तैयार करें । एक गिलास चोंच में शुद्ध पानी की २५० मिलीलीटर में आगर के ७.५ ग्राम भंग, और फिर एक माइक्रोवेव का उपयोग करने के लिए यह उबलते और स्पष्ट तक गर्मी । भंवर और एक १७.५ सेमी x १०.५ सेमी x १.८ सेमी प्लास्टिक बॉक्स में solidification के लिए बाद में मिश्रण डालना । उपयोग करने से पहले 4 ° c पर आगर रखें ।
    7. immunohistochemical प्रोसेसिंग के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करें । मिश्रण ४० पीएफए पाउडर के ~ ८०० मिलीलीटर (लगभग ६० डिग्री सेल्सियस) 1x पंजाब समाधान (१३० मिमी NaCl, 7 मिमी ना2HPO4, 3 मिमी2पीओ4) । धीरे पीएफए पाउडर पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक 1 N NaOH बूंदों को जोड़कर पीएच समायोजित करें । एक बार समाधान स्पष्ट हो गया है, 1x पंजाबियों के साथ 1 एल के लिए कुल मात्रा समायोजित करें । 1 N HCl का उपयोग कर 7.2 – 7.4 करने के लिए pH को फिर से समायोजित करें जब जरूरत हो, तब 4% पीएफए समाधान फ़िल्टर और उपयोग करने तक इसे-20 ° c पर संग्रहीत ।
      नोट: पीएफए विषाक्त है, इसलिए यह मास्क, दस्ताने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सुरक्षा चश्मे पहनने की जरूरत है । एक हवादार हुड के अंदर 4% पीएफए तैयार करने की प्रक्रिया का संचालन । पीएफए पाउडर पूरी तरह से लगभग 9 – 10 के पीएच में भंग किया जा सकता है ।
  2. उपकरणों
    1. एक ठेठ electrophysiological प्रणाली के लिए, एक ईमानदार अवरक्त विभेदक हस्तक्षेप इसके विपरीत (IR-उद्योग) और एक उच्च संकल्प पानी विसर्जन उद्देश्य, एक सीसीडी/CMOS कैमरा, एक पैच दबाना एंपलीफायर, एक micropipette धारक और एक के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें पिपेट स्थिति के ठीक समायोजन की अनुमति micromanipulator । एक XY चरण भी माइक्रोस्कोप ले जाने के लिए की जरूरत है ।
    2. एक कंपन अलगाव एक फैराडे पिंजरे से घिरा तालिका पर सभी उपकरणों माउंट । वीडियो कैमरे के लिए एक वीडियो मॉनीटर कनेक्ट करने के लिए ंयूरॉंस का निरीक्षण और micropipettes कल्पना ।
  3. Micropipettes
    1. एक micropipette खींचने का उपयोग कर borosilicate ग्लास केशिकाओं से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड बनाओ । ठेठ पिपेट प्रतिरोध पर्वतमाला से 3-6 MΩ जब intracellular समाधान के साथ भरा ।
  4. आगर ब्लॉक
    1. एक १.२ cm x १.५ cm x २.० cm आगर ब्लॉक तैयार करें । आवश्यक के रूप में चित्र 1 में दिखाए गए आकृतियों में ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए ।

3. एक्यूट रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी

नोट: अनुप्रस्थ या parasagittal रीढ़ की हड्डी स्लाइस पहले18,19,20वर्णित के रूप में तैयार कर रहे हैं ।

  1. transcardial छिड़काव और रीढ़ की हड्डी निष्कर्षण करने से पहले, तैयार ~ ५०० मिलीलीटर सुक्रोज-ACSF equilibrated ९५% O2 और 5% सह2 के साथ और बर्फ ठंडा करने के लिए समाधान ठंडा (0-4 डिग्री सेल्सियस) ।
  2. बर्फ पर सभी विच्छेदन उपकरण (जैसे, विदारक कैंची, आइरिस कैंची, दांतेदार संदंश, महीन संदंश, घुमावदार संदंश) को ठंडा करें । तीव्र रीढ़ की हड्डी टुकड़ा की तैयारी का चित्र चित्रा 1में दिखाया गया है ।
  3. Transcardial छिड़काव
    1. एक इंजेक्शन के बाद (intraperitoneal, आईएफसआई) urethane (१.५ ग्राम/kg), 2 के लिए रुको-3 मिनट, और पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी प्रतिक्रियाओं परीक्षण द्वारा चूहों की संज्ञाहरण गहराई का आकलन । एक बार संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान बनाए रखा है, लापरवाह स्थिति में कुचल बर्फ पर चूहा जगह है ।
      नोट: thoracotomy के दौरान दर्द की धारणा के गैर के लिए पर्याप्त गहन संज्ञाहरण के उत्पादन के लिए, अपने स्थानीय IACUC दिशानिर्देशों का पालन करें ।
    2. हंसली करने के लिए असिरूप प्रक्रिया से त्वचा के माध्यम से (3-4 सेमी) एक चीरा बनाओ, और फिर असिरूप प्रक्रिया के स्तर के नीचे एक अनुप्रस्थ चीरा बनाते हैं ।
    3. समझ और घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ असिरूप प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए पूरी तरह से डायाफ्राम बेनकाब । डायाफ्राम के माध्यम से एक अनुप्रस्थ चीरा बनाओ, और फिर छाती और पसलियों के बीच ribcage के माध्यम से कटौती द्विपक्षीय छाती गुहा खोलने के लिए । घुमावदार संदंश का प्रयोग असिरूप प्रक्रिया को समझ कर करें ताकि ribcage ठीक हो जाए, और हृदय पर्याप्त रूप से सामने आ जाए ।
    4. एक और घुमावदार संदंश धीरे के साथ दिल पकड़ो, और फिर महाधमनी आर्क के आधार करने के लिए छोड़ दिया निलय के माध्यम से एक 22 जी सुई डालें.
    5. ठीक कैंची से ठीक atrium को तुरंत काट लें और फिर गुरुत्वाकर्षण प्रणाली के माध्यम से आइस-कोल्ड, oxygenated सुक्रोज-ACSF की छिड़काव शुरू कर दें ।
      नोट: तेजी से और पर्याप्त transcardial छिड़काव के साथ बर्फ ठंडा सुक्रोज-ACSF रीढ़ की हड्डी के तेजी से ठंडा करने की सुविधा कर सकते हैं, जबकि कम सोडियम और कैल्शियम एकाग्रता उत्तेजक विषाक्तता को कम करने और न्यूरॉन्स की रक्षा समारोह में मदद मिल सकती है. इसके अलावा, समाशोधन लाल रक्त कोशिकाओं biocytin की पृष्ठभूमि धुंधला जब एक रूपात्मक अध्ययन प्रदर्शन को कम करने के लिए फायदेमंद होगा । छिड़काव पर्याप्त और संतुष्ट माना जाता है के रूप में लंबे समय के रूप में सही atrium बाहर निकलने द्रव स्पष्ट है और चूहे के जिगर और पंजे का रंग पीला है । दिल और महाधमनी चाप rupturing से बचने के लिए 22 जी सुई की नोक कुंद होना चाहिए ।
  4. रीढ़ की हड्डी विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया
    1. caudal से rostral पीठ त्वचा पर एक अनुदैर्ध्य चीरा (5 सेमी), तो छिड़काव के राज्य में दोनों ओर रीढ़ और पसलियों के बीच ribcage के माध्यम से काट कर ।
    2. रीढ़ की caudal अंत में एक कट बनाओ, कैंची का उपयोग करने के लिए दूर आसपास के ऊतकों में कटौती, और तेजी से रीढ़ की lumbosacral खंड को अलग ।
    3. lumbosacral सेगमेंट को आइस-कोल्ड सुक्रोज-बेस्ड ACSF युक्त ग्लास डिश में ट्रांसफर करें । ventral पक्ष के साथ ऊपर की ओर, ठीक कैंची का उपयोग करने के लिए कशेरुका pedicle के माध्यम से कटौती द्विपक्षीय और रीढ़ की हड्डी को ध्यान से बेनकाब । lumbosacral इज़ाफ़ा (L1-S3) के साथ एक 2 सेमी लंबे रीढ़ की हड्डी को अलग और एक और गिलास ठंड सुक्रोज-ACSF से भरा पकवान के लिए रीढ़ की हड्डी का हस्तांतरण ।
    4. मेनिन्जेस और पिया-रेशेदार झिल्ली को एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे निकाल लें । सभी ventral और पृष्ठीय जड़ों को जितनी जल्दी हो सके दूर काटें ।
    5. रीढ़ की हड्डी में एक पहले से छंटनी की आगर ब्लॉक पर रखें । अनुप्रस्थ स्लाइस तैयार करने के लिए, रीढ़ की हड्डी के ventral पक्ष को आगर में संलग्न करें और ब्लेड की ओर पृष्ठीय पक्ष दें । parasagittal स्लाइस तैयार करने के लिए, आरेख 1में दर्शाए अनुसार ventral साइड को superglue के साथ अनुलंब दिशा में अनुलग्न करें । फिर, superglue के साथ एक vibratome के एक मंच के लिए आगर ब्लॉक माउंट । ०.०२५ mm/s और ८० हर्ट्ज के एक कंपन आवृत्ति की एक अग्रिम गति के साथ 300-500 µm अनुप्रस्थ या parasagittal स्लाइसें तैयार करें ।
    6. एक प्लास्टिक छंटनी की पिपेट का प्रयोग करें एक भंडारण में नायलॉन जाल पर स्लाइस हस्तांतरण करने के लिए ३२ ° c पर लगातार oxygenated ACSF युक्त एक संग्रह चैंबर रिकॉर्डिंग करने से पहले कम से 30 मिनट ।
      नोट: रीढ़ की हड्डी के लिए चोट से बचने के लिए ध्यान रखना, विशेष रूप से पृष्ठीय सींग, मेनिन्जेस और रीढ़ की जड़ों को हटाने जब. रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय-ventrally कटा हुआ होना चाहिए । सबसे अच्छा परिणाम के लिए, स्लाइस तेजी से तैयार किया जाना चाहिए (के भीतर 15 – 20 मिनट). एक रीढ़ की हड्डी टुकड़ा की मोटाई से अधिक नहीं होना चाहिए ६०० µm सेल दृश्यता को संतुष्ट करने के लिए । इसके अलावा, ऊपर वर्णित तकनीक क्षैतिज रीढ़ की हड्डी के स्लाइस प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

4. पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग

  1. एसजी न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग का संचालन करने के लिए, सबसे रिकॉर्डिंग मामलों के लिए कश्मीर+-आधारित intracellular समाधान का उपयोग करें, जबकि सीएस+-आधारित समाधान केवल निरोधात्मक postsynaptic धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए लागू.
  2. धीरे रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए एक रीढ़ की हड्डी टुकड़ा ले जाएँ, और फिर एक यू के आकार का प्लैटिनम तार मजबूती से इष्टतम स्लाइस स्थिरता के लिए नायलॉन धागे के साथ संलग्न के साथ बनाए रखने. तेजी से एक गुरुत्व प्रणाली के माध्यम से आर टी पर bubbled ACSF के साथ टुकड़ा perfuse और छिड़काव की दर पर सेट 2-4 मिलीलीटर/
  3. एक कम संकल्प माइक्रोस्कोप लेंस का उपयोग कर एसजी (एक पारदर्शी बैंड) के क्षेत्र की पहचान, लक्ष्य सेल के रूप में उच्च संकल्प उद्देश्य का उपयोग करके एक स्वस्थ ंयूरॉन का चयन, और यह वीडियो मॉनिटर स्क्रीन के केंद्र के लिए समायोजित करें ।
  4. आवश्यक के रूप में K+-आधारित या Cs+-आधारित intracellular समाधान की एक उपयुक्त मात्रा के साथ एक micropipette भरें, इलेक्ट्रोड धारक में micropipette डालें, और सुनिश्चित करें कि intracellular समाधान के अंदर सिल्वर वायर से संपर्क कर रहा है धारक.
  5. ध्यान में micropipette लाओ और यह एक micromanipulator का उपयोग कर ACSF में विसर्जित कर दिया, और फिर एक हल्के सकारात्मक दबाव लागू (~ 1 psi जब एक manometer के साथ मापा) micropipette किसी भी गंदगी और मलबे से दूर बल ।
  6. micropipette को लक्षित ंयूरॉन की ओर धीरे से ले जाएं । सकारात्मक दबाव जारी एक बार पिपेट ंयूरॉन और एक बहुत छोटे से एक gigaseal फार्म के लिए ंयूरॉन झिल्ली पर डिंपल रूपों दृष्टिकोण ।
  7. -७० एमवी, जो शारीरिक आराम झिल्ली की क्षमता (आरएमपी) एक सेल के करीब है के लिए होल्डिंग क्षमता में परिवर्तन । फिर, झिल्ली टूटना और एक अच्छा पूरे सेल विन्यास बनाने के लिए micropipette के लिए एक क्षणिक और कोमल चूषण लागू होते हैं ।
    नोट: रिकॉर्डिंग चैंबर में टुकड़ा स्थानांतरित करने के बाद, टुकड़ा सतह पर मलबे को साफ करने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए स्थिर छिड़काव सुनिश्चित करें । यह ध्यान देने योग्य है कि स्वस्थ और अस्वस्थ/मृत ंयूरॉंस के बीच अंतर करने की क्षमता अच्छा सील और स्थिर रिकॉर्डिंग के लिए सर्वोपरि महत्व का है लायक है । एक अस्वस्थ/मृत ंयूरॉन एक सूजन या सिकुड़ा उपस्थिति है, एक साथ एक दृश्य बड़े नाभिक के साथ, जबकि एक स्वस्थ ंयूरॉन एक 3 आयामी (3 डी) एक चमकदार और चिकनी झिल्ली के साथ आकार की विशेषता है, और उसके नाभिक अदृश्य है । एक पूरे सेल विंयास को प्राप्त करने के लिए, यह तेजी से या धीमी समाई कदम दर कदम जब आवश्यक के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए आवश्यक है । आरटी में, तरल जंक्शन क्षमता 15.1-15.2 एमवी और 4.3-4.4 एमवी कश्मीर में+-आधारित और सीएस+आधारित intracellular समाधान, क्रमशः की गणना की है । हमारी पढ़ाई में लिक्विड जंक्शन की क्षमता के लिए दर्ज आंकड़ों को सही नहीं किया गया ।
  8. आंतरिक झिल्ली संपत्तियों की रिकॉर्डिंग
    1. निष्क्रिय आंतरिक झिल्ली गुण रिकॉर्ड: रिकॉर्ड आरएमपी (20 एस के भीतर) को तोड़ने के बाद तुरंत । वर्तमान क्लैंप मोड में आरएमपी में एक ध्रुवीकरण वर्तमान (10 पीए, ५०० एमएस) के लिए वोल्टेज की प्रतिक्रिया को मापने के द्वारा न्यूरॉन इनपुट प्रतिरोध का निर्धारण ।
    2. रिकॉर्ड फायरिंग गुण: वर्तमान में प्रत्येक न्यूरॉन के फायरिंग पैटर्न का परीक्षण-1 एस की एक श्रृंखला के साथ दबाना वर्तमान दालों (25-25 पीए वेतन वृद्धि के साथ 150 फिलीस्तीनी अथॉरिटी) आरएमपी पर । थ्रेशोल्ड, आयाम और एक ही कार्रवाई संभावित ऑफ़लाइन की अर्ध-चौड़ाई को मापने ।
    3. रिकॉर्ड उपसीमा वर्तमान: दैहिक उपसीमा धाराओं का आकलन करने के लिए, पर झिल्ली क्षमता पकड़-५० एमवी वोल्टेज में दबाना मोड. फिर, एक 10-एमवी घटोतरी के साथ-६० एमवी के लिए-१२० एमवी, से 1 s अवधि के hyperpolarizing वोल्टेज दालों की एक श्रृंखला लागू होते हैं.
    4. रिकॉर्ड उत्तेजक postsynaptic धाराओं (EPSCs): रिकॉर्ड EPSCs K+-आधारित intracellular समाधान में वोल्टेज-दबाना मोड के साथ एक होल्डिंग क्षमता-७० mV.
    5. रिकॉर्ड IPSCs: IPSCs रिकॉर्डिंग के लिए Cs+-आधारित intracellular समाधान लागू करें । एक बार पूरे सेल विंयास की स्थापना की है, पर झिल्ली क्षमता पकड़-७० mv ~ 5 मिनट के लिए, और फिर धारण क्षमता बदलने के लिए 0 एमवी धीरे से । स्थिरीकरण के लिए कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें, और उसके बाद IPSC ईवेंट्स रिकॉर्ड करने के लिए प्रारंभ करें ।
      नोट: एक आरएमपी से कम-५० एमवी और दिखा overshoot के साथ केवल ंयूरॉंस आगे अध्ययन के लिए चुना जाना चाहिए । हमारे अध्ययन में resistances श्रृंखला आम तौर पर 10-30 MΩ हैं, और एक रिकॉर्डिंग एक बार 20% से अधिक की श्रृंखला प्रतिरोध परिवर्तन छोड़ दिया जाना चाहिए । EPSCs ५० µ एम APV और 20 µ एम CNQX के एक स्नान आवेदन के साथ पुष्टि की जा सकती है, जबकि IPSCs 10 µ एम bicuculline और 1 µ एम बच्छनाग के साथ पुष्टि की जा सकती है ।

5. रूपात्मक अध्ययन

  1. रूपात्मक प्रयोगों के लिए, एक K+-आधारित intracellular समाधान का उपयोग करें जिसमें ०.०५% neurobiotin ४८८ है ।
  2. न्यूनतम 20 मिनट के लिए एक स्थिर electrophysiological रिकॉर्डिंग बनाए रखने के बाद, कोशिका झिल्ली को फिर से सील करने और 4% पीएफए से भरे कंटेनर में स्पाइनल कॉर्ड स्लाइस को स्थानांतरित करने की अनुमति देने के लिए धीरे से ऊपर की दिशा में micropipette को हटा दें । 1 घंटे के लिए RT पर 4% पीएफए में स्लाइसें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फिक्स ।
  3. पंजाब में स्लाइस कुल्ला, और फिर उंहें 30 मिनट के लिए ५०% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया । पंजाब में एक और तीन बहाकर के बाद, एक बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड पर उनके मूल मोटाई में स्लाइस माउंट ।
  4. छवि अधिग्रहण और न्यूरॉन 3d पुनर्निर्माण के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिकादेखें) का प्रयोग करें. एक जेड के साथ एक 20X लेंस के माध्यम से स्कैन न्यूरॉन्स १.५ µm के ढेर.

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Representative Results

तीव्र रीढ़ की हड्डी स्लाइस चित्रा 1में दिखाया गया आरेख के अनुसार तैयार किया गया । टुकड़ा करने की क्रिया और वसूली के बाद, एक रीढ़ की हड्डी टुकड़ा रिकॉर्डिंग चैंबर को हस्तांतरित किया गया था । स्वस्थ ंयूरॉंस सोमा उपस्थिति के आधार पर पहचान की गई IR-उद्योग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । इसके बाद, एसजी न्यूरॉन्स की कार्रवाई संभावितों का ध्रुवीकरण वर्तमान दालों (1 s अवधि) जब न्यूरॉन्स आरएमपी पर आयोजित की गई थी की एक श्रृंखला से निकाले गए थे. के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, फायरिंग पैटर्न एसजी न्यूरॉन्स में मनाया टॉनिक-फायरिंग, देरी-फायरिंग, गैप फायरिंग, प्रारंभिक फट, चरणबद्ध-फट, एकल स्पाइक और अनिच्छुक-फायरिंग, जो वर्णित किया गया है और पिछले अध्ययनों द्वारा वर्गीकृत शामिल थे ।

इस तैयारी को लागू करने, हम भी दर्ज की उपसीमा धाराओं और सहज वोल्टेज दबाना धाराओं में प्रदर्शित हो रहा है । hyperpolarization-सक्रिय वर्तमान (ih), t-प्रकार कैल्शियम वर्तमान (iT) और एक-प्रकार पोटेशियम वर्तमान (iA), सहित उपसीमा धाराओं के प्रतिनिधि अंश चित्रा 3ए में दिए गए हैं । इन धाराओं-५० एमवी पर कोशिकाओं को धारण और धीरे--६० से 10-एमवी decrements में कदम-१२० एमवी द्वारा प्राप्त किया गया । मैंएच hyperpolarizing वोल्टेज कदम से सक्रिय था । लेकिन, मैंटी और मैंएक hyperpolarizing आवेगों द्वारा सक्रिय करने के लिए एक विध्रुवीकरण वोल्टेज के साथ पीछा निष्क्रियता से जारी किया गया । चित्र बी , 3 c शो प्रतिनिधि सहज EPSCs (sEPSCs) और IPSCs (sIPSCs) एसजी न्यूरॉन्स से दर्ज की गई, क्रमशः. आयाम और इन synaptic घटनाओं की आवृत्ति मिनी विश्लेषण सॉफ्टवेयर ऑफ़लाइन का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है ।

न्यूरॉन रूपात्मक सुविधाओं को चिह्नित करने के लिए, parasagittal स्लाइस लागू किए गए थे क्योंकि एसजी न्यूरॉन्स के अधिकांश वृक्ष पेड़ों के काफी rostrocaudal फैल गया है, और neurobiotin ४८८ intracellular समाधान करने के लिए जोड़ा गया था. के आकार के न्यूरॉन्स सोमा और हद और उनके वृक्ष प्रक्रियाओं के आयामों को फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के बाद मूल्यांकन किया गया. जैसा कि पहले बताया, एसजी ंयूरॉंस रूपात्मक भेद दिखाने के लिए और केंद्रीय कोशिकाओं, रेडियल कोशिकाओं, ऊर्ध्वाधर कोशिकाओं, टाप कोशिकाओं और unclassifieded कोशिकाओं में वर्गीकृत किया जा सकता है । इन कोशिकाओं के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ चित्रा 4में दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: तीव्र रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी के लिए आरेख । urethan (आईएफसआई) से गहरा anesthetized होने के बाद चूहों को बर्फ के साथ transcardially perfused-ठण्डा carbogenated सुक्रोज-ACSF जाता है. रीढ़ की हड्डी स्तंभ तो जल्दी से विच्छेदित है, और एक ventral laminectomy किया जाता है । मेनिन्जेस, पिया-रेशेदार झिल्ली और संलग्न रीढ़ की तंत्रिका जड़ें हटा रहे हैं । फिर, रीढ़ की हड्डी नमूना एक agarose ब्लॉक पर मुहिम शुरू की है । अनुप्रस्थ या parasagittal स्लाइस एक vibratome के साथ आवश्यकतानुसार काट रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एसजी न्यूरॉन्स की फायरिंग पैटर्न. फायरिंग पैटर्न 1 की एक श्रृंखला में एक एसजी ंयूरॉन में मौजूदा दालों ध्रुवीकरण के इंजेक्शन द्वारा निर्धारित कर रहे है आरएमपी । फायरिंग पैटर्न टॉनिक के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है-फायरिंग, देरी फायरिंग, गैप-फायरिंग, प्रारंभिक फट, चरणबद्ध-फट, एकल स्पाइक, और अनिच्छुक गोलीबारी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एसजी न्यूरॉन्स में वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग. (क) प्रतिनिधि hyperpolarizing वर्तमान मैंएचके रूप में वर्गीकृत इंजेक्शन, मैंएक और मैंटीकी प्रतिक्रिया दिखा निशान । निचले पैनल उप के लिए आह्वान प्रोटोकॉल वोल्टेज में दहलीज धाराओं-दबाना दिखाता है । (ख) में एसजी ंयूरॉंस से दर्ज sEPSCs के प्रतिनिधि अंश-७० एमवी अनुपस्थिति और ५० माइक्रोन APV और 20 माइक्रोन CNQX की उपस्थिति में । कम लगातार निशान, जो एक विस्तारित समय पैमाने में पहले (बाएं) में दिखाए जाते है और (दाएं) APV और CNQX की कार्रवाई के तहत, एक बार चार्ट रिकॉर्डिंग के नीचे दिखाया गया द्वारा इंगित अवधि के अनुरूप है । (ग) की अनुपस्थिति में एसजी ंयूरॉंस से दर्ज sIPSCs के प्रतिनिधि अंश और 10 माइक्रोन bicuculline की उपस्थिति और 1 माइक्रोन बच्छनाग 0 एमवी पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: चूहा एसजी ंयूरॉंस की प्रतिनिधि आकृति विज्ञान । फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों में दिखाया सोमा आकार और dendrite गुण के अनुसार, एसजी न्यूरॉन्स केंद्रीय सेल (ए), रेडियल सेल (बी) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, ऊर्ध्वाधर सेल (सी), टाप सेल (डी) और unclassified सेल (ई ). वि: ventral; D: पृष्ठीय; नि: rostral; ग: caudal । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घटक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी) g/L
Nacl ५८.५ ११७ ६.८४
KCl ७४.५ ३.६ ०.२७
णः2पो4· 2H2हे १५६ १.२ ०.१९
CaCl2· 2H2हे १४७ २.५ ०.३७
MgCl2· 6H2हे २०३ १.२ ०.२४
NaHCO३ ८४ 25 २.१
D-ग्लूकोज १८० 11 १.९८
Ascorbic एसिड १९८.११ ०.४ ०.०८
सोडियम पाइरूवेट ११० 2 ०.२२

तालिका 1: ACSF के लिए नुस्खा ।

घटक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी) g/L
Nacl ५८.५ ११७ ६.८४
KCl ७४.५ ३.६ ०.२७
णः2पो4· 2H2हे १५६ १.२ ०.१९
CaCl2· 2H2हे १४७ २.५ ०.३७
MgCl2· 6H2हे २०३ १.२ ०.२४
NaHCO३ ८४ 25 २.१
D-ग्लूकोज १८० 11 १.९८
Ascorbic एसिड १९८.११ ०.४ ०.०८
सोडियम पाइरूवेट ११० 2 ०.२२

तालिका 2: सुक्रोज के लिए नुस्खा-ACSF ।

घटक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी) mg/100 मिलीलीटर
K-gluconate २३४.२ १३० ३०४४.६
KCl ७४.५ 5 ३७.२८
ना2-Phosphocreatine ४५३.३८ 10 ४५३.३८
EGTA ३८०.३५ ०.५ १९.०२
HEPES २३८.३१ 10 २३८.३
एमजी-एटीपी ५०७.१८ 4 २०२.९
ली-GTP ५२३.१८ ०.३ १५.७

तालिका 3: कश्मीर के लिए नुस्खा+-आधारित intracellular समाधान ।

घटक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी) mg/100 मिलीलीटर
CsMeSO4 २२८ ९२ २०९७.६
CsCl १६८.३६ ४३ ७२३.९५
ना2-Phosphocreatine ४५३.३८ 10 ४५३.३८
चाय-सीएल १६५.७१ 5 ८२.८६
EGTA ३८०.३५ ०.५ १९.०२
HEPES २३८.३१ 10 २३८.३
एमजी-एटीपी ५०७.१८ 4 २०२.९
ली-GTP ५२३.१८ ०.३ १५.७

तालिका 4: सीएस के लिए नुस्खा+-आधारित intracellular समाधान ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल स्पाइनल कॉर्ड स्लाइस तैयार करने के लिए चरण विवरण, जो हमने सफलतापूर्वक उपयोग किया है जब पूरे-सेल पैच-क्लैंप प्रयोगों पर एसजी न्यूरॉन्स18,19,20,21. इस पद्धति को लागू करने से, हम हाल ही में बताया कि minocycline, टेट्रासाइक्लिन की एक दूसरी पीढ़ी के स्पष्ट रूप से एसजी न्यूरॉन्स19में एक presynaptic तंत्र के माध्यम से निरोधात्मक synaptic संचरण को बढ़ाने सकता है. इसके अलावा, इस एजेंट मैंएच के आयाम में कमी और आगे एसजी ंयूरॉंस21की उत्तेजितता को बाधित कर सकता है । इन प्रकाशित आंकड़ों और प्रतिनिधि परिणाम है कि हम यहां दिखाने के समर्थन में, वर्तमान में वर्णित विधि electrophysiological अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग के लिए उपयुक्त है ।

जैसा कि हम पहले उल्लेख किया, transcardial छिड़काव स्वस्थ नमूनों को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है । सबसे पहले, हम छिड़काव के लिए बर्फ ठंडा समाधान का उपयोग करें ताकि रीढ़ की हड्डी में तेजी से ठंडा किया जा सकता है और ंयूरॉन चयापचय22धीमा किया जा सकता है । दूसरा, सुक्रोज-प्रतिस्थापित ACSF, कम एनए+ एकाग्रता के साथ एक ' सुरक्षात्मक काटने ' समाधान, निष्क्रिय ना+ आमद उन्नत कर सकते हैं और इस प्रकार पानी प्रविष्टि23के माध्यम से न्यूरॉन्स सूजन में कमी. तीसरा, यह प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए लाभप्रद है न्यूरॉन्स आकृति विज्ञान क्योंकि छिड़काव biocytin22की वजह से पृष्ठभूमि को कम कर सकता. सफल तैयारी के लिए, यह भी ऑक्सीडेटिव क्षति को कम करने के लिए कुछ antioxidants का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो न्यूरॉन संरक्षण की अनुमति देता है24. इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल में, हम ascorbic एसिड और सोडियम पाइरूवेट, जो शक्तिशाली एंटीऑक्सीडेंट है और रीढ़ की हड्डी में सूजन की उंनति कर सकते है प्रभावी ढंग से स्लाइस, दोनों ACSF और सुक्रोज-ACSF में पूरक । इसके अलावा, हमारे अनुभव में, हम स्वस्थ रीढ़ की हड्डी को सफलतापूर्वक नवजात के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3-10 सप्ताह पुराने एसडी चूहों से स्लाइस प्राप्त कर सकते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लिए सफल होने के लिए, हम सुझाव है कि एसडी चूहों से कम 10 सप्ताह पुराना है का उपयोग कर ।

प्रदर्शन करते हुए ' ventral ' laminectomy और मेनिन्जेस और रीढ़ की नसों को हटाने, एक रोगी और सावधान करने के लिए काटने, खींच या रीढ़ की हड्डी के बंटवारे से बचने के लिए किया जाना चाहिए । कुछ अध्ययनों में संलग्न पृष्ठीय जड़ों के साथ रीढ़ की हड्डी के स्लाइस synaptic संचरण एसजी न्यूरॉन्स25,26परिधीय प्राप्त का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. पिया-रेशेदार झिल्ली को हटाने की प्रक्रिया इस मामले में तकनीकी कठिनाई का है, और यह धैर्य की एक बहुत की आवश्यकता है ।

इस तकनीक की तैयारी टुकड़ा भी कुछ सीमाएं हैं । एक स्पष्ट दोष यह है कि हालांकि तीव्र स्लाइसें प्रचुर synaptic कनेक्शन की रक्षा, यह वास्तविक स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं कर सका और पता क्या वास्तव में vivo मेंहोता है । इस प्रकार, कुछ अध्ययनों में लागू किया है vivo रिकॉर्डिंग है कि आम तौर पर ' ब्लाइंड '27,28,29प्रदर्शन किया । हालांकि, vivo में यह दृष्टिकोण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और यह एक रिकॉर्डिंग पर्याप्त अनुभव के बिना सोमा या dendrite से किया जाता है कि क्या बताने के लिए मुश्किल है. हमारे वर्तमान पद्धति की एक और सीमा यह है कि सुक्रोज-ACSF को उम्र बढ़ने से स्लाइस तैयार करते समय न्यूरॉन संरक्षण के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है. एक ना+ स्थानापन्न के रूप में एन मिथाइल-D-glucamine का उपयोग कर एक अद्यतन दृष्टिकोण का प्रस्ताव किया गया है, और इस अनुकूलित पद्धति को स्पष्ट रूप से तीव्र स्लाइस में न्यूरॉन्स के रूपात्मक और कार्यात्मक संरक्षण में सुधार कर सकते हैं30,31 ,३२,३३. अंत में, एसजी न्यूरॉन्स विभिन्न रूपात्मक और electrophysiological गुण3दिखा. यह विविधता की अनदेखी करते हुए पूरे सेल रिकॉर्डिंग से प्राप्त डेटा की व्याख्या करने के लिए मुश्किल लगता है. यह सीमा आगे दर्ज की रूपात्मक विवरण की पुष्टि द्वारा sidestepped किया जा सकता है न्यूरॉन्स5 या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर, जो शोधकर्ताओं विशिष्ट ंयूरॉंस की पहचान करने में मदद कर सकता है20,३४. इसके अलावा, optogenetics, एक उपंयास उपकरण३५कोशिकाओं की एक उप जनसंख्या के नियंत्रण की अनुमति, पूरे सेल पैच के साथ जोड़ा जा सकता है, विशिष्ट आयन चैनल या प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए और विशिष्ट ंयूरॉंस सर्किट की जांच करने के लिए रिकॉर्डिंग दबाना ।

कुल मिलाकर, इस तैयारी तकनीक electrophysiological, रूपात्मक, औषधीय, और एसजी ंयूरॉंस की जैविक विशेषताओं की जांच करने के लिए एक आदर्श तरीका है, पैच दबाना रिकॉर्डिंग द्वारा पूरित, immunofluorescent धुंधला, विशिष्ट एगोनिस्ट या विरोधी, और एकल सेल आरटी-पीसीआर तकनीक । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण युग्मित पैच-दबाना रिकॉर्डिंग या optogenetics के साथ एक साथ लागू किया जा सकता है, और यह इस प्रकार एक महत्वपूर्ण उपकरण है न्यूरॉनी microcircuits रोशन करने के लिए.

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No. ८१५६०१९८, ३१६६०२८९) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma S7653 Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl Sigma 60130 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O Sigma 71500 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O Sigma C5080 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O Sigma M2670 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3 Sigma S5761 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose Sigma G7021 Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid Sigma P5280 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate Sigma A7631 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose Sigma S7903 Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate Wako 169-11835 Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine Sigma P1937 Used for the preparation of intracellular solution
EGTA Sigma E3889 Used for the preparation of intracellular solution
HEPES Sigma H4034 Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP Sigma A9187 Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP Sigma G5884 Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4 Sigma C1426 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl Sigma C3011 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl Sigma T2265 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488 Vector SP-1145 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar Sigma A7002 3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde Sigma P6148 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4 Hengxing Chemical Reagents Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium Polyscience 18606
Urethan National Institute for Food and Drug Control 30191228 1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments TW150F-4 1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller Sutter Instrument P-97 Used for the preparation of micropipettes
Vibratome Leica VT1000S
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corporation 63544
Infrared CCD camera Dage-MIT IR-1000
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285
X-Y stage Burleigh GIBRALTAR X-Y
Upright microscope Olympus BX51WI
Osmometer Advanced FISKE 210
PH meter Mettler Toledo FE20
Confocol microscope Zeiss LSM 700

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References

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