Summary
Здесь мы описываем основные шаги для поклеточного фиксации записи, сделанные из substantia gelatinosa (SG) нейронов спинного мозга в vitro фрагментов. Этот метод позволяет внутренней мембраны свойства, синаптической передачи и морфологическая характеристика SG нейронов быть изучены.
Abstract
Недавние исследования поклеточного патч зажим от нейронов substantia gelatinosa (SG) предоставили большой объем информации о позвоночника механизмах, лежащих в основе передачи чувств, ноцицептивных регулирования и хроническая боль или зуд развития. Реализаций электрофизиологических записей вместе с морфологического исследования, основанные на полезность острого спинного ломтики улучшились далее наше понимание нейрональных свойств и состава местных схем в SG. Здесь мы представляем подробный и практическое руководство по подготовке спинного ломтиками и показать представителя поклеточного запись и морфологических результаты. Этот протокол позволяет идеально нейрональных сохранение и может имитировать условия в естественных условиях в определенной степени. Таким образом, возможность получать подготовку в vitro спинного срезов позволяет стабильный ток и напряжение зажим записи и таким образом могло бы облегчить подробное расследование свойства внутренней мембраны, местные схемы и Нейронные структуры с использованием различных экспериментальных подходов.
Introduction
Substantia gelatinosa (SG, пластинки II спинного мозга Спинной рога) является центром бесспорно важных ретрансляции для передачи и регулирование сенсорной информации. Он состоит из возбуждающих и тормозящий интернейронов, которые получают входы из первичных афферентных волокон, местные интернейронов и эндогенных убыванию тормозной системы1. В последние десятилетия развитие острого спинного фрагмент подготовки и появлением поклеточного фиксации записи позволили различные исследования по электрофизиологических и морфологических свойств SG нейронов2, 3 , 4 , а также исследования местных схем в SG5,6. Кроме того, с помощью подготовки в vitro спинного срез, исследователи могут интерпретировать изменения в нейрональных excitabilities7,8, функция ионные каналы9,10, и синаптических деятельности11,12 различных патологических условиях. Эти исследования способствовали углублению нашего понимания той роли, которую SG нейронов играют в развитии и поддержание хронической боли и нейропатической зуд.
По существу ключевым условием для достижения четкой визуализации нейрональных сома и идеальной поклеточного исправлений с помощью острого спинного ломтиками — обеспечить превосходное качество ломтиками так здоровых и patchable нейроны могут быть получены. Однако подготовка спинного ломтики включает несколько этапов, например выполняя вентральной Ламинэктомия и удаления мембраны Пиа паутинной, которые могут быть препятствия в получении здорового ломтиками. Хотя это не легко подготовить спинного ломтиками, выполнения записи в vitro на ломтики спинного мозга имеет несколько преимуществ. По сравнению с подготовкой культуры клеток, спинного ломтики можно частично сохранить присущие синаптических связей, которые находятся в состоянии физиологически соответствующие. Кроме того поклеточного патч зажим записи с помощью спинного фрагментов может сочетаться с другими методами, например двойной патч зажим13,14, морфологические исследования,1516 и одной ячейки ПЦР- 17. Таким образом, эта техника предоставляет подробную информацию о характеристике анатомические и генетического разнообразия в пределах определенного региона и позволяет для изучения состава местных схем.
Здесь мы предоставляем базовое и детальное описание нашего метода для подготовки острый спинного ломтиками и приобретения поклеточного фиксации записи от SG нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы, описанные были утверждены животных этики Комитет Наньчан университета (Наньчан, КНР, этические No.2017-010). Все усилия были сделаны для сведения к минимуму стресса и боли экспериментальных животных. Электрофизиологические записи, здесь были проведены при комнатной температуре (RT, 22 – 25 ° C).
1. Животные
- Используйте крысах Sprague-Dawley (3 – 5 недель) любого пола. Дом животных под цикл 12 h свето тени и дать им Ад Либитум доступа к достаточному питанию и воде.
2. Подготовка решений и материалов
- Решения
- Подготовка искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) (в мм): 117 NaCl, 3.6 KCl, O 1.2 NaH2PO4·2H2, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-глюкоза, 0.4 аскорбиновой кислоты и 2 пируват натрия. Приведены в таблице 1.
- Подготовить сахарозы Фаго (в мм): 240 сахарозы, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 аскорбиновой кислоты и пируват натрия 2. Приведены в таблице 2.
- Подготовить K+-на основе внутриклеточных решение (в мм): 130 K-глюконат, 5 KCl, 10 Na2-фосфокреатина, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 мг-СПС и 0,3 Li-GTP. См таблицу 3.
- Подготовить Cs+-внутриклеточный решение (в мм) на базе: 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-фосфокреатина, 5 тетраэтиламмониевого (чай) - 4 мг, 10 HEPES, 0.5 EGTA, Cl - СПС и 0,3 Li-GTP. Смотрите таблицу 4.
Примечание: Все решения должны подготавливаться с использованием дистиллированной воды. ФАГО и сахароза фаго должен быть carbogenated (95% O2 и 5% CO2 смесь) до использования поддерживать оптимальный рН около 7,4 и осмотического давления этих двух решений следует скорректировать до 300-310 мОсм. Потому что аскорбиновая кислота может повлиять на кальциевых каналов, этот агент должен быть опущен, если хочется записать кальций течения. Осмотического давления и pH внутриклеточных решений следует измерять и приспособлены к 290-300 мОсм и 7.2-7.3, соответственно. Рекомендуется для фильтрации внутриклеточных решения с 0,2 мкм фильтры и хранить решения как 1 мл аликвоты при-20 ° C. CS+ и чай применяются в Cs+-внутриклеточный решения блока калия канал, который способствует использование усилителя для хранения потенциал мембраны на базе стабильным на уровне 0 mV при записи тормозной постсинаптический токов (IPSCs). - Приготовляют раствор 0,05% neurobiotin 488. Растворите 2 мг neurobiotin 488 в 4 мл K+-внутриклеточный решения на базе и отрегулируйте осмотического давления на 290-300 мОсм с помощью дистиллированной воды или сахароза, если необходимо.
Примечание: 1 мм сахарозы увеличивает осмолярности 1 мОсм. - Подготовка 3% агар как блок для спинного мозга. Распустить 7,5 г агара в 250 мл очищенной воды в стеклянный стакан, а затем использовать микроволновую печь для тепла до кипения и снимите. Вихрем решение и вылейте смесь в 17,5 x 10,5 см х 1,8 см пластиковая коробка для затвердевания потом. Держите агар на 4 ° C перед использованием.
- Подготовьте параформальдегида 4% (PFA) для обработки иммуногистохимии. Смесь 40 g порошка PFA ~ 800 мл с подогревом (приблизительно 60 ° C) 1 x PBS решение (130 мм NaCl, 7 Na2HPO4, 3 мм NaH2PO4). Медленно скорректировать рН, добавив 1 капли N NaOH до полного растворения порошка PFA. После того, как решение стало ясно, отрегулируйте общий объем до 1 L с ПБС. Скорректировать рН 7,2 – 7,4 с использованием HCl N 1, когда это необходимо, то фильтр 4% раствор PFA и храните его при 20 ° C до использования.
Примечание: PFA токсичен, поэтому необходимо носить маски, перчатки, а также защитные очки. Проводить процесс подготовки 4% PFA внутри вентилируемого капота. PFA порошок может полностью растворяют при рН около 9-10.
-
Инструменты
- Для типичной электрофизиологических системы, использовать вертикально микроскоп оснащен инфракрасной дифференциальной помехи контраст (IR-DIC) и объектив высокого разрешения погружения в воду, камеры CCD/CMOS, патч зажим усилителя, микропипеткой держателя и микроманипулятор, позволяя плавная регулировка положения пипеткой. Ху этап также необходима для перемещения микроскопа.
- Подключите все оборудование на таблицу изоляции вибрации, окруженный клетку Фарадея. Подключите монитор видео на видео камеру наблюдения нейронов и визуализировать micropipettes.
-
Micropipettes
- Сделайте запись электроды из боросиликатного стекла капилляров с помощью микропипеткой съемник. Типичный пипеткой сопротивления колеблется от 3-6 MΩ когда заполнены с внутриклеточной решения.
-
Агар блок
- Подготовьте 1,2 х 1,5 см x 2.0 см агар блок. Отделка блок в формы, показанный на рисунке 1 , как это требуется.
3. острые спинного ломтик подготовка
Примечание: Поперечные или парасагиттальных спинного фрагментов готовятся как ранее описанных18,19,20.
- До transcardial перфузии и извлечения спинного мозга, подготовить ~ 500 мл сахарозы фаго достижение равновесного уровня с 95% O2 и 5% CO2 и охлаждения решение ледяной (0-4 ° C).
- Охладьте вниз все рассечение инструменты (например, рассекает ножницы, ножницы Ирис, зубчатый щипцы, тонкой щипцы, изогнутый пинцет) на льду. Схема подготовки кусочек острого спинного мозга показан на рисунке 1.
- Transcardial перфузии
- После однократного введения (внутрибрюшинного, и.п.) уретана (1,5 г/кг) Подождите 2-3 мин и оценки глубины анестезии крыс путем тестирования ног или хвост щепотку ответы. После того, как сохраняется хирургической плоскости анестезии, место крысы на дробленый лед в лежачем положении.
Примечание: Для производства глубокой анестезии достаточной для восприятия боли во время торакотомия руководящим ваши местные IACUC. - Сделать надрез (3 – 4 см) через кожу от мечевидного отростка до ключицы и затем сделать поперечный разрез ниже уровня мечевидного отростка.
- Возьмите и поднять мечевидного отростка с парой Изогнутый пинцет подвергать диафрагмы полностью. Сделать поперечный разрез через диафрагму, а затем вырезать через грудной клетки между грудиной и ребра на двусторонней основе, чтобы открыть грудной полости. Используйте щипцы изогнутые понять мечевидного отростка, поэтому фиксированной грудной клетки, и сердце подвергается достаточно.
- Аккуратно возьмите сердце с другой Изогнутый пинцет, а затем вставить иглой 22 G через левый желудочек до основания аорты.
- Вырезать правое предсердие с тонкой ножницы сразу, а затем запустите перфузии ледяной, кислородом сахарозы фаго через систему гравитации.
Примечание: Быстрое и достаточных transcardial перфузии с ледяной сахарозы фаго может облегчить быстрое охлаждение спинного мозга, при низкой концентрации натрия и кальция может помочь облегчить возбуждающим токсичности и защищать нейрональных функции. Кроме того очистка красные кровяные клетки будет полезным для уменьшения фона возможно окрашивание biocytin при выполнении морфологические исследования. Перфузии считается достаточным и удовлетворены, пока жидкость, выход из правого предсердия ясно и бледный цвет печени крыс и лапы. Кончик иглы 22 G должно быть тупым, чтобы избежать разрыва сердца и аорты.
- После однократного введения (внутрибрюшинного, и.п.) уретана (1,5 г/кг) Подождите 2-3 мин и оценки глубины анестезии крыс путем тестирования ног или хвост щепотку ответы. После того, как сохраняется хирургической плоскости анестезии, место крысы на дробленый лед в лежачем положении.
- Рассечение спинного и нарезки
- Сделайте продольный разрез (5 см) на задней кожи от хвостового ростральной, затем прорваться через грудной клетки между позвоночника и ребра с обеих сторон в государстве перфузии.
- Сделать надрез на хвостовой конец позвоночника, используйте ножницы, чтобы вырезать окружающих тканей и быстро изолировать сегмент пояснично-крестцового отдела позвоночника.
- Передача пояснично-крестцового сегмента в стеклянную посуду, содержащие ледяной фаго на основе сахарозы. С вентральной стороне вверх используйте тонкой ножницы, чтобы прорваться через позвоночный ножке на двусторонней основе и подвергать спинного тщательно. Изолировать 2 см длиной спинного мозга с пояснично-крестцовый расширения (L1 – S3) и передать другой стеклянную посуду с холодной сахарозы фаго спинной секции.
- Удаление мозговых оболочек и Пиа паутинной мембраны под микроскопом рассечения. Отрежьте все брюшной и спинной корни как можно быстрее.
- Место спинного мозга на ранее обрезанные агар блок. Подготовить поперечных срезов, придают вентральной стороне спинного агар и пусть спинной стороне сторону лезвия. Подготовить парасагиттальных ломтиками, придают вентральной стороне с суперклея агар в вертикальном направлении как показано на рисунке 1. Затем подключите блок агар на платформу vibratome с суперклея. Подготовка 300 – 500 µm поперечной или парасагиттальных ломтики с заранее скорость вибрации частотой 80 Гц и 0,025 мм/сек.
- Для переноса срезов на нейлоновая сетка в камере хранения, содержащие непрерывно кислородом фаго на 32 ° C в течение по крайней мере 30 минут до записи используйте подстриженные Пластиковые пипетки.
Примечание: позаботьтесь, чтобы избежать повреждения спинного мозга, особенно спинной рога, при удалении мозговых оболочек и спинномозговых корешков. Спинного мозга следует нарезанный спинной вентрально. Для достижения наилучших результатов срезы должны быть готовы быстро (в течение 15-20 мин). Толщина позвоночника фрагмента должна быть не более чем 600 мкм для удовлетворения видимости ячейки. Кроме того метод, описанный выше может использоваться для получения горизонтальных ломтиков позвоночника.
4. поклеточного фиксации записи
- Для проведения поклеточного фиксации записи от SG нейронов, используйте K+-внутриклеточный решение в большинстве случаев запись на базе при применении Cs+-на основе решения, только для записи тормозной постсинаптический течений.
- Осторожно переместить ломтиком спинного записи камеры и затем сохранить его с U-образной провода платины с нитки капроновые твердо для оптимального ломтик стабильности прилагается. Постоянно perfuse срез с обрабатывать фаго на RT через систему гравитации и установить скорость перфузии в 2-4 мл/мин для достижения достаточной оксигенации.
- Идентифицировать региона SG (полупрозрачные полоса) с помощью объектива микроскопа с низким разрешением, выбрать здорового нейрона с помощью высокого разрешения цель как целевую ячейку и настроить его в центр экрана видео монитора.
- Заполнить микропипеткой с соответствующим объемом K+-основе или Cs+-внутриклеточный решения на базе, при необходимости, вставьте держатель электрода микропипеткой и убедитесь, что решение внутриклеточных контактирует серебряной проволоки внутри держатель.
- Принесите микропипеткой в фокус и погрузите его в фаго, используя микроманипулятор, а затем применить мягкая положительным давлением (~ 1 psi при измерении с манометром) заставить микропипеткой от грязи и мусора.
- Постепенно переместите микропипеткой к целевой нейрона. Релиз положительным давлением после пипеткой подходов нейрон и формы очень небольшая ямка на мембране нейронов в форме gigaseal.
- Изменить проведение потенциал -70 mV, которая отдыхает рядом физиологических мембранного потенциала (РМП) клетки. Затем примените преходящими и нежный всасывания к микропипеткой разрыва мембраны и создать хорошую конфигурацию поклеточного.
Примечание: После передачи фрагмента в записи камеру, обеспечить устойчивый перфузии для по крайней мере 5 минут для очистки мусора на поверхности среза. Стоит отметить, что способность различать между здоровым и нездоровым/мертвые нейронов имеет первостепенное значение для хорошей герметизации и стабильная запись. Нездоровый/мертвые нейрон имеет появление опухшие или сморщенные, вместе с видимым большое ядро, здоровый нейрон характеризуется 3-мерной формы (3D) с яркой и гладкой мембраны, а ее ядро является невидимым. Для достижения поклеточного конфигурации, важно для компенсации быстро или медленно емкости, шаг за шагом, когда это необходимо. В РТ, перекрестка жидкого потенциальных рассчитывается как 15.1 – 15,2 МВ и mV 4.3-4.4 в K+-основе и Cs+-на основе внутриклеточных решения, соответственно. В наших исследованиях записанные данные не были исправлены для жидких Джанкшен потенциал. - Запись свойств внутренней мембраны
- Запись свойства пассивная внутренняя мембрана: запись ПРХ немедленно (в течение 20 s) после перерыва в. Определите нейронов входного сопротивления путем измерения напряжения ответ на расшатывания текущей (10 Па, 500 мс) в ПРХ в режиме ток зажим.
- Запись стрельбы свойства: тест стрельбы шаблон каждый нейрон в ток зажим с серии 1 s расшатывания токовые импульсы (25 – 150 Па с шагом 25 ПА) на КПМ. Измеряют порог, амплитуда и половинной ширины одного потенциал действия в автономном режиме.
- Запись подпорогового ток: оценить соматические подпорогового токов, удерживайте мембраны потенциал в -50 МВ в режиме мембраной. Затем примените серии гиперполяризирующий импульсов напряжения продолжительностью 1 s от -60 мВ до -120 МВ, с 10-mV декремента.
- Запись возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs): запись EPSCs с+K-на основе внутриклеточных решения в режиме напряжение зажим на потенциал Холдинг -70 mV.
- Запись IPSCs: Применить Cs+-на основе внутриклеточных решение для записи IPSCs. После конфигурации поклеточного, удерживайте мембраны потенциал на -70 mV для ~ 5 мин, а затем изменить проведение потенциал 0 mV постепенно. Подождите несколько минут для стабилизации, а затем начинают записывать события IPSC.
Примечание: Только нейроны с ПРХ менее-50 МВ и показываю выброс должен выбираться для дальнейшего изучения. Серии сопротивлений в нашем исследовании, как правило, 10-30 MΩ, и записи должны быть исключены после серии сопротивление меняется более чем на 20%. EPSCs может быть подтвержден с применением Ванна 50 мкм APV и 20 мкм CNQX, в то время как IPSCs может быть подтвержден с 10 мкм bicuculline и Стрихнин 1 мкм.
5. морфологическое исследование
- Для морфологического экспериментов, используйте K+-на основе внутриклеточных раствор, содержащий 0,05% neurobiotin 488.
- После сохранения стабильной электрофизиологических записи по крайней мере 20 минут, медленно извлеките микропипеткой в сторону, чтобы позволить клеточной мембраны запечатайте и передать в контейнер с 4% сегмента спинного PFA. Исправить ломтики в 4% PFA на RT 1 h и затем на 4° C на ночь.
- Промыть ломтики в PBS, а затем погрузить их в 50% этанола за 30 мин. После еще три автомойки в PBS смонтируйте ломтики в их оригинальной толщины на слайды с монтажа средних.
- Используйте конфокального микроскопа (см. Таблицу материалы) для захвата изображений и нейрональных 3D реконструкции. Сканировать нейронов через 20 X объектив с z стек 1,5 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Острый спинного ломтики были подготовлены согласно схеме показано на рисунке 1. После нарезки и восстановления ломтиком спинного был передан Палате записи. Здоровые нейроны были определены основанные на сома внешний вид с помощью ИК-DIC микроскопии. Далее, потенциалы действия SG нейронов были вызвало ряд расшатывания импульсов тока (продолжительность s 1) когда в ПРХ были проведены нейронов. Как показано на рисунке 2, обжиг шаблоны наблюдаемых в SG нейронов включены тоник огонь, задержка стрельбы, разрыв огонь, первоначальный всплеск, фазовые разрывная, сингл Спайк и неохотно огонь, которые были описаны и категориям предыдущих исследований.
Реализация этой подготовки, мы также записал подпорогового течений и спонтанно появляться токов в мембраной. Представитель следы подпорогового течений, включая гиперполяризации активированный ток (Ih), T-тип кальция текущего (IT) и калия A-типа текущего (I,A), приведены на рисунке 3A. Эти токи были получены путем проведения клетки на -50 МВ и постепенно активизирует в 10-mV уменьшает от -60 до -120 МВ. Яh был активирован гиперполяризирующий напряжения шаги. Однако яТ и яA были активированы гиперполяризирующий prepulses для освобождения от инактивации с деполяризованный напряжения. Рисунок 3B 3 C Показать представитель спонтанный EPSCs (sEPSCs) и IPSCs (sIPSCs), записанных с SG нейронов, соответственно. Амплитуда и частота синаптического этих событий мог быть проанализирован в автономном режиме с помощью мини-анализ программного обеспечения.
Характеризовать нейрональных морфологических особенностей, парасагиттальных ломтики были применены потому, что большинство нейронов SG значительно rostrocaudal распространения дендритных деревьев, и neurobiotin 488 был добавлен к внутриклеточной решений. Размер нейрональных сома и масштабы и размеры их дендритных процессов были оценены после confocal микроскопии изображений. Как сообщалось ранее, SG нейронов Показать морфологических различий и могут быть классифицированы в центре клетки, радиальные клетки, вертикальные клетки, островковых клеток и Неклассифицированные клетки. Представитель микроскопии этих клеток показаны на рисунке 4.
Рисунок 1: схема для приготовления острых спинного ломтик. После глубоко под наркозом с уретан (и.п.), крысы, увлажненную с ледяной carbogenated сахарозы фаго transcardially. Позвоночника затем быстро разобрал, и производится вентральной Ламинэктомия. Мозговые оболочки, Пиа паутинной мембраны и прилагаемый спинномозговых нервных корешков, удаляются. Затем образец спинного монтируется на блоке агарозы. Поперечные или парасагиттальных ломтиками вырезаны с vibratome при необходимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: шаблоны SG нейронов стрельбы. Обжига шаблоны определяются путем инъекций серии 1 s расшатывания импульсов тока в SG нейрон в РМП. Обжиг шаблоны могут быть классифицированы как тоник обжиг, задержка стрельбы, разрыв обжиг, первоначальный всплеск, фазовые разрывная, сингл Спайк и неохотно стрельбы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: напряжение зажим записи в нейронах SG. (A) представитель следы показаны ответ гиперполяризирующий текущего инъекции, классифицируются как яh, IA и яТ. Нижней панели показывает вызывая протокол для подпороговые токов в мембраной. (B) представитель следы sEPSCs записан с SG нейронов на -70 mV в отсутствие и наличие 50 мкм APV и 20 мкм CNQX. Нижняя подряд следы, которые показаны в масштабе расширенного времени до (слева) и под (справа) действия АПВ и CNQX, соответствуют к периоду обозначается бар ниже диаграмма записи. (C) представитель следы sIPSCs записано от SG нейронов в отсутствие и наличие 10 мкм bicuculline и Стрихнин 1 мкм в 0 mV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель морфологией нейронов крысы SG. Согласно Сома размеров и дендритов свойства, показанные в конфокальной микроскопии изображений SG нейроны могут быть классифицированы как центральная ячейка (A), радиальные клетки (B), вертикальная ячейка (C), островковых клеток (D) и Неклассифицированные клеток (E ). V: вентральный; D: спинной; R: ростральной; C: хвостового. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | Молекулярная масса | Концентрация (мм) | g/L |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| O MgCl2·6H2 | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-глюкоза | 180 | 11 | 1,98 |
| Аскорбиновая кислота | 198.11 | 0.4 | 0,08 |
| Пируват натрия | 110 | 2 | 0,22 |
Таблица 1: Рецепт для фаго.
| Компонент | Молекулярная масса | Концентрация (мм) | g/L |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| O MgCl2·6H2 | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-глюкоза | 180 | 11 | 1,98 |
| Аскорбиновая кислота | 198.11 | 0.4 | 0,08 |
| Пируват натрия | 110 | 2 | 0,22 |
Таблица 2: Рецепт для сахарозы фаго.
| Компонент | Молекулярная масса | Концентрация (мм) | мг/100 мл |
| K-глюконат | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74.5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Креатинфосфорная кислота | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| MG-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Таблица 3: Рецепт для K+-внутриклеточный решения на базе.
| Компонент | Молекулярная масса | Концентрация (мм) | мг/100 мл |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-Креатинфосфорная кислота | 453.38 | 10 | 453.38 |
| ЧАЙ Cl | 165.71 | 5 | 82,86 |
| EGTA | 380.35 | 0.5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| MG-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Таблица 4: Рецепт для Cs+-внутриклеточный решения на базе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол детали шаги для подготовки спинного кусочки, которые мы успешно используется при выполнении экспериментов поклеточного патч зажим на SG нейронов18,19,,2021. Путем реализации этого метода, мы недавно сообщила, что миноциклин, второго поколения тетрациклин, могли бы заметно повысить ингибирующее синаптической передачи Пресинаптический механизм в SG нейронов19. Кроме того этот агент может уменьшить амплитуду яч и далее подавляют возбудимость нейронов SG21. В поддержку этих опубликованных данных и представитель результаты, что мы показываем здесь, в настоящее время описан метод подходит для использования в широком диапазоне электрофизиологических исследований.
Как мы отмечали ранее, transcardial перфузии является важнейшим элементом для получения здорового образцов. Во-первых мы используем ледяной решения для перфузии, поэтому можно быстро охладить спинного мозга и нейрональных метаболизм может быть замедление22. Во-вторых, сахароза замещенных фаго, «защитные резки» решение с низкой концентрации Na+ , можно улучшить пассивной приток Na+ и таким образом уменьшить нейрональных отек через вход воды23. В-третьих это выгодно получить и проанализировать нейрональных морфологии, потому что перфузии может свести к минимуму фон, вызванные biocytin22. Для успешной подготовки важно также использовать некоторые антиоксидантов для уменьшения окислительного повреждения, который позволяет нейрональных сохранение24. Таким образом в нашем протокол, мы дополняем аскорбиновой кислоты и пируват натрия, которые являются мощными антиоксидантами и может улучшить отек спинного ломтиками эффективно, фаго и сахароза фаго. Кроме того по нашему опыту, мы можем получить здорового спинного ломтиками успешно от новорожденных, а также 3 – 10 недель старый SD крыс. Таким образом для этого протокола быть успешным, рекомендуется использовать SD крыс, которые являются менее 10 недель.
Во время выполнения «вентральной» Ламинэктомия и удаление оболочек мозга и спинномозговых нервов, один должен быть пациента и аккуратным, чтобы избежать резки, растяжения или расщепление спинного мозга. В некоторых исследованиях, спинного ломтики с прилагаемой спинной корней были использованы для оценки синаптической передачи SG нейронов периферически получил25,26. Процедура удаления Пиа паутинной мембраны является технической сложности в этом случае, и это требует много терпения.
Этот фрагмент, подготовка техники также имеет некоторые ограничения. Один четкий недостаток заключается в том, что хотя острой ломтики сохранить обильные синаптических связей, он может не отражать реальное состояние и решить, что именно происходит в естественных условиях. Таким образом, некоторые исследования выполнены в vivo записей, которые обычно выполняются «слепой»27,,2829. Однако этот подход в естественных условиях является технически сложной, и это трудно сказать, является ли запись выполняется из сома или дендритов без достаточного опыта. Еще одним ограничением нашего текущего метода является, что сахароза фаго не может быть достаточно для сохранения нейронов при подготовке кусочки от старения грызунов. Обновленный подход с использованием N-метил D-glucamine, как было предложено заменить Na+ , и эта оптимизированная методология может заметно улучшить морфологических и функциональных сохранение нейронов в острых фрагментов30,31 ,32,33. Наконец SG нейронов показывают различные Морфологические и электрофизиологические свойства3. Кажется, трудно интерпретировать данные, полученные от поклеточного записей, любуясь видом на неоднородность. Это ограничение может быть обошел по дальнейшей проверке морфологических детали Записанная нейронов5 или использование трансгенных мышей, которые могли бы помочь исследователям идентифицировать конкретных нейронах20,34. Кроме того Оптогенетика, Роман инструмент, позволяющий контроль суб популяции клеток35, может сочетаться с поклеточного патч зажим запись для изучения роли конкретных ионных каналов или белки и расследовать конкретные схемы нейронов.
В целом эта техника подготовки является идеальным способом для изучения электрофизиологических, морфологические, фармакологические и биологические характеристики SG нейронов, дополняются записи патч зажим, immunofluorescent окрашивание, конкретные агонисты или антагонисты и одной ячейки ПЦР-техника. Кроме того этот подход может применяться вместе с парными фиксации записи или Оптогенетика, и таким образом, он является ценным инструментом для освещения нейрональных микросхемы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана гранты от Фонда национального естественных наук Китая (№ 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
