Summary
Här beskriver vi de väsentliga steg för hela-cell patch-clamp-inspelningar som gjorts från substantia gelatinosa (SG) nervceller i ryggmärgen in vitro- segmentet. Denna metod tillåter inneboende membran egenskaper, synaptisk transmission och morfologisk karakterisering av SG nervceller att studeras.
Abstract
Senaste hela-cell patch-clamp studier från substantia gelatinosa (SG) nervceller har lämnat en stor mängd information om spinal mekanismerna bakom sensoriska överföring, nociceptiva förordning och kronisk smärta eller klåda utveckling. Implementeringar av elektrofysiologiska inspelningar tillsammans med morfologiska studier baserade på nyttan av akut ryggmärgen skivor har ytterligare förbättrat vår förståelse av neuronala egenskaper och sammansättning av lokala kretsar i SG. Här presenterar vi en detaljerad och praktisk guide för beredning av ryggmärgen skivor och Visa representativa hela-cell inspelning och morfologiska resultat. Detta protokoll tillåter idealisk neuronala bevarande och kan härma i vivo villkor i viss utsträckning. Sammanfattningsvis, förmågan att få en in vitro- förberedelse av ryggmärgen skivor möjliggör stabil ström och spänning-bordsfäste inspelningar och kunde därmed underlätta detaljerade undersökningar in på inneboende membran egenskaper, lokala kretsar och neuronala struktur använder olika experimentella metoder.
Introduction
Den substantia gelatinosa (SG, lamina II av spinal dorsala horn) är en obestridligen viktiga relay center för överföring och reglering av sensorisk information. Den består av retande och hämmande interneuroner, som tar emot indata från de primära afferenta fibrerna, lokala interneuronen och endogena fallande hämmande system1. Under de senaste decennierna har utvecklingen av akut ryggmärgen slice förberedelse och tillkomsten av hela-cell patch-clamp inspelning aktiverat olika studier om de inneboende elektrofysiologiska och morfologiska egenskaperna SG nervceller2, 3 , 4 samt studier av de lokala kretsarna i SG5,6. Dessutom, med hjälp av in vitro- ryggmärgen slice beredning, forskare kan tolka förändringarna i neuronala excitabilities7,8, funktionen av ion kanaler9,10, och Synaptic aktiviteter11,12 under olika sjukdomstillstånd. Dessa studier har fördjupat vår förståelse av den roll som SG nervceller spelar i utveckling och underhåll av kronisk smärta och neuropatisk klådan.
Den viktigaste förutsättningen att uppnå en tydlig visualisering av neuronala soma och perfekt hela-cell lapp med akut ryggmärgen skivor är huvudsakligen säkerställa den utmärkta kvaliteten på skivor så friska och patchable nervceller kan erhållas. Dock omfattar förbereda ryggmärgen skivor flera steg, som utför en ventrala laminektomi och ta bort pia-spindelvävshinnan membranet, som kan vara hinder att få friska skivor. Även om det inte är lätt att förbereda ryggmärgen skivor, har utför inspelningar i vitro på ryggmärgen skivor flera fördelar. Jämfört med cell kultur preparat, kan ryggmärgen skivor delvis bevara inneboende synapsförbindelser som är i en fysiologiskt relevanta skick. Dessutom kan hela-cell patch-clamp inspelning med ryggmärgen skivor kombineras med andra tekniker, såsom dubbla patch clamp13,14, morfologiska studier15,16 och encelliga RT-PCR 17. därför denna teknik ger mer information om karaktärisera de anatomiska och genetiska skillnader inom en specifik region och möjliggör undersökning av sammansättningen av lokala kretsar.
Här, ger vi en grundläggande och detaljerad beskrivning av vår metod för att förbereda akut ryggmärgen skivor och förvärva hela-cell patch-clamp inspelningar från SG nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll beskrivs godkändes av djur etik kommittén för Nanchang universitet (Nanchang, PR China, etiska No.2017-010). Alla ansträngningar har gjorts att minimera stress och smärta av försöksdjuren. Elektrofysiologiska inspelningarna utförs här genomfördes vid rumstemperatur (RT, 22 – 25 ° C).
1. djur
- Använd Sprague-Dawley-råttor (3 – 5 veckor gamla) oavsett kön. Hysa djuren under en 12 h ljus-mörk-cykel och ge dem ad libitum tillgång till tillräckligt med mat och vatten.
2. beredning av lösningar och material
- Lösningar
- Förbereda konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) (i mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glukos, 0.4 askorbinsyra och 2 natrium pyruvat. Se tabell 1.
- Förbereda sackaros-ACSF (i mM): 240 sackaros, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 askorbinsyra och 2 natrium pyruvat. Se tabell 2.
- Förbereda K+-baserat intracellulära lösning (i mM): 130 K-glukonat, 5 KCl, 10 Na2-phosphocreatine, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP och 0.3 Li-GTP. Se tabell 3.
- Förbereda Cs+-baserat intracellulära lösning (i mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (TEA) - Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP och 0.3 Li-GTP. Se tabell 4.
Obs: Alla lösningar måste förberedas med destillerat vatten. ACSF och sackaros-ACSF bör carbogenated (95% O2 och 5% CO2 blandning) före användning att upprätthålla en optimal pH på cirka 7,4 och osmolalitet av dessa två lösningar bör anpassas till 300 – 310 mOsm. Eftersom askorbinsyra kan påverka kalciumkanaler, måste denna agent utelämnas om man skulle vilja spela in kalcium strömmar. De osmolalitet och pH av intracellulära lösningar bör mätas och anpassas till 290 – 300 mOsm och 7,2 – 7.3, respektive. Det rekommenderas att filtrera de intracellulära lösningarna med 0,2 µm filter och lagrar lösningarna som 1 mL alikvoter vid-20 ° C. Cs+ och te används i Cs+-baserat intracellulära lösning till block kaliumkanal, vilket främjar använder förstärkaren för att hålla membranet potentiella stadigt på 0 mV vid inspelning hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs). - Bered den 0,05% neurobiotin 488. Lös 2 mg neurobiotin 488 i 4 mL av K+-baserat intracellulära lösning och justera osmolalitet till 290 – 300 mOsm genom att använda destillerat vatten eller sackaros om det behövs.
Obs: 1 mM av sackaros ökar osmolaritet 1 mOsm. - Förbered 3% agar som ett block för ryggmärgen. Lös 7,5 g agar i 250 mL renat vatten i en glasbägare, och sedan använda en mikrovågsugn att värma det till kokpunkten och rensa. Snurra lösningen och Häll blandningen i en 17,5 x 10,5 cm x 1,8 cm plastlåda för stel efteråt. Hålla agar vid 4 ° C före användning.
- Förbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) för immunhistokemiska bearbetning. Mix 40 g PFA pulver till ~ 800 mL uppvärmd (ca 60 ° C) 1 x PBS lösning (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Långsamt justera pH genom att tillsätta 1 N NaOH droppar tills PFA pulver är helt upplöst. När lösningen har blivit klart, justera den totala volymen till 1 L med 1 x PBS. Justera pH-värdet till 7,2-7,4 använder 1 N HCl när det behövs, sedan filtrera 4% PFA lösningen och lagra den på-20 ° C fram till användning.
Obs: PFA är giftiga, så det behövs att bära masker samt handskar och skyddsglasögon. Genomföra processen med att förbereda 4% PFA inuti en ventilerad huv. PFA pulver kan helt upplösas vid pH ca 9 – 10.
-
Instrument
- För en typisk elektrofysiologiska system, Använd en upprätt Mikroskop utrustad med infraröd differentiell störningar kontrast (IR-DIC) och en högupplöst vatten-immersion mål, en CCD/CMOS-kamera, en patch-clamp-förstärkare, en mikropipett hållare och ett micromanipulator möjliggör finjustering av pipett position. Ett XY skede behövs också att flytta Mikroskop.
- Montera all utrustning på ett bord för isolering av vibrationer omgiven av en Faradays bur. Ansluta en bildskärm till videokameran att iaktta nervceller och visualisera Mikropipetter.
-
Mikropipetter
- Se inspelning elektroder från borosilikatglas kapillärer med hjälp av en mikropipett avdragare. Typiska pipett motståndet varierar från 3-6 MΩ när fylld med intracellulära lösning.
-
Agar block
- Förbereda en 1,2 x 1,5 cm x 2,0 cm agar block. Trimma blocket i de former som framgår i figur 1 som krävs.
3. akut ryggmärgen Slice förberedelse
Obs: Tvärgående eller parasagittal ryggmärgen skivor är förberedda som tidigare beskrivits18,19,20.
- Före transcardial perfusion och ryggmärgen utvinning, förbereda ~ 500 mL sackaros-ACSF jämviktas med 95% O2 och 5% CO2 och cool lösningen på iskall (0 – 4 ° C).
- Kyla ner alla dissektion verktyg (t.ex. dissekera iris sax, fin pincett, tandade peang, sax, böjd pincett) på isen. Diagrammet av utarbetandet av akut ryggmärgen slice visas i figur 1.
- Transcardial perfusion
- Vänta i 2 – 3 min efter en enda injektion (intraperitoneal, i.p.) av uretan (1,5 g/kg), och bedöma anestesi djupet hos råttor genom att testa tå eller svans nypa svaren. När ett kirurgiskt plan av anestesi bibehålls, placera råtta på krossad is i ryggläge.
Obs: För att producera djup anestesi tillräckligt för icke-perception av smärta under torakotomi, Följ dina lokala IACUC riktlinjer. - Gör ett snitt (3 – 4 cm) genom huden från xiphoid process till nyckelbenet, och sedan göra en tvärgående snitt under nivån för den xiphoid processen.
- Förstå och höja den xiphoid processen med ett par böjda pincetten att exponera membranet helt. Gör en tvärgående snitt genom membranet, och sedan skära igenom bröstkorgen mellan bröstben och revben bilateralt att öppna brösthålan. Använda böjda pincetten för att förstå den xiphoid processen så bröstkorgen är fast, och hjärtat utsätts tillräckligt.
- Håll hjärtat med en annan böjd pincett försiktigt och sedan infoga en 22 G nål genom vänster kammare till basen av aortabågen.
- Skär höger förmak med fina sax omedelbart, och starta sedan perfusionen i iskall, syresatt sackaros-ACSF genom gravitation.
Obs: Snabba och tillräcklig transcardial perfusion med iskall sackaros-ACSF kan underlätta för snabb kylning av ryggmärgen, medan låg natrium och kalcium koncentration kan hjälpa lindra excitatoriska toxicitet och skydda nervcellernas funktion. Dessutom skulle det vara fördelaktigt för att minska den bakgrundsfärgning av biocytin när du utför en morfologisk studie clearing röda blodkroppar. Perfusionen anses tillräcklig och nöjda så länge vätskan spännande höger förmak är klart och färgen på råttans levern och tassar är blek. Spetsen på 22 G nålen bör vara trubbigt att undvika spricker hjärta och aortabågen.
- Vänta i 2 – 3 min efter en enda injektion (intraperitoneal, i.p.) av uretan (1,5 g/kg), och bedöma anestesi djupet hos råttor genom att testa tå eller svans nypa svaren. När ett kirurgiskt plan av anestesi bibehålls, placera råtta på krossad is i ryggläge.
- Ryggmärgen dissektion och skivning
- Gör ett längsgående snitt (5 cm) på ryggen huden från stjärtfenan till rostralt, sedan skära igenom bröstkorgen mellan ryggraden och revbenen på vardera sidan av perfusion.
- Göra ett snitt i kaudala slutet av ryggraden, använd sax för att klippa bort omgivande vävnader och isolera det lumbosakrala segmentet i ryggraden snabbt.
- Överföra lumbosakrala segmentet till en glasskål som innehåller iskall sackaros-baserade ACSF. Med den ventrala delen uppåt, Använd fin sax att skära igenom den vertebrala BLOMSTJÄLK bilateralt och exponera ryggmärgen noggrant. Isolera en 2 cm lång ryggmärgen med lumbosakrala utvidgningen (L1 – S3) och överföra avsnittet spinal till en annan glasskål fylld med kall sackaros-ACSF.
- Ta bort hjärnhinnorna och pia-spindelvävshinnan membranet i dissekera Mikroskop. Skär alla ventrala och dorsala rötter bort så snabbt som möjligt.
- Placera ryggmärgen på ett tidigare putsade agar block. Att förbereda tvärgående skivor, fäst ventrala sida av ryggmärgen att ägarn och låt ryggsidan mot bladet. För att förbereda parasagittal skivor, fäst den ventral sidan med superlim ägarn i vertikal riktning som visas i figur 1. Montera sedan, agar blocket till en plattform för en vibratome med superlim. Förbereda 300 – 500 µm tvärgående eller parasagittal skivor med ett förskott hastighet av 0,025 mm/s och en vibrationer frekvens 80 Hz.
- Använd en plast-trimmade pipett för att överföra skivor på nylon mesh i en lagring kammare som innehåller kontinuerligt syresatt ACSF vid 32 ° C i minst 30 min före inspelning.
Obs: var noga med för att undvika skador på ryggmärgen, särskilt den dorsala hornen, när du tar bort de hjärnhinnor och spinal rötter. Ryggmärgen bör vara skivad dorsal-ventralt. För bästa resultat, bör skivor utarbetas snabbt (inom 15 – 20 min). Tjockleken på en spinal skiva bör vara mer än 600 µm att tillfredsställa cell synlighet. Den teknik som beskrivs ovan kan dessutom användas för att erhålla horisontella spinal skivor.
4. hela-cell Patch-clamp Recordings
- För att genomföra hela-cell patch-clamp inspelningarna från SG nervceller, använda K+-baserat intracellulära lösning för inspelning för det mesta samtidigt som Cs+-baserad lösning bara för inspelning av hämmande postsynaptiska strömmar.
- Försiktigt flytta ett ryggmärgen segment till avdelningen i inspelning och sedan underhålla den med en U-formad platina tråd fäst med nylontrådar ordentligt för optimal skiva stabilitet. Stadigt BEGJUTA på segmentet med bubblade ACSF på RT genom ett allvar system och fastställa skattesatsen perfusion vid 2-4 mL/min att uppnå tillräcklig syresättning.
- Identifiera regionen i SG (ett genomskinligt band) använder en lågupplöst mikroskop lins, välja en friska neuron med högupplösta målet som målcellen och justera det till mitten av skärmen video monitor.
- Fyll en mikropipett med en lämplig volym av K+-baserat eller Cs+-baserat intracellulära lösning behövs, sätt mikropipett i elektrodhållare och säkerställa att den intracellulära lösningen är att kontakta silvertråd inuti den hållare.
- Föra mikropipett i fokus och fördjupa det i den ACSF använder en micromanipulator, och sedan tillämpa en mild övertryck (~ 1 psi mätt med manometer) att tvinga mikropipett från all smuts och skräp.
- Flytta mikropipett mot riktade neuron gradvis. Släpp det positiva trycket när pipetten närmar sig neuron och bildar en mycket liten grop på neuronala membran att bilda en gigaseal.
- Förändra anläggningen som är potentiella till -70 mV, vilket nära den fysiologiska vilar membranpotential (RMP) i en cell. Då gäller en övergående och milda sug den mikropipett att brista membranet och skapa en bra helhet-cell-konfiguration.
Efter överföring skiva in i inspelningen kammaren, kontrollera stadig perfusion i minst 5 min att rensa skräp på skiva ytan. Det är värt att notera att förmågan att skilja mellan friska och ohälsosamma/döda nervceller är av största vikt för god tätning och stabil inspelning. En ohälsosam/dead neuron har en svullen eller krympta utseende, tillsammans med en synlig stor kärna, medan en frisk nervcell kännetecknas av en 3-dimensionell (3D) form med ljusa och mjuka membran, och dess kärna är osynlig. För att uppnå en konfiguration för hela-celler, är det viktigt att kompensera för snabb eller långsam kapacitans stegvis vid behov. RT, flytande korsningen potentiella beräknas vara 15.1 – 15.2 mV och 4.3 – 4,4 mV i K+-baserat och Cs+-baserat intracellulära lösning, respektive. I våra studier korrigerades inte inspelade data för flytande junction potential. - Inspelningar av inneboende membran boenden
- Spela in passiva inneboende membran egenskaper: post RMP omedelbart (inom 20 s) efter paus i. Bestämma den neuronala Ingångsmotstånd genom att mäta spänning svaret på ett depolariserande nuvarande (10 pA, 500 ms) på RMP i ström-clamp-läge.
- Spela in bränning boenden: testa bränning mönster av varje neuron i ström-klämma med en rad 1 s depolariserande strömpulser (25 – 150 pA med 25 pA increment) på RMP. Mäta gräns, amplituden och halv-bredd av en enstaka aktionspotential offline.
- Spela in subthreshold ström: för att bedöma de somatiska subthreshold strömmarna, håll membranet potential på -50 mV i spänning-clamp-läge. Sedan tillämpa en serie hyperpolarizing spänning pulser av 1 s varaktighet från -60 mV till -120 mV, med ett 10-mV dekrement.
- Spela in excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs): post EPSCs med K+-baserat intracellulära lösning i spänning-clamp läge vid en anläggning potential -70 mV.
- Spela in IPSCs: Applicera Cs+-baserat intracellulära lösning för inspelning IPSCs. När hela-cell konfigurationen är etablerad, håll membranet potential på -70 mV för ~ 5 min och då ändra anläggningen som är potentiella 0 mV gradvis. Vänta några minuter för stabilisering, och sedan börja spela in händelserna IPSC.
Obs: Endast nervceller med en Riskhanteringsplan mindre än-50 mV och visar överskridandet bör väljas för vidare studier. De serie motstånd i vår studie är vanligtvis 10-30 MΩ, och en inspelning bör uteslutas när serien motståndet ändras med mer än 20%. EPSCs kunde bekräftas med en bad tillämpning av 50 µM APV och 20 µM CNQX, medan IPSCs kunde bekräftas med 10 µM bicucullin och 1 µM stryknin.
5. morfologisk studie
- För morfologiska experiment, använda en K+-baserat intracellulära lösning innehållande 0,05% neurobiotin 488.
- Efter att upprätthålla en stabil elektrofysiologiska inspelning för minst 20 min, avlägsna sakta mikropipett i uppåtgående riktning att cellmembranet att återförsluta och överföra ryggmärgen segmentet till en behållare fylld med 4% PFA. Fixa skivor i 4% PFA vid RT för 1 h och sedan vid 4° C över natten.
- Skölj skivor i PBS, och sedan doppa dem i 50% etanol i 30 min. Efter en annan tre tvättar i PBS, montera skivor i deras ursprungliga tjocklek på bilder med en monteringsmedium.
- Använda en confocal Mikroskop (se Tabell för material) bild förvärv och neuronala 3D rekonstruktion. Skanna nervceller genom en 20 X lins med en z-bibba 1,5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akut ryggmärgen skivor var beredda enligt diagrammet visas i figur 1. Efter skivning och återhämtning överfördes ett segment av ryggmärgen till inspelning kammaren. Friska nervceller identifierades baserat på soma utseende med hjälp av IR-DIC mikroskopi. Nästa, handlingspänningar av SG nervceller var framkallas genom en serie av depolariserande strömpulser (1 s varaktighet) När nervceller hölls på RMP. Som visas i figur 2, bränning mönster observerades i SG nervceller ingår tonic-bränning, försenad-bränning applikationer, gap-bränning, initial-burst, phasic-spricker, singel-spike och ovilliga-bränning, som har beskrivits och kategoriseras av tidigare studier.
Genomförandet av detta preparat, in vi också subthreshold strömmar och spontant visasende strömmar spänningen klämman. Representativa spår av subthreshold strömmar, inklusive hyperpolarisering-aktiverat ström (jagh), T-typ kalcium aktuella (IT) och A-typ kalium nuvarande (IA), ges i figur 3A. Dessa strömmar erhölls genom att hålla cellerna på -50 mV och gradvis kliva i 10-mV minskningar från -60 till -120 mV. Jagh aktiverades av hyperpolarizing spänningen steg. Dock aktiverades IT och IA av hyperpolarizing prepulses att släppa från inaktivering följt med en Aricebo spänning. Figur 3B 3 C Visa representant spontana EPSCs (sEPSCs) och IPSCs (sIPSCs) som inspelade från SG nervceller, respektive. Den amplitud och frekvens av dessa synaptic händelser kunde analyseras med hjälp av mini analys programvara offline.
För att karakterisera neuronala morfologiska egenskaper, tillämpades parasagittal skivor eftersom de flesta av SG nervceller har betydligt rostrocaudal spridningen av dendritiska träd och neurobiotin 488 lades till intracellulära lösningar. Storleken på neuronal soma och till omfattningen och dimensioner av deras dendritiska processer utvärderades efter konfokalmikroskopi imaging. Som rapporterats tidigare, SG nervceller Visa morfologiska skillnader och kunde kategoriseras in i central celler, radiella celler, vertikala celler, cellöar och oklassificerade celler. Representativ micrographs av dessa celler visas i figur 4.
Figur 1: Diagram för akut ryggmärgen slice förberedelse. Efter att vara djupt sövd med uretan (i.p.), är råttor transcardially perfusion med iskall carbogenated sackaros-ACSF. Ryggraden är sedan snabbt dissekeras och en ventral laminektomi utförs. Hjärnhinnan, pia-spindelvävshinnan membranet och bifogade spinal nervrötter tas bort. Sedan, ryggmärgen preparatet är monterad på en agaros block. Tvärgående eller parasagittal skivor skärs med en vibratome som behövs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bränning mönster av nervceller som SG. Bränning mönster bestäms genom att injicera en rad 1 s depolariserande strömimpulser i en SG neuron på RMP. Bränning mönster kan klassificeras som tonic-bränning, försenad-bränning, gap-bränning, initial-burst, phasic-spricker, singel-spike och ovilliga-bränning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: spänning-clamp inspelningar i SG neuroner. (A) representativa spår visar att bemöta hyperpolarizing nuvarande injektion klassificeras som jagh,a och jagT. Den nedre panelen visar frammana protokollet för sub tröskel strömmar i spänning-klämma. (B) representativa spår av sEPSCs inspelade från SG nervceller på -70 mV i frånvaro och närvaro av minst 50 μM APV och 20 μM CNQX. Lägre i rad spår, vilka visas i en utökad tidsskala före (vänster) och under (höger) motsvarar APV och CNQX, en period som anges av en bar visas nedan diagram inspelningen. (C) representativa spår av sIPSCs inspelade från SG nervceller i frånvaro och närvaro av 10 μM bicucullin och 1 μM stryknin vid 0 mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa morfologi av råtta SG nervceller. Enligt soma storlekar och dendrite egenskaperna i konfokalmikroskopi bilder, kan SG nervceller klassificeras som den centrala cell (A), radiella cell (B), vertikal cell (C), holme cell (D) och oklassificerade cell (E ). V: ventrala; D: dorsala; R: rostralt; C: stjärtfenan. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Komponent | Molekylvikt | Koncentration (mM) | HB |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glukos | 180 | 11 | 1,98 |
| Askorbinsyra | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium pyruvat | 110 | 2 | 0,22 |
Tabell 1: Recept för ACSF.
| Komponent | Molekylvikt | Koncentration (mM) | HB |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glukos | 180 | 11 | 1,98 |
| Askorbinsyra | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium pyruvat | 110 | 2 | 0,22 |
Tabell 2: Recept för sackaros-ACSF.
| Komponent | Molekylvikt | Koncentration (mM) | mg/100 mL |
| K-glukonat | 234,2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tabell 3: Recept för K+-baserat intracellulära lösning.
| Komponent | Molekylvikt | Koncentration (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| TE-Cl | 165.71 | 5 | 82,86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tabell 4: Recept för Cs+-baserat intracellulära lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokolldetaljer stegen för att förbereda ryggmärgen skivor, som vi har använt framgångsrikt när du utför hela-cell patch-clamp experiment på SG nervceller18,19,20,21. Genom att implementera denna metod, vi nyligen rapporterade att minocyklin, en andra generation av tetracyklin, kan markant förbättra hämmande synaptisk transmission genom en presynaptiska mekanism i SG nervceller19. Denna agent kan dessutom minska amplituden av Ih och ytterligare hämma retbarhet av SG nervceller21. Till stöd för dessa publicerade data och de representativa resultat att vi visar här, den nu beskrivna metoden är lämplig för användning i ett brett utbud av elektrofysiologiska studier.
Som vi noterat tidigare, är transcardial perfusion avgörande för att få friska exemplar. Först använder vi iskalla lösning för perfusion så att ryggmärgen kan kylas snabbt och neuronal metabolism kan vara långsammare22. Andra, sackaros-substituerade ACSF, en 'skyddande skärning' lösning med låg Na+ koncentration, kan lindra passiva Na+ tillströmning och därmed minska neuronala ödem genom vatten posten23. För det tredje är det fördelaktigt att inhämta och analysera neuronala morfologi eftersom perfusion kan minimera bakgrunden orsakas av biocytin22. För framgångsrika preparat är det också viktigt att använda vissa antioxidanter för att minska oxidativ skada, som tillåter neuronala bevarande24. Därav, i våra protokoll, vi komplettera askorbinsyra och natrium pyruvat, som är kraftfulla antioxidanter och kan lindra ödem i ryggmärgen skivor effektivt, både ACSF och sackaros-ACSF. Också, enligt vår erfarenhet kan vi få friska ryggmärgen skivor framgångsrikt från neonatal samt 3 – 10 veckor gamla SD råttor. Således, för detta protokoll ska lyckas, rekommenderar vi SD råttor som är mindre än 10 veckor gamla.
Medan utföra 'ventrala' laminektomi och ta bort hjärnhinnorna och spinal nerver, bör patienten och noga med att undvika skärning, stretching eller dela upp ryggmärgen. I några studier, ryggmärgen skivor med bifogade dorsala rötter har använts för att utvärdera den synaptiska transmissionen SG nervceller fick perifert25,26. Förfarandet för att ta bort pia-spindelvävshinnan membran är av tekniska svårigheter i detta fall, och det kräver en hel del tålamod.
Denna skiva som förbereder teknik också har vissa begränsningar. En klar nackdel är att även om akut skivor bevara riklig synapsförbindelser, inte kunde det återspeglar det verkliga tillståndet och åtgärda vad som exakt händer i vivo. Alltså, vissa studier har genomförts i vivo inspelningar som normalt utförs 'blind'27,28,29. Dock detta in vivo -metod är tekniskt krävande och det är svårt att berätta om en inspelning utförs från soma eller dendrite utan tillräcklig erfarenhet. En annan begränsning av vår nuvarande metod är att sackaros-ACSF inte kan räcka för neuronal bevarande när du förbereder skivor från åldrande gnagare. En uppdaterad strategi använder N-metyl-D-glucamine som ett Na+ substitut har föreslagits, och denna optimerad metod kan markant förbättra morfologiska och funktionella bevarandet av nervceller i akut skivor30,31 ,32,33. Slutligen visar SG neuroner olika morfologiska och elektrofysiologiska egenskaper3. Det verkar svårt att tolka data som erhållits från hela-cell inspelningar med utsikt över heterogenitet. Denna begränsning kan vara kringgås genom ytterligare verifiera morfologiska detaljuppgifter om nervceller5 eller med hjälp av transgena möss, som kunde hjälpa forskarna att identifiera specifika nervceller20,34. Optogenetik, ett nytt verktyg som möjliggör kontroll av en subpopulation av celler35, kan dessutom kombineras med hela-cell patch-clamp inspelning att studera specifika jonkanaler eller proteiner roll och utreda specifika neuronala kretsar.
Sammantaget är denna förberedelse teknik ett idealiskt sätt att undersöka de elektrofysiologiska, morfologiska, farmakologiska och biologiska egenskaperna hos SG nervceller, kompletteras med patch-clamp inspelning, Immunofluorescerande färgning, specifika agonister eller antagonister och encelliga RT-PCR-tekniken. Dessutom detta synsätt kan tillämpas tillsammans med Parade patch-clamp inspelningar eller optogenetik, och det är därför ett värdefullt verktyg för upplysande de neuronala mikrokretsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (nr. 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
