Summary
Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.
Abstract
Estudos recentes de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios da substância gelatinosa (SG) forneceram uma grande quantidade de informações sobre os mecanismos da coluna vertebral subjacente a transmissão sensorial nociceptivo regulamento e desenvolvimento de dor ou coceira crônico. Implementações de gravações eletrofisiológicas juntamente com estudos morfológicos, baseados sobre a utilidade das fatias aguda da medula espinhal têm melhorado ainda mais nossa compreensão das propriedades neuronais e a composição dos circuitos locais em SG. Aqui, apresentamos um guia detalhado e prático para a preparação de fatias da medula espinhal e show de gravação de células inteiras representativa e resultados morfológicos. Este protocolo permite preservação neuronal ideal e pode imitar condições na vivo até certo ponto. Em resumo, a capacidade de obter uma preparação em vitro de medula espinhal fatias permite gravações de braçadeira da tensão e corrente estável e assim poderia facilitar investigações detalhadas sobre as propriedades intrínsecas da membrana, circuitos locais e estrutura neuronal usando diversas abordagens experimentais.
Introduction
A substância gelatinosa (SG, lâmina II do Corno dorsal da coluna vertebral) é um centro de retransmissão indiscutivelmente importante para transmitir e regulamenta a informação sensorial. É composto por interneurônios excitatórios e inibitórios, que recebem entradas das fibras aferentes primárias, interneurônios locais e a endógena de sistema inibitório descendente1. Nas últimas décadas, o desenvolvimento da preparação de fatia aguda da medula espinhal e o advento da gravação de células inteiras remendo-braçadeira permitiram que vários estudos sobre as propriedades intrínsecas eletrofisiológicos e morfológicos da SG neurônios2, 3 , 4 , bem como estudos os circuitos locais em SG5,6. Além disso, usando a preparação de fatia de medula espinhal em vitro , pesquisadores podem interpretar as mudanças no neuronal excitabilities7,8, a função do íon canais9,10, e atividades sinápticas11,12 , sob várias condições patológicas. Estes estudos têm aprofundado nossa compreensão do papel que os neurônios SG desempenham no desenvolvimento e manutenção da dor crônica e coceira neuropática.
Essencialmente, o pré-requisito fundamental para alcançar uma clara visualização da soma neuronal e ideal de células inteiras remendo usando fatias aguda da medula espinhal é para garantir a qualidade excelente de fatias então neurônios saudáveis e patchable podem ser obtidos. No entanto, preparar fatias de medula espinhal envolve várias etapas, como realizando uma laminectomia ventral e remoção da membrana pia-aracnoide, que pode ser obstáculos na obtenção de fatias saudáveis. Embora não seja fácil preparar fatias da medula espinhal, realizar gravações em vitro na medula espinhal fatias tem várias vantagens. Em comparação com preparações da cultura de pilha, fatias da medula espinhal podem preservar parcialmente inerentes conexões sinápticas que estão em uma condição fisiologicamente relevante. Além disso, a célula inteira remendo-braçadeira gravação usando fatias de medula espinhal poderia ser combinado com outras técnicas, tais como remendo duplo grampo13,14, estudos morfológicos15,16 e célula única RT-PCR 17. portanto, esta técnica fornece mais informações sobre caracterizando as diversidades genéticas e anatômicas em uma região específica e permite a investigação da composição do circuito local.
Aqui, nós fornecemos uma descrição básica e detalhada do nosso método para preparar fatias aguda da medula espinhal e adquirir as gravações de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios SG.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais descritos foram aprovados pela Animal ética Comissão de Nanchang University (Nanchang, China PR, ética No.2017-010). Foram envidados todos os esforços para minimizar o estresse e a dor dos animais experimentais. As gravações eletrofisiológicas realizadas aqui foram realizadas à temperatura ambiente (RT, 22-25 ° C).
1. os animais
- Use ratos Sprague-Dawley (3-5 semanas de idade) de ambos os sexos. Os animais sob um ciclo claro-escuro de 12 h de casa e dar-lhes acesso ad libitum à água e alimentação adequada.
2. preparação de soluções e materiais
- Soluções
- Preparar artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) (em mM): NaCl 117, 3.6 KCl, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glicose, ácido ascórbico 0,4 e 2 piruvato de sódio. Consulte a tabela 1.
- Prepare-se sacarose-ACSF (em mM): 240 sacarose, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3.5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, o ácido ascórbico 0,4 e piruvato de sódio 2. Consulte a tabela 2.
- Preparar o K+-baseado solução intracelular (em mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 at2-fosfocreatina, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP e 0,3 Li-GTP. Consulte a tabela 3.
- Preparar o Cs+-baseado solução intracelular (em mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 at2-fosfocreatina, 5 tetraethylammonium (TEA) - Cl 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP e 0,3 Li-GTP. Consulte a tabela 4.
Nota: Todas as soluções devem ser preparadas usando água destilada. ACSF e sacarose-ACSF devem ser carbogenated (95% O2 e 5% CO2 mistura) antes da sua utilização para manter um pH ideal de aproximadamente 7.4, e a osmolalidade destas duas soluções deve ser ajustada para 300-310 mOsm. Porque o ácido ascórbico pode afetar canais de cálcio, este agente deve ser omitido se uma gostaria de gravar as correntes de cálcio. A osmolalidade e o pH intracelular soluções devem ser medidos e ajustados para 290 – 300 mOsm e 7.2 – 7,3, respectivamente. Recomenda-se filtrar as soluções intracelulares com 0,2 µm filtros e armazenar as soluções como alíquotas de 1ml a-20 ° C. Cs+ e chá são aplicadas no Cs+-baseado intracelular solução para bloquear canal de potássio, que é propício para utilizar o amplificador que têm o potencial de membrana constante em 0 mV durante a gravação de correntes pós-sináptico inibitórias (IPSCs). - Prepare a solução de neurobiotin 488 de 0,05%. Dissolver 2 mg de neurobiotin 488 em 4 mL de K+-baseado solução intracelular e ajustar a pressão osmótica de 290 – 300 mOsm usando água destilada ou sacarose se necessário.
Nota: 1 mM de sacarose aumenta a osmolaridade por 1 mOsm. - Prepare-se 3% de ágar como um bloco para a medula espinhal. Dissolver a 7,5 g de ágar-ágar em 250 mL de água filtrada num copo de vidro e então use um microondas para esquentar até ferver e limpar. Agitar a solução e despeje a mistura em um 17,5 x 10,5 cm x 1.8 cm plástico caixa solidificação depois. Manter o ágar a 4 ° C antes de usar.
- Prepare-se para o processamento de imuno-histoquímica paraformaldeído 4% (PFA). Mix 40 g de pó PFA para ~ 800 mL de aquecido (aproximadamente 60 ° C) 1 x solução de PBS (130 mM de NaCl, 7mm Na2HPO4, 3mm NaH2PO4). Lentamente, ajuste o pH adicionando gotas de NaOH N 1 até pó PFA é completamente dissolvido. Uma vez que a solução tornou-se claro, ajuste o volume total de 1 L com PBS 1x. Reajuste o pH para 7,2-7,4 usando 1 N HCl, quando necessário, em seguida, filtrar a solução PFA 4% e armazená-lo a-20 ° C até o uso.
Nota: PFA é tóxico, portanto é necessário usar máscaras, luvas, bem como óculos de segurança. Conduzir o processo de preparação 4% PFA dentro de uma campânula ventilada. Pó PFA pode ser completamente dissolvido em um pH de aproximadamente 9-10.
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Instrumentos
- Para um sistema típico eletrofisiológico, usar um microscópio vertical equipado com contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) e um objectivo de imersão de água de alta resolução, uma câmera CCD/CMOS, um amplificador de remendo-braçadeira, titular de uma micropipeta e um micromanipulador permitindo o ajuste fino da posição da pipeta. Numa fase XY é igualmente necessária para mover o microscópio.
- Monte todo o equipamento sobre uma mesa de isolamento de vibração rodeado por uma gaiola de Faraday. Conecte um monitor de vídeo da câmera de vídeo para observar os neurônios e visualizar as micropipetas.
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Micropipetas
- Fazer gravação eletrodos de capilares de vidro de borosilicato usando um extrator da micropipeta. A pipeta típica resistência varia MΩ 3-6 quando preenchido com solução intracelular.
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Bloco de ágar
- Prepare um 1,2 x 1,5 cm x bloco de ágar 2,0 cm. Apare o bloco nas formas mostradas na Figura 1 conforme necessário.
3. aguda da medula espinhal fatia preparação
Nota: Fatias de medula espinhal transversal ou parassagital são preparadas como anteriormente descrito18,19,20.
- Antes da perfusão transcardial e extração de medula espinhal, preparar ~ 500 mL sacarose-ACSF incubado com 95% O2 e 5% de CO2 e esfriar a solução gelada (0 – 4 ° C).
- Refrigerar para baixo todas as ferramentas de dissecação (por exemplo, dissecando a tesoura, tesoura de íris, fórceps dentado, pinça fina, pinça curvada) no gelo. O diagrama da preparação de fatia aguda da medula espinhal é mostrado na Figura 1.
- Transcardial perfusão
- Após uma única injeção (intraperitoneal, i.p.) de uretano (1,5 g/kg), aguardar 2-3 min e avaliar a profundidade de anestesia de ratos através do teste do dedo do pé ou cauda pitada de respostas. Uma vez que um avião cirúrgico da anestesia é mantido, coloque o rato sobre gelo picado na posição supina.
Nota: Para produzir o suficiente para a não-percepção da dor profunda anestesia durante a toracotomia, siga seu local IACUC. - Fazer uma incisão (3 – 4 cm), através da pele do processo xifoide à clavícula e em seguida, faça uma incisão transversal abaixo do nível do processo xifoide.
- Segure e levante o apêndice xifoide com um par de pinças curvas para expor o diafragma completamente. Faça uma incisão transversal através do diafragma e então atravessar a caixa torácica, entre o esterno e as costelas bilateralmente para abrir a cavidade torácica. Use a pinça curvada para compreender o processo xifoide, então a caixa torácica é fixo, e o coração é suficientemente exposto.
- Mantenha o coração com outra pinça curva suavemente e em seguida, inserir uma agulha 22g através do ventrículo esquerdo para a base do arco aórtico.
- Corte o átrio direito com uma tesoura bem imediatamente e em seguida, iniciar a perfusão de sacarose-ACSF gelada, oxigenado através de um sistema de gravidade.
Nota: Transcardial rápida e suficiente perfusão com sacarose-ACSF gelada pode facilitar a refrigeração rápida da medula espinhal, enquanto baixa concentração de sódio e cálcio pode ajudar a aliviar a toxicidade excitatória e proteger a função neuronal. Além disso, limpar as células vermelhas do sangue seria benéfica para reduzir a coloração de fundo de biocytin ao realizar um estudo morfológico. A perfusão é considerado suficiente e satisfeito enquanto o fluido sair do átrio direito é claro e a cor de fígado de rato e patas é pálida. A ponta da agulha 22g deve ser brusco para evitar a ruptura do coração e do arco aórtico.
- Após uma única injeção (intraperitoneal, i.p.) de uretano (1,5 g/kg), aguardar 2-3 min e avaliar a profundidade de anestesia de ratos através do teste do dedo do pé ou cauda pitada de respostas. Uma vez que um avião cirúrgico da anestesia é mantido, coloque o rato sobre gelo picado na posição supina.
- Medula espinhal dissecação e corte
- Faça uma incisão longitudinal (5 cm) na pele volta de caudal para rostral, em seguida, corte em ambos os lados do estado de perfusão através da caixa torácica entre a coluna vertebral e costelas.
- Fazer um corte na extremidade caudal da coluna vertebral, use tesouras para cortar tecidos circunvizinhos e isolar o segmento lombossacral da coluna vertebral rapidamente.
- Transferi o segmento lombossacral para um prato de vidro contendo gelada ACSF baseados em sacarose. Com o lado ventral para cima, use tesoura fina para cortar pedículo vertebral bilateralmente e expor a medula espinhal cuidadosamente. Isolar um 2-cm longo medular com alargamento lombossacral (L1 – S3) e transferir a secção da coluna vertebral para um outro prato de vidro cheio de sacarose-ACSF frio.
- Remova as meninges e a membrana aracnoide pia sob um microscópio de dissecação. Corte todos os ventrais e dorsais raízes tão rapidamente quanto possível.
- Coloque a medula espinhal em um bloco de ágar previamente aparadas. Para preparar fatias transversais, anexar o lado ventral da medula espinhal para o ágar e deixe o lado dorsal em direcção à lâmina. Para preparar fatias parasagital, anexe o lado ventral com supercola para o ágar-ágar em uma direção vertical conforme mostrado na Figura 1. Em seguida, monte o bloco de ágar para uma plataforma de um vibratome com super cola. Prepare-se 300 – 500 µm transversal ou parassagital fatias com uma velocidade de avanço de 0.025 mm/s e uma frequência de vibração de 80 Hz.
- Use uma pipeta plástica-aparado para transferir as fatias no engranzamento de nylon em uma câmara de armazenamento contendo ACSF continuamente oxigenado a 32 ° C, durante pelo menos 30 minutos antes da gravação.
Nota: tenha cuidado para evitar a lesão da medula espinhal, especialmente o corno dorsal, quando removendo as meninges e as raízes da coluna vertebral. A medula espinhal deve ser fatiada dorso-ventralmente. Para os melhores resultados, as fatias devem estar preparadas rapidamente (dentro de 15-20 min). A espessura de uma fatia da coluna vertebral deve ser não mais de 600 µm para satisfazer a visibilidade da célula. Além disso, a técnica descrita acima pode ser usada para obter fatias na coluna horizontais.
4. células inteiras Patch-clamp gravações
- Para realizar as gravações de células inteiras remendo-braçadeira de neurônios SG, use K+-baseado intracelular solução para a maioria dos casos de gravação, enquanto aplica o Cs+-baseado solução apenas para a gravação das correntes pós-sináptico inibitórias.
- Movimente suavemente uma fatia da medula espinhal para a câmara de gravação e então manter ele com um fio de platina em U anexado com fios de nylon firmemente para fatia óptima estabilidade. Firmemente perfundir a fatia com ACSF borbulhado em RT, através de um sistema de gravidade e definir a taxa de perfusão em 2 – 4 mL/min para alcançar a oxigenação suficiente.
- Identificar a região de SG (uma banda translúcida), usando uma lente do microscópio de baixa resolução, escolher um neurônio saudável usando o objectivo de alta resolução como a célula-alvo e ajustá-lo para o centro da tela do monitor de vídeo.
- Encha uma micropipeta com um volume adequado de K+-baseado ou Cs+-solução intracelular de base, conforme necessário, insira a micropipeta o eléctrodo e certifique-se de que a solução intracelular está em contacto com o fio de prata dentro o titular.
- Focar a micropipeta e mergulhá-lo na ACSF usando um micromanipulador e em seguida, aplique uma leve pressão positiva (~ 1 psi quando medido com um manômetro) para forçar a micropipeta longe de toda a sujeira e detritos.
- Mova a micropipeta para o neurônio alvo gradualmente. Libera a pressão positiva, uma vez que a pipeta aproxima-se o neurônio e formar uma pequena covinha na membrana neuronal para formar um gigaseal.
- Alterar a exploração potencial de -70 mV, que está perto o fisiológico descansando o potencial de membrana (RMP) de uma célula. Em seguida, aplica uma sucção suave e transitória para a micropipeta para romper a membrana e criar uma boa configuração de células inteiras.
Nota: Após a transferência a fatia na câmara de gravação, certifique-se de perfusão constante pelo menos 5 min limpar os escombros na superfície de fatia. É interessante notar que a capacidade de distinguir entre os neurônios saudáveis e insalubres/mortos é de suma importância para boa selagem e gravação estável. Um neurônio insalubres/mortos tem uma aparência inchada ou encolhida, juntamente com um grande núcleo visível, enquanto um neurônio saudável é caracterizado por uma forma de (3D) 3-dimensional com uma membrana Lisa e brilhante, e seu núcleo é invisível. Para obter uma configuração de células inteiras, é essencial para compensar a capacitância rápida ou lenta passo a passo quando necessário. No RT, a potencial de junção líquida é calculada para ser 15.1 – 15,2 mV e 4.3 – 4,4 mV em K+-baseado e Cs+-solução baseada em intracelular, respectivamente. Em nossos estudos, os dados gravados não foram corrigidos para o potencial de junção líquida. - Gravações de propriedades intrínsecas da membrana
- Gravar propriedades passivas da membrana intrínseca: RMP registro imediatamente (dentro de 20 s) após a pausa em. Determine a resistência de entrada neuronal, medindo a resposta de tensão de uma corrente despolarizantes (10 pA, 500 ms) em RMP em modo de corrente-braçadeira.
- Registro de propriedades de queima: teste padrão de cada neurônio disparar em corrente-braçadeira com uma série de 1 s despolarizantes pulsos de corrente (25-150 pA com incremento de 25 pA) no RMP. Medir o limite, amplitude e meia largura de uma única ação potencial off-line.
- Gravar a corrente abaixo do limite: para avaliar as correntes somáticas abaixo do limite, segurar a membrana potencial em -50 mV no modo de tensão-braçadeira. Em seguida, aplicar uma série de hiperpolarização pulsos de tensão de 1 duração de s de -60 mV a -120 mV, com um decréscimo de 10 mV.
- Gravar as correntes pós-sináptico excitatórias (EPSCs): EPSCs de registro com o K+-baseado solução intracelular no modo de tensão-braçadeira com um potencial de exploração de -70 mV.
- IPSCs registros: Aplicar Cs+-intracelular solução para gravação de IPSCs base. Uma vez que a configuração de célula inteira é estabelecida, têm a membrana potencial de em -70 mV para ~ 5 min e em seguida, altere a exploração potencial para 0 mV gradualmente. Aguarde alguns minutos para estabilização e então começar a registrar os eventos IPSC.
Nota: Apenas os neurônios com uma RMP inferior a-50 mV e mostrando superação devem ser selecionados para um estudo mais aprofundado. As resistências de série em nosso estudo são tipicamente 10-30 MΩ, e uma gravação deve ser excluída, uma vez que a resistência série muda por mais de 20%. EPSCs podem ser confirmadas com uma aplicação de banho da APV de 50 µM e 20 µM CNQX, enquanto IPSCs podem ser confirmadas com 10 prosencefálico µM e 1 µM estricnina.
5. morfológico estudo
- Para experiências morfológicas, usar um K+-baseado intracelular solução contendo 0.05% neurobiotin 488.
- Depois de manter um estábulo eletrofisiológicos de gravação pelo menos 20 min, retire lentamente a micropipeta na direção ascendente para permitir que a membrana celular selar e transferir a fatia da medula espinhal para um recipiente com 4% PFA. Corrigir as fatias em 4% PFA RT por 1h e depois a 4° C durante a noite.
- Lave as fatias em PBS e em seguida mergulhe-os em etanol a 50% por 30 min. Após mais três lavagens em PBS, monte as fatias em sua espessura original para slides com um meio de montagem.
- Usar um microscópio confocal (ver Tabela de materiais) para a aquisição de imagem e reconstrução 3D neuronal. Digitalize os neurônios através de uma lente X 20 com uma pilha de 1,5 µm z.
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Representative Results
Aguda da medula espinhal fatias foram preparadas de acordo com o diagrama mostrado na Figura 1. Após corte e recuperação, uma fatia de medula espinhal foi transferida para a câmara de gravação. Os neurônios saudáveis foram identificados com base na soma de aparência usando microscopia IR-DIC. Em seguida, os potenciais de ação dos neurônios SG foram eliciados por uma série de despolarizar pulsos de corrente (1 s duração) quando os neurônios foram realizados na RMP. Como mostrado na Figura 2, os padrões de fuzilamento observados nos neurônios da SG incluídos tônico-fogo, acionamento do atraso, acionamento do fosso, inicial-explosão, fásicos-estourando, single-spike e relutante-fogo, que foram descritos e categorizados por estudos anteriores.
Implementar esta preparação, também registramos abaixo do limite correntes e correntes espontaneamente aparecendo no grampo de tensão. Traços representativos das correntes abaixo do limite, incluindo o hyperpolarization corrente (euh), T-tipo cálcio atual (IT) e potássio de tipo corrente (IA), são dadas na Figura 3A. Estas correntes foram obtidas por celas em -50 mV e gradualmente pisar em 10-mV diminui de -60 -120 mV. Euh foi ativado por hiperpolarização passos de tensão. No entanto, euT ea foram ativados por hiperpolarização prepulses liberar de inactivação seguida com uma tensão despolarizada. Figura 3B 3 C show representante espontânea EPSCs (sEPSCs) e IPSCs (sIPSCs), gravados a partir de neurônios SG, respectivamente. A amplitude e a frequência destes eventos sinápticos poderiam ser analisados usando o software de análise mini off-line.
Para caracterizar neuronais características morfológicas, parasagital fatias foram aplicadas porque a maioria dos neurônios SG tem significativamente rostrocaudal propagação de árvores dendríticas e neurobiotin 488 foi adicionado às soluções intracelulares. O tamanho da soma neuronal, bem como a amplitude e dimensões de seus processos dendríticas foram avaliados após a imagem de microscopia confocal. Como relatado anteriormente, os neurônios SG mostram distinções morfológicas e poderiam ser categorizados em células centrais, radiais células, células verticais, células das ilhotas e células não classificadas. Micrografias representativas dessas células são mostradas na Figura 4.
Figura 1: diagrama para preparação de fatia aguda da medula espinhal. Depois de ser profundamente anestesiados com urethan (i.p.), os ratos são transcardially perfundido com carbogenated gelada sacarose-ACSF. A coluna vertebral é então rapidamente dissecada e laminectomia ventral é executada. As meninges, pia-aracnoide da membrana e anexado nervo espinhal-raízes são removidas. Em seguida, a amostra da medula espinhal é montada em um bloco de agarose. Transversal ou parassagital fatias são cortadas com um vibratome conforme necessário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: disparar padrões de neurônios SG. Queima os padrões são determinados pela injeção de uma série de 1 s despolarizantes pulsos de corrente em um neurônio SG no RMP. Os padrões de disparo podem ser classificados como tônico-queima, adiada-acionamento, acionamento do fosso, inicial-explosão, fásicos-estourando, single-spike e relutante-queima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: gravações de tensão-braçadeira nos neurônios SG. (A) representante traços mostrando a resposta à hiperpolarização injeção atual classificada como euh,I e IT. O painel inferior mostra o protocolo evocando para correntes sub limiar em tensão-braçadeira. (B) traços representativos de sEPSCs gravado a partir de neurônios SG em -70 mV na ausência e presença de 50 μM APV e 20 μM CNQX. Baixar traços consecutivos, que são mostrados em uma escala de tempo expandida antes (esquerda) e sob (direita) a ação de APV e CNQX, correspondem a um período indicado por uma barra mostrada abaixo a gravação do gráfico. (C) traços representativos de sIPSCs gravado a partir de neurônios SG na ausência e presença de 10 prosencefálico μM e 1 μM estricnina em 0 mV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: morfologia representativa dos neurônios de rato SG. De acordo com os tamanhos de soma e dendrito propriedades mostradas em imagens de microscopia confocal, neurônios SG podem ser classificados como a célula central (A), célula radial (B), célula vertical (C), células da ilhota (D) e célula não classificada (E ). V: ventral; D: dorsal; R: rostral; C: caudal. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente de | Peso molecular | Concentração (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2, O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| O CaCl2·2H2 | 147 | 2.5 | 0,37 |
| O MgCl2·6H2 | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glicose | 180 | 11 | 1,98 |
| Ácido ascórbico | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| Piruvato de sódio | 110 | 2 | 0.22 |
Tabela 1: Receita para ACSF.
| Componente de | Peso molecular | Concentração (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74.5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2, O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| O CaCl2·2H2 | 147 | 2.5 | 0,37 |
| O MgCl2·6H2 | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glicose | 180 | 11 | 1,98 |
| Ácido ascórbico | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| Piruvato de sódio | 110 | 2 | 0.22 |
Tabela 2: Receita de sacarose-ACSF.
| Componente de | Peso molecular | Concentração (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconato | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74.5 | 5 | 37.28 |
| At2-fosfocreatina | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15,7 |
Tabela 3: Receita para K+-baseado solução intracelular.
| Componente de | Peso molecular | Concentração (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| At2-fosfocreatina | 453.38 | 10 | 453.38 |
| CHÁ-Cl | 165.71 | 5 | 82,86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15,7 |
Tabela 4: Receita para Cs+-baseado solução intracelular.
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Discussion
Este protocolo detalha as etapas para a preparação de fatias da medula espinhal, que usamos com sucesso ao realizar experimentos de células inteiras remendo-braçadeira na SG neurônios18,19,20,21. Ao implementar esse método, nós informou recentemente que a minociclina, uma segunda geração de tetraciclina, marcadamente poderia reforçar a transmissão sináptica inibitória através de um mecanismo pré-sináptica no SG neurônios19. Além disso, este agente poderia diminuir a amplitude de Ih e inibir ainda mais a excitabilidade dos neurônios de SG21. Para apoiar estas publicou dados e os resultados representativos que mostramos aqui, o método descrito no momento é adequado para uso em uma ampla gama de Estudos eletrofisiológicos.
Como observamos anteriormente, a perfusão transcardial é um elemento crucial para a obtenção de espécimes saudáveis. Primeiro, usar solução gelada para perfusão para a medula espinhal pode ser rapidamente resfriada e o metabolismo neuronal pode ser abrandou22. Segundo, sacarose-substituído ACSF, uma solução de 'corte protetora' com baixa concentração de at+ , pode melhorar o afluxo de at+ passivo e, portanto, diminuir o edema neuronal através de de entrada de água23. Em terceiro lugar, é benéfico obter e analisar a morfologia neuronal pois perfusão pode minimizar o fundo causado por biocytin,22. Para as preparações de sucesso, também é importante usar alguns antioxidantes para reduzir os danos oxidativos, que permite a preservação neuronal24. Daí, em nosso protocolo, complementamos o ácido ascórbico e piruvato de sódio, que são poderosos antioxidantes e amenizar o edema na medula espinhal fatias eficazmente, em ACSF e sacarose-ACSF. Também, em nossa experiência, podemos obter fatias de medula saudável com êxito de neonatal, bem como 3 – 10 semanas velhos ratos SD. Assim, para este protocolo para ser bem sucedido, recomendamos o uso de ratos SD que são menos de 10 semanas de idade.
Enquanto executando 'ventral' laminectomia e removendo as meninges e nervos espinhais, um devem ser paciente e cuidadoso para evitar o corte, alongamento ou dividindo a medula espinhal. Em alguns estudos, fatias de medula espinhal com anexado raízes dorsais têm sido utilizadas para avaliar o sinápticas neurônios transmissão SG perifericamente receberam25,26. O procedimento de remoção da membrana pia-aracnoide é de dificuldade técnica, neste caso, e requer muita paciência.
Esta fatia de preparação técnica também tem algumas limitações. Uma desvantagem clara é que embora fatias agudas preservar abundantes conexões sinápticas, pode não refletir o estado real e abordar o que exatamente acontece em vivo. Assim, alguns estudos têm implementado na vivo gravações que são normalmente executadas 'cego'27,28,29. No entanto, esta abordagem na vivo é tecnicamente desafiador, e é difícil dizer se uma gravação é executada a partir da soma ou dendrito sem experiência suficiente. Outra limitação do nosso método atual é que a sacarose-ACSF pode não ser suficiente para preservação neuronal ao preparar fatias de roedores do envelhecimento. Uma abordagem atualizada usando o N-metil-D-glucamine, como foi proposto um substituto at+ , e esta metodologia otimizada marcadamente poderia melhorar a conservação morfológica e funcional de neurônios em fatias aguda30,31 de32, ,33. Finalmente, neurônios SG mostram Propriedades morfológicas e eletrofisiológicas diferentes3. Parece difícil interpretar dados obtidos de gravações de células inteiras enquanto com vista para a heterogeneidade. Esta limitação pode ser evitou por mais verificando os detalhes morfológicos do gravado neurônios5 ou usando ratos transgénicos, que poderiam ajudar os pesquisadores a identificar neurônios específicos20,34. Além disso, o optogenetics, uma nova ferramenta que permite o controle de uma sub-população de células35, poderia ser combinado com células inteiras remendo-braçadeira de gravação para estudar o papel dos canais iônicos específicos ou proteínas e investigar circuitos neuronais específicos.
Em geral, esta técnica de preparação é uma maneira ideal de investigar as características eletrofisiológicas, morfológicas, farmacológicas e biológicas de neurônios SG, complementadas pela gravação da remendo-braçadeira, coloração imunofluorescente, específicos agonistas ou antagonistas e a técnica de RT-PCR de célula única. Além disso, esta abordagem pode ser aplicada em conjunto com gravações de remendo-braçadeira emparelhados ou optogenetics, e, portanto, é uma ferramenta valiosa para iluminar os microcircuitos neuronais.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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