Summary
Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.
Abstract
Bütün hücreli yama-kelepçe çalışmalar gözlemliyorum gelatinosa (SG) nöronlar gelen duyusal iletim, nosiseptif yönetmelik ve kronik ağrı ve kaşıntı geliştirme temel spinal mekanizmaları hakkında bilgi büyük gövdeli hazırladık. Uygulamaları ile birlikte akut spinal kord dilimleri yardımcı programında temel morfolojik araştırmalar elektrofizyolojik kayıtlar daha da nöronal özellikleri anlayışımızı ve SG yerel devre bileşimi iyileştirilmiştir. Burada, spinal kord dilimleri ve gösteri temsilcisi bütün hücreli kayıt ve morfolojik sonuçları hazırlanması için detaylı ve pratik bir rehber mevcut. Bu iletişim kuralı ideal nöronal koruma izni ve in vivo koşullar belli bir ölçüde taklit edebilirsiniz. Özetle, spinal kord dilimleri vitro hazırlanması elde etmek için yeteneği sağlar istikrarlı akım ve gerilim kelepçe kayıtları ve böylece içsel membran özellikleri, yerel devresi detaylı soruşturma kolaylaştırabilir ve nöronal yapısı çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanarak.
Introduction
Gözlemliyorum gelatinosa (SG, lamina II. spinal dorsal boynuz), verici ve duyusal bilgileri düzenleyen bir tartışmasız önemli geçiş merkezidir. Birincil afferent lifler, yerel interneurons ve endojen azalan inhibitör sistem1girdileri almak eksitatör ve inhibitör interneurons oluşur. Akut omurilik dilim hazırlık gelişimi ve bütün hücreli yama-kelepçe kayıt gelişiyle SG nöronlar2, iç elektrofizyolojik ve morfolojik özellikleri çeşitli çalışmalar son yıllarda etkin 3 , 4 gibi çalışmalar yerel devresi SG5,6. Ayrıca, vitro omurilik dilim hazırlık kullanarak, araştırmacılar nöronal excitabilities7,8değişiklikleri yorumlamak,9,10, iyon fonksiyonu kanalları ve sinaptik aktiviteleri11,12 çeşitli patolojik şartlar altında. Bu çalışmalar kronik ağrı ve nöropatik kaşıntı bakım ve SG nöronlar gelişiminde oynadığı rol bizim anlayış derinleştirdi.
Esasen, nöronal soma ve ideal bütün hücreli akut spinal kord dilimleri kullanarak yama açık bir görselleştirme elde etmek için anahtar sağlıklı ve tamsayı nöronlar elde edilebilir bu yüzden dilimleri mükemmel kalitesini garanti etmek için ön koşuldur. Ancak, spinal kord dilimleri hazırlanıyor ventral laminektomi gerçekleştirme ve sağlıklı dilimleri elde engeller olabilir pia-araknoid membran kaldırma gibi birkaç adımdan oluşur. Spinal kord dilimleri hazırlamak kolay olmasa da, kayıtları vitro omurilik dilimleri gerçekleştirme birçok avantajı vardır. Hücre kültür hazırlıkları için karşılaştırıldığında, spinal kord dilimleri kısmen bir fizyolojik ilgili durumdadır doğasında sinaptik bağlantıları koruyabilirsiniz. Buna ek olarak, tüm hücreli yama-kelepçe kayıt omurilik dilimleri kullanarak Çift Kişilik yama kelepçe13,14, morfolojik araştırmalar15,16 ve tek hücreli RT-PCR gibi diğer teknikleri ile kombine 17. bu nedenle, bu teknik belirli bir bölge içindeki anatomik ve genetik farklılıkların karakterize üzerinde daha fazla bilgi sağlar ve yerel devresi bileşimi incelenmesi için izin verir.
Burada, akut spinal kord dilimleri hazırlama ve bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları SG nöronlar edinme için bizim Yöntem, temel ve ayrıntılı açıklamasını sağlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm deneysel protokoller hayvan Etik Komitesi, Nanchang üniversite tarafından (Nanchang, PR Çin, etik No.2017-010) kabul edildi. Tüm çabaları stres ve deneysel hayvan ağrı en aza indirmek için yapılmıştır. Burada yapılan elektrofizyolojik kayıtlar oda sıcaklığında (RT, 22-25 ° C) gerçekleştirilmiştir.
1. hayvanlar
- Her iki cinsiyetten Sprague-Dawley rat (3-5 hafta eski) kullanın. 12 h koyu döngüsü altında hayvanlar ev ve onlara ad libitum erişim yeterli yiyecek ve su için.
2. çözüm ve malzemelerin hazırlanması
- Çözümleri
- Yapay serebrospinal sıvı (ACSF) (mM) hazırlamak: 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glikoz, 0.4 askorbik asit ve 2 Sodyum pyruvate. Bkz. Tablo 1.
- Sükroz-ACSF (mM) olarak hazırlamak: 240 sukroz, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 askorbik asit ve 2 Sodyum pyruvate. Tablo 2' ye bakın.
- K+hazırlamak-hücre içi çözümde (mM) dayalı: 130 K-glukonat, 5 KCl, 10 Na2-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP ve 0.3 Li-GTP. Tablo 3' e bakın.
- CS+hazırlamak-hücre içi çözümde (mM) dayalı: 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (çay) - Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP ve 0.3 Li-GTP. Bkz. Tablo 4.
Not: Tüm çözümler distile su kullanılarak hazırlanması gerekir. ACSF ve sukroz-ACSF carbogenated (% 95'i O2 ve %5 CO2 karışımı) yaklaşık 7,4 bir optimum pH korumak için kullanılmadan önce olmalıdır ve bu iki çözüm osmolalite 300-310 mOsm için ayarlanmalıdır. Askorbik asit kalsiyum kanalları etkileyebilir çünkü bir kalsiyum akımları kaydetmek istiyorsanız bu aracı ihmal gerekir. Osmolalite ve hücre içi çözümler pH ölçülen olmalı ve 290-300 mOsm ve 7,2-7.3, anılan sıraya göre ayarlanır. Bu hücre içi çözümler 0.2 µm filtreleriyle filtre uygulama ve çözümleri-20 ° C'de 1 mL aliquots olarak saklamak için tavsiye edilir CS+ ve çay için geçerli olan Cs+-membran potansiyeli tutmak için amplifikatör kullanmaya elverişli blok Potasyum kanal için hücre içi çözüm tabanlı 0 sabit inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs) kayıt yaparken mV. - % 0.05 neurobiotin 488 çözüm hazırlamak. K+neurobiotin 488 4 mL 2 mg çözülür-hücre içi çözüm tabanlı ve osmolalite 290-300 mOsm için gerekirse distile su veya sukroz kullanarak ayarlayın.
Not: sükroz 1 mM tarafından 1 mOsm Osmolarite artırır. - %3 agar bir taşı olarak spinal kord için hazır olun. Agar bir cam ölçek arıtılmış su 250 ml 7,5 gr dağıtılması ve bir mikrodalga kaynar kadar ısı ve temizlemek için kullanın. Çözüm girdap ve bir 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm plastik kutu için katılaşma sonra içine karışımı dökün. Agar 4 ° C'de kullanmak için önceden tutun.
- %4 paraformaldehyde (PFA) immunohistokimyasal işlenmek üzere hazırlayın. Mix 40 g ~ 800 mL için İngiltere'de yılın tozu ısıtmalı (yaklaşık 60 ° C) 1 x PBS çözüm (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Yavaş yavaş pH PFA tozu tamamen eriyene kadar 1 N NaOH damla ekleyerek ayarlayın. Bir kez belgili tanımlık eriyik netlik kazandı, 1 x PBS ile 1 L için toplam ses düzeyini ayarlayın. PH 7.2-7.4 sonra % 4 İngiltere'de yılın çözüm filtre ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın, gerektiğinde 1 N HCl kullanarak için yeniden ayarlayabilirsiniz.
Not: maske, eldiven gibi koruyucu gözlük takmak için gerekli bu yüzden İngiltere'de yılın, zehirlidir. %4 hazırlama işlemini yapmak PFA havalandırılmış bir başlık içinde. İngiltere'de yılın toz pH değeri yaklaşık 9-10 tamamen çözülmüş.
-
Aletleri
- Tipik bir elektrofizyolojik sistem için donanımlı kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) ve yüksek çözünürlüklü su-daldırma amaç, CCD/CMOS Kamera, bir yama-kelepçe amplifikatör, bir micropipette sahibi ile dik bir mikroskop kullanın ve bir Pipet konumu hassas ayar sağlayan micromanipulator. Bir XY sahne de mikroskop taşımak için gereklidir.
- Faraday kafesi tarafından çevrili bir titreşim yalıtım tablo tüm ekipmanları monte. Nöronlar gözlemlemek ve Mikropipetler görselleştirmek için video kameranın video monitörü bağlayın.
-
Mikropipetler
- Kayıt elektrotları borosilikat cam kılcal bir micropipette çektirmenin kullanarak üzerinden yapmak. Tipik pipet direnç ile hücre içi çözüm dolu 3-6 MΩ aralığındadır.
-
Agar blok
- Bir 1.2 cm x 1,5 cm x 2,0 cm agar blok hazırlamak. Şekil 1 ' de gerektiği gibi gösterilen şekiller halinde blok döşeme.
3. Akut Spinal kord dilim hazırlık
Not: Enine veya parasagittal omurilik dilimler olarak daha önce açıklanan18,19,20hazırlanır.
- Transcardial perfüzyon ve spinal kord ayıklama önce ~ 500 mL sukroz-ACSF % 95'i O2 ve %5 CO2 ile equilibrated hazırlamak ve çözüm için buz gibi serin (0-4 ° C).
- Tüm diseksiyon (diseksiyon makası, Iris makas, dişli forseps, iyi forseps, Kıvrımlı penslermesela ) buz üzerinde serin alet. Akut omurilik dilim hazırlanması diyagramı Şekil 1' de gösterilen.
- Transcardial perfüzyon
- Bir tek enjeksiyon (mayi, IP) üretan (1.5 g/kg) sonra 2-3 dakika bekleyin ve fareler anestezi derinliği ayak veya kuyruk tutam yanıt test ederek değerlendirmek. Bir kez cerrahi uçağa anestezi korunur, fareyi ezilmiş buz sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
Not: torakotomi sırasında derin anestezi sigara-algı için acı yeterli üretmek için yerel IACUC yönergeleri izleyin. - Köprücük kemiği xiphoid işleminden cilde aracılığıyla bir kesi (3-4 cm) ve xiphoid işlem düzeyi altında enine bir kesi olun.
- Kavramak ve xiphoid işlemi çift diyafram tamamen ortaya çıkarmak için eğri forseps ile yükseltmek. Diyafram aracılığıyla enine bir kesi yapın ve sonra göğüs ve bilateral göğüs boşluğunu açmak için kaburga arasında göğüs kafesi kesti. Kıvrımlı pensler göğüs kafesi sabit ve kalp yeterince maruz xiphoid süreci kavramak için kullanın.
- Kalp başka bir eğri forseps ile yavaşça tutun ve sol ventrikül tabanına aort yoluyla 22 G iğne yerleştirin.
- Sağ atrium hemen iyi makasla kesmek ve buz gibi oksijenli sükroz-ACSF yerçekimi sistemi ile perfüzyon başlatın.
Not: Hızlı ve yeterli transcardial perfüzyon ile buz gibi sükroz-ACSF düşük sodyum ve kalsiyum konsantrasyonu eksitatör toksisite hafifletmek ve nöronal fonksiyon korumak yardımcı olabilir süre omuriliğin, hızlı soğutma kolaylaştırabilir. Ayrıca, kırmızı kan hücreleri temizleme bir morfolojik çalışma yaparken boyama arka plan biocytin azaltmak için yararlı olacaktır. Perfüzyon sağ atrium çıkmadan sıvı açıktır ve sıçan karaciğer ve pençeleri rengi soluk olarak yeterli ve tatmin olarak kabul edilir. 22 G iğne ucu kalp ve aort parçalanma önlemek için künt olmalı.
- Bir tek enjeksiyon (mayi, IP) üretan (1.5 g/kg) sonra 2-3 dakika bekleyin ve fareler anestezi derinliği ayak veya kuyruk tutam yanıt test ederek değerlendirmek. Bir kez cerrahi uçağa anestezi korunur, fareyi ezilmiş buz sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Spinal kord diseksiyon ve dilimleme
- Perfüzyon eyaletinde iki tarafında omurga ve kaburga arasında göğüs kafesi üzerinden kesip arka cilde gelen kaudal rostral, boyuna kesik (5 cm) yapmak.
- Omurga kaudal sonundaki bir kesim yapmak, uzak çevre dokular kesmek için makas kullanın ve hızla omurga lumbosakral parçasını yalıtır.
- Lumbosakral segment buz gibi sükroz tabanlı ACSF içeren bir cam tabak aktarın. Ventral yanında yukarı doğru çift taraflı vertebral Transpediküler kesilmiş ve spinal kord dikkatle maruz iyi makas kullanın. 2 cm uzun Medulla Spinalis lumbosakral büyütme (L1-S3) ile yalıtmak ve soğuk sükroz-ACSF ile dolu başka bir cam tabak spinal bölüm aktarmak.
- Meninkslerde ve pia-araknoid membran diseksiyon mikroskop altında kaldırın. Ventral ve dorsal kök kısa zamanda sadece... Kes gitsin.
- Spinal kord önceden kesilmiş agar blokta yer. Enine dilimleri hazırlamak için omurilik ventral yan agar için ekleyin ve bıçak arka tarafa izin. Parasagittal dilimleri hazırlamak için ventral tarafı yapıştırıcı ile dikey yönde agar Şekil 1' de gösterildiği gibi takın. Sonra bir vibratome yapıştırıcı ile bir platform için agar bloğunu bağlayın. 300-500 µm enine veya parasagittal dilim önceden bir hızla 0.025 mm/s ve bir titreşim frekansı 80 Hz hazırlayın.
- Plastik kesilmiş pipet dilimleri üzerine naylon mesh 32 ° c en az 30 dk önce kayıt için sürekli oksijenli ACSF içeren bir depolama odasında aktarmak için kullanın.
Not: özellikle dorsal boynuz, omurilik yaralanma meninkslerde ve omurilik kök kaldırırken önlemek için dikkat ediniz. Spinal kord ventrally dorsal dilimlenmiş. En iyi sonuçlar için dilimleri (15-20 dk) içinde hızlı bir şekilde hazırlanmalıdır. Omurilik bir dilim kalınlığı hücre görünürlük karşılamak için 600'den fazla µm olmalıdır. Ayrıca, yukarıda açıklanan tekniği yatay spinal dilimleri elde etmek için kullanılabilir.
4. bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları
- Bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları SG nöronlar üzerinden yapmak kullanmak K+-Cs+uygulanırken çoğu kayıt zaman, hücre içi çözüm dayalı-tabanlı çözümü sadece inhibitör postsinaptik akıntılarının kayıt için.
- Yavaşça bir omurilik dilim kayıt odasına taşıyın ve sonra U şeklinde platin tel ile naylon iplik en iyi dilim istikrar için sıkıca bağlı korumak. Sürekli kabarcıklanma ACSF RT, dilimle bir yerçekimi sistemi ile sıvı ve perfüzyon oranı 2-4 mL/dk yeterli oksijenasyonu elde etmek için ayarlayın.
- Düşük çözünürlüklü mikroskop lens ile SG (yarı saydam bant) bölgenin tanımlamak, yüksek çözünürlüklü objektif hedef hücre kullanarak sağlıklı bir nöron belirleyin ve video monitörü ekranın ortasına doğru ayarlayın.
- Bir micropipette K+uygun bir hacmi ile doldurun-tabanlı veya Cs+-micropipette Elektrot tutucu yerleştirin ve hücre içi çözüm içinde gümüş tel bağlantı kurmanızı sağlamak, gerektiğinde hücre içi çözüm tabanlı tutucu.
- Micropipette odak haline getirmek ve bir micromanipulator kullanarak ACSF sokmak ve hafif pozitif basınç (~ 1 bir manometre ile ölçülen zaman PSI) geçerli herhangi bir kir ve enkaz uzak micropipette zorlamak için.
- Micropipette hedeflenen nöron doğru yavaş yavaş hareket. Pipet nöron ve bir çok küçük çukur formları yaklaşımlar nöronal membran üzerinde bir gigaseal oluşturmak için bir kez pozitif basınç serbest bırakmak.
- -70 için potansiyel holding alter fizyolojik yakın membran potansiyeli (RMP) bir hücrenin dinleniyor mV. Daha sonra geçici ve yumuşak emici membran rüptürü ve iyi bir bütün-hücre yapılandırması oluşturmak için micropipette uygulayın.
Not: kayıt odasına dilimi aktardıktan sonra enkaz dilim yüzeyi temizlemek en az 5 min için sürekli perfüzyon olun. Bu yeteneği sağlıklı ve sağlıksız/ölü nöronlar arasında ayırt etmek için büyük önem iyi sızdırmazlık ve istikrarlı kaydı için olduğu dikkati çekiyor. Bir sağlıksız/ölü nöron süre sağlıklı bir nöron bir 3 boyutlu (3D) şekil parlak ve pürüzsüz bir membran ile karakterizedir ve çekirdeği görünmez görünür bir büyük çekirdeği ile birlikte bir şiş veya küçültülmüş görünüme sahiptir. Bütün hücre yapılandırma elde etmek için hızlı veya yavaş kapasite için adım adım gerektiğinde telafi etmek için esastır. RT sıvı kavşak potansiyel 15,1-15,2 mV ve k+4.3-4.4 mV olmak hesaplanır-dayalı ve Cs+-hücre içi çözüm, sırasıyla dayalı. Çalışmalarımız, kaydedilen veri için sıvı kavşak potansiyel düzeltildi değil. - Kayıtları içsel membran özellikleri
- Kayıt pasif içsel membran Özellikler: kayıt RMP hemen (20 içinde s) içinde aradan sonra. Nöronal giriş direnci için geçerli depolarize gerilim yanıt (10 pA, 500 ms) ölçerek RMP akım tipi kelepçe modunda belirlemek.
- Kayıt özellikleri ateş: Her neuron ateş paterni akım-kelepçe 1 bir dizi Test geçerli bakliyat (25 pA artış 25 – 150 pA) RMP, kutuplarını s. Eşik, genlik ve yarım-bir tek aksiyon potansiyeli çevrimdışı genişliğini ölçmek.
- Kayıt subthreshold geçerli: somatik subthreshold akımları değerlendirmek için membran potansiyel -50 basılı tutun mV gerilim tipi kelepçe modunda. Daha sonra bir dizi hyperpolarizing -60 üzerinden 1 s süresi ve gerilim darbeleri uygulayın mV -120 için 10 mV azaltma ile mV.
- Kayıt eksitatör postsinaptik akımları (EPSCs):+K ile kayıt EPSCs--70 holding potansiyelini gerilim tipi kelepçe modunda hücre içi çözüm tabanlı mV.
- Kayıt IPSCs: Cs+uygulamak-IPSCs kayıt için hücre içi çözüm tabanlı. Bütün hücre yapılandırma kurulduktan sonra membran potansiyel-70 tutun mV ~ 5 min ve o zaman değişim 0 olarak potansiyel holding mV yavaş yavaş. İstikrar için birkaç dakika bekleyin ve IPSC olayları kaydetmek başlatın.
Not: Sadece nöronlar bir RMP-50 mV ve gösterme kaçmak daha az ile daha fazla çalışma için seçili olmalıdır. Serisi dirençlerin çalışma genellikle 10-30 MΩ olan ve seri direnç fazla % 20 oranında dönüştüğünde bir kayıt tutulmalıdır. EPSCs 50 µM APV banyo uygulaması ile teyit ve 20 µM IPSCs 10 µM bicuculline ve 1 µM striknin ile teyit edilmesi ise CNQX.
5. morfolojik çalışma
- Bir K+morfolojik deneyler için kullanın-%0,05 neurobiotin 488 içeren hücre içi çözüm dayalı.
- İstikrarlı bir elektrofizyolojik en az 20 dk kayıt tutarak sonra yavaş yavaş micropipette hücre zarının yeniden mühürlemek ve spinal kord dilim %4 ile dolu bir kapsayıcı aktarmak izin vermek için yukarı doğru yönde kaldırmak PFA. Dilimleri %4 oranında tamir PFA RT için 1 h ve daha sonra 4° C gecede.
- Dilimleri içinde PBS durulama ve sonra onları % 50 Etanol 30 dk için bırakın. Peş peşe üç PBS içinde yıkar, dilimleri içinde onların orijinal kalınlığı ile bir montaj araç slayta takma.
- Confocal mikroskop kullanın (bkz. Tablo reçetesi) resim alma ve nöronal 3D yeniden inşa için. Nöronlar 20 X lens 1,5 µm yığını z ile inceden inceye gözden geçirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akut omurilik dilimleri Şekil 1' de gösterilen diyagramı göre hazırlanmıştır. Dilimleme ve kurtarma sonra spinal kord dilim kayıt odasına transfer edildi. Sağlıklı nöronlar IR-DIC mikroskobu kullanılarak soma görünüşüne göre tespit edilmiştir. SG nöronlar Aksiyon potansiyelleri geçerli bakliyat (1 s süresi) depolarize bir dizi tarafından daha sonra elde edildi nöronlar RMP otelde yapıldı. Şekil 2, açıklanan ve önceki çalışmaları tarafından kategorize ateş desenleri tonik-ateş, Gecikmeli pişirme dahil SG nöronlar içinde gözlenen, boşluk-ateş, ilk patlama, patlama phasic, tek-spike ve isteksiz-ateş, gösterildiği gibi.
Bu hazırlık uygulama, aynı zamanda subthreshold akımları ve kendiliğinden görünen akımları gerilim kelepçe kaydettik. Hyperpolarization aktif hale geçerli de dahil olmak üzere subthreshold akıntılarının temsilcisi izlemeler (benh), T tipi kalsiyum geçerli (ıT) ve A tipi potasyum geçerli (ıA), Şekil 3Aiçinde verilmiştir. Bu akımlar -50 hücreleri tutarak elde edilmiştir mV ve yavaş yavaş 10-mV azaltır-60 -120 için adım mV. Benh aktif gerilim adımları hyperpolarizing. Ancak, benT ve benA depolarized bir gerilim ile izlemek inactivation üzerinden serbest bırakmak için prepulses hyperpolarizing tarafından etkinleştirildi. Şekil 3B 3 C göster temsilcisi spontan EPSCs (sEPSCs) ve IPSCs (sIPSCs) sırasıyla SG neurons kaydedildi. Sinaptik bu olayların frekans ve genlik çevrimdışı mini analiz yazılımı kullanılarak analiz.
Nöronal morfolojik özellikleri karakterize etmek için SG nöronların en önemli ölçüde dendritik ağaçlar yayılmasını rostrocaudal var ve neurobiotin 488 hücre içi çözümleri eklendi Çünkü parasagittal dilimleri uygulandı. Nöronal soma ve ölçüde boyutunu ve boyutları dendritik işlemlerin confocal mikroskobu görüntüleme sonra değerlendirilmiştir. Önceden bildirildiği gibi SG nöronlar morfolojik farklılıkları göstermek ve merkezi hücreleri, radyal hücreleri, dikey hücre, adacık hücreleri ve sınıflandırılmamış hücreleri kategorize. Bu hücreler temsilcisi filmler Şekil 4' te gösterilmiştir.
Şekil 1: akut spinal kord dilim hazırlık için diyagramı. Derin urethan (IP) ile sonra anestezi, fareler transcardially buz gibi carbogenated sükroz-ACSF ile derin vardır. Omurga sonra hızlı bir şekilde disseke ve ventral laminektomi gerçekleştirilir. Zarları, pia-araknoid membran ve ekli spinal sinir kökleri kaldırılır. O zaman, spinal kord örnek bir özel blokta monte edilmiştir. Enine veya parasagittal dilimleri ile bir vibratome gerektiği gibi kesilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: desenler SG nöronların ateşleme. Ateş desenleri bir dizi 1 enjekte edilerek belirlenir RMP adlı bir SG nöron içine geçerli bakliyat depolarize s. Ateş desenleri olarak tonik-ateş, Gecikmeli-ateş, boşluk-ateş, ilk patlama, patlama phasic, tek-spike ve isteksiz ateş sınıflandırılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: gerilim tipi kelepçe kayıtları SG nöronlar içinde. (A)temsilcisi izlemeler geçerli enjeksiyon olarak sınıflandırılmış hyperpolarizing karşılık gösterilenh,A ve IT. Alt paneli evoking protokol alt eşik akımlar için gerilim-kelepçe içinde gösterir. (B) temsilcisi sEPSCs izleri kaydedilen SG nöronlar,-70 üzerinden mV devamsızlık ve 50 mikron APV varlığı ve 20 mikron CNQX. Önce (solda) bir genişletilmiş zaman ölçeği gösterilir birbirini izleyen izlemeler düşürebilir ve APV ve CNQX, eylem (hemen altında) karşılık gelen bir çubuk grafik kayıt aşağıda gösterildiği tarafından belirtilen bir süre için. (C) temsilcisi sIPSCs izleri devamsızlık ve 10 mikron bicuculline ve 0, 1 mikron striknin varlığı SG neurons kaydedilen mV. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: fare SG nöronların temsilcisi morfoloji. Soma boyutları ve dendrite özellikleri confocal mikroskobu Albümdeki gösterilen göre SG nöronlar merkezi hücre(a), radyal hücre (B), dikey hücre (C), adacık hücre (D) ve sınıflandırılmamış hücre (E sınıflandırılmış olabilir ). V: ventral; D: dorsal; R: rostral; C: kaudal. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşen | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) | g/M |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glikoz | 180 | 11 | 1,98 |
| Askorbik asit | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Sodyum pyruvate | 110 | 2 | 0,22 |
Tablo 1: Tarifi için ACSF.
| Bileşen | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) | g/M |
| NaCl | 58.5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-glikoz | 180 | 11 | 1,98 |
| Askorbik asit | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Sodyum pyruvate | 110 | 2 | 0,22 |
Tablo 2: Tarifi sükroz-ACSF için.
| Bileşen | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) | mg/100 mL |
| K-glukonat | 234.2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tablo 3: Tarifi için K+-hücre içi çözüm tabanlı.
| Bileşen | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| ÇAY-Cl | 165.71 | 5 | 82.86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tablo 4: Tarifi için Cs+-hücre içi çözüm tabanlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolü ayrıntıları Biz başarıyla bütün hücreli yama-kelepçe deneyler SG nöronlar18,19,20,21tarihinde gerçekleştirirken kullanılan spinal kord dilimleri hazırlanması için adımları. Bu yöntemi uygulayarak, biz son zamanlarda o minosiklin rapor tetrasiklin, ikinci nesil belirgin geliştirmek inhibitör sinaptik iletimi SG nöronlar19presynaptic bir mekanizma aracılığıyla. Ayrıca, bu aracı ben genliğih azaltmak ve daha fazla SG nöronlar21uyarılabilirlik inhibe. Bunlar destek veri ve biz burada, şu anda açıklanan yöntemi elektrofizyolojik çalışmalar geniş bir kullanım için uygun olduğunu göstermek temsilcisi sonuçları yayınlandı.
Biz daha önce belirtildiği gibi transcardial perfüzyon sağlıklı numune elde etmek için çok önemli bir unsurdur. Öncelikle, perfüzyon için omurilik hızla soğutmalı ve nöronal metabolizma yavaşlatılmış22olabilir bu yüzden buz gibi çözüm kullanın. İkinci, sukroz yerine ACSF, düşük Na+ konsantrasyon, bir 'koruyucu kesme' çözüm pasif Na+ akını iyileştirmek ve böylece su giriş23arası nöronal ödemi azaltmak. Üçüncü olarak, elde etmek ve perfüzyon biocytin22tarafından neden arka plan en aza indirmek çünkü nöronal morfoloji çözümlemek yararlıdır. Başarılı hazırlıkları nöronal koruma24sağlar oksidatif hasarı azaltmak için bazı antioksidan kullanmak önemlidir. Dolayısıyla, bizim iletişim kuralında, askorbik asit ve sodyum pyruvate, güçlü antioksidanlar ve spinal kord dilimleri ödemi etkili, hem ACSF hem de sükroz ACSF iyileştirmek ek. Ayrıca, deneyim, biz sağlıklı omurilik dilimleri başarıyla yanı sıra 3 – 10 hafta yenidoğan gelen eski SD fareler elde edebilirsiniz. Böylece, başarılı olmak bu iletişim kuralı için daha az 10 haftalık SD fareler kullanmanızı öneririz.
Süre 'ventral' laminektomi gerçekleştirme ve kaldırma meninkslerde ve spinal sinirlerin, bir hasta ve kesme, germe veya spinal kord bölme önlemek dikkatli olmalıdır. Bazı çalışmalarda, spinal kord dilimleri ekli dorsal kökleri ile sinaptik değerlendirmek için kullanılmış olan iletim SG nöronlar alınan periferik25,26. Pia-araknoid membran kaldırma yordamı teknik zorluk bu durumda ve sabır gerektirir.
Hazırlama tekniği de bu dilim bazı sınırlamalar vardır. Bir açık dezavantajı olmasına rağmen akut dilimleri bol sinaptik bağlantıları korumak, bu değil gerçek durumu yansıtacak ve içinde vivotam olarak ne olur adres var. Böylece, bazı çalışmalarda vivo içinde hayata geçirdik normalde kayıtları gerçekleştirilen 'kör'27,28,29. Ancak, bu in vivo yaklaşım teknik olarak zordur ve soma veya dendrite yeterli deneyimi olmayan bir kayıt gerçekleştirilen olup olmadığını söylemek zordur. Başka bir geçerli yöntemimiz bu sükroz ACSF kemirgen yaşlanma dan dilimleri hazırlarken nöronal korunması için yeterli olmayabilir kısıtlamasıdır. N-metil-D-glucamine Na+ yerine evlenme teklif etti ve bu en iyi duruma getirilmiş metodoloji belirgin akut dilimleri30,31 nöronlarda morfolojik ve fonksiyonel korunması artırabilirsiniz gibi kullanarak Güncellenme Zamanı bir yaklaşım ,32,33. Son olarak, SG nöronların farklı morfolojik ve elektrofizyolojik özellikleri3göster. Heterojenite bakan bütün hücreli kayıtları elde edilen verileri yorumlamak zor gibi görünüyor. Bu sınırlama tarafından kaçınmakla daha fazla morfolojik ayrıntılarını kaydedilen nöronlar5 doğrulama veya araştırmacılar yardımcı olabilir transgenik fareler kullanarak tanımlayan belirli nöronlar20,34. Ayrıca, optogenetics, hücre35, alt nüfusu kontrol sağlayan bir roman araç bütün hücreli yama belirli iyon kanalları veya proteinlerin rolü çalışmaya ve belirli nöronal devreler incelemek için kayıt tipi kelepçe ile birlikte.
Genel olarak, bu hazırlık teknik tamamlanmaktadır yama-kelepçe kayıt, immünfloresan boyama, özel tarafından SG nöronlar, elektrofizyolojik, morfolojik, farmakolojik ve biyolojik özelliklerini araştırmak için ideal bir yoldur agonistler veya antagonistleri ve tek hücreli RT-PCR tekniği. Ayrıca, bu yaklaşım eşleştirilmiş yama-kelepçe kayıtları veya optogenetics ile birlikte uygulanabilir ve böylece nöronal Mikri şemalar aydınlatıcı için değerli bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Bu eser hibe Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin'den (No 81560198, 31660289) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
