Summary
Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.
Abstract
Des études récentes de patch-clamp de la cellule entière de neurones substantia gelatinosa (SG) ont fourni un grand nombre d’informations sur les mécanismes de la colonne vertébrale qui sous-tendent la transmission sensorielle nociceptive règlement et développement de douleur ou de démangeaisons chronique. Implémentations des enregistrements électrophysiologiques ainsi que des études morphologiques basées sur l’utilité des tranches médullaires aiguës ont encore amélioré notre compréhension des propriétés neuronales et la composition des circuits locaux au journal officiel. Nous présentons ici un guide détaillé et pratique pour la préparation de tranches de moelle épinière et d’enregistrement de germes entiers représentant spectacle et résultats morphologiques. Ce protocole permet la préservation neuronale idéale et peut imiter des conditions in vivo dans une certaine mesure. En résumé, la possibilité d’obtenir une préparation in vitro de tranches de moelle épinière permet aux enregistrements de courant et tension-bride stable et pourrait donc faciliter des enquêtes détaillées sur les propriétés membranaires intrinsèques, des circuits locaux et structure neuronale à l’aide de diverses approches expérimentales.
Introduction
La substantia gelatinosa (SG, limbe II de la corne dorsale de la colonne vertébrale) est un centre d’indiscutablement important relais de transmission et de régulation de l’information sensorielle. Il est composé des interneurones excitateurs et inhibiteurs, qui reçoivent des entrées des fibres afférentes primaires et le système inhibiteur descendant endogène1interneurones les. Ces dernières décennies, le développement de la préparation de tranches médullaires aiguës et l’avènement de l’enregistrement de patch-clamp de la cellule entière ont permis à diverses études sur les propriétés intrinsèques d’électrophysiologiques et morphologiques des SG neurones2, 3 , 4 ainsi que les études des circuits locaux SG5,6. En outre, grâce à la préparation de tranche in vitro la moelle épinière, chercheurs capables d’interpréter les changements neuronaux excitabilities7,8, la fonction d’ion canaux9,10, et 11,12 , dans diverses conditions pathologiques, activités synaptiques. Ces études ont approfondi notre compréhension du rôle que jouent les neurones de la SG dans le développement et l’entretien de la douleur chronique et neuropathique marginé.
La condition préalable essentielle pour obtenir une visualisation claire de soma neuronale et idéal de rapiéçage cellule entière en utilisant des tranches médullaires aiguës est essentiellement, pour assurer l’excellente qualité des tranches sorte sains et patchables neurones peuvent être obtenus. Cependant, la préparation de tranches de moelle épinière implique plusieurs étapes, par exemple effectuer une laminectomie ventrale et enlever la membrane de pia-arachnoïde, qui peut-être être des obstacles pour obtenir des tranches en bonne santé. Bien qu’il n’est pas facile de préparer des tranches de la moelle épinière, effectuant enregistrements in vitro sur des tranches de la moelle épinière présente plusieurs avantages. Par rapport aux préparations de culture de cellules, tranches de moelle épinière peuvent préserver partiellement des connexions synaptiques inhérentes qui sont dans un état physiologiquement pertinent. En outre, cellule entière patch clamp enregistrement en utilisant des tranches de moelle épinière pourrait être combiné avec d’autres techniques, telles que double patch clamp13,14, études morphologiques15,16 et single-cell RT-PCR 17. par conséquent, cette technique apporte des précisions sur la caractérisation de la diversité anatomique et génétique dans une région spécifique et permettant l’étude de la composition des circuits locaux.
Ici, nous fournissons une description préliminaire et détaillée de notre méthode pour préparer les tranches médullaires aiguës et acquérir des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière des neurones de la SG.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux décrits ont été approuvées par l’Animal Ethics Committee de Nanchang University (Nanchang, Chine, éthiques No.2017-010). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le stress et la douleur des animaux expérimentaux. Les enregistrements électrophysiologiques interprétés ici ont été réalisées à température ambiante (RT, 22 – 25 ° C).
1. les animaux
- Utiliser des rats Sprague-Dawley (âgés de 3 à 5 semaines) des deux sexes. Loger les animaux sous un cycle lumière-obscurité de 12 h et de leur donner accès ad libitum à l’eau et de nourriture suffisante.
2. préparation des Solutions et matériaux
- Solutions
- Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (FSCA) (en mM) : 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucose, acide ascorbique 0,4 et 2 pyruvate de sodium. Voir le tableau 1.
- Préparer le saccharose-ACSF (en mM) : 240 saccharose, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, l’acide ascorbique 0,4 et pyruvate de sodium 2. Voir le tableau 2.
- Préparer K+-base de solution intracellulaire (en mM) : 130 K-gluconate, 5 KCl, 10 Na2-phosphocréatine, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP et 0,3 Li-GTP. Voir le tableau 3.
- Préparer Cs+-basé solution intracellulaire (en mM) : 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-phosphocréatine, 5 tétraéthylammonium (TEA) - Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP et 0,3 Li-GTP. Voir le tableau 4.
Remarque : Toutes les solutions doivent être préparées à l’aide d’eau distillée. ACSF et saccharose-FSCA devraient être carbogenated (95 % O2 et 5 % CO2 mélange) avant usage afin de maintenir un pH optimal d’environ 7,4 et l’osmolalité de ces deux solutions doit être réglée à 300-310 mOsm. Parce que l’acide ascorbique susceptibles d’affecter les canaux calciques, cet agent doit être omis si l'on souhaite enregistrer les courants calcium. L’osmolalité et pH des solutions intracellulaires doivent être mesurés et ajustés à 290 à 300 mOsm et 7.2, 7.3, respectivement. Il est recommandé de filtrer les solutions intracellulaires à 0,2 µm filtres et stocker les solutions sous forme de portions de 1 mL à-20 ° C. CS+ et le thé sont appliqués dans Cs+-solution intracellulaire à canal potassique de bloc, qui est favorable à l’utilisation de l’amplificateur pour contenir la membrane potentielle base stable à 0 mV lors de l’enregistrement courant postsynaptique inhibiteur (CISP). - Préparer la solution de neurobiotin 488 de 0,05 %. Dissoudre 2 mg de neurobiotin 488 dans 4 mL de K+-basé solution intracellulaire et ajuster l’osmolalité de 290 à 300 mOsm en utilisant de l’eau distillée ou saccharose si nécessaire.
Remarque : 1 mM de saccharose augmente l’osmolarité de 1 mOsm. - Préparer 3 % d’agar comme un bloc à la moelle épinière. Dissoudre 7,5 g d’agar dans 250 mL d’eau purifiée dans un bécher en verre et ensuite utiliser un four à micro-ondes pour chauffer jusqu'à ébullition et clair. Agiter la solution et versez le mélange dans un 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm boîte en plastique pour la solidification par la suite. Garder l’agar à 4 ° C avant de les utiliser.
- Préparer paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pour le traitement de l’immunohistochimie. Mélanger 40 g de poudre PFA à ~ 800 mL de chauffé (environ 60 ° C) 1 x solution de PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Lentement, ajuster le pH en ajoutant 1 NaOH N gouttes jusqu'à dissolution complète de la poudre de PFA. Une fois que la solution est devenue claire, réglez le volume total à 1 L avec du PBS 1 x. Réajuster le pH à 7,2 – 7,4 avec 1 N HCl, si nécessaire, puis filtrer la solution à 4 % PFA et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
Remarque : PFA est toxique, donc il est nécessaire de porter des masques, gants ainsi que des lunettes de sécurité. Conduire le processus de préparation de 4 % PFA à l’intérieur d’une hotte ventilée. Poudre PFA peut être complètement dissous à un pH d’environ 9-10.
-
Instruments de
- Pour un système typique électrophysiologique, utiliser un microscope vertical équipé de contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) et un objectif de haute résolution-immersion dans l’eau, une caméra CCD/CMOS, un amplificateur de patch clamp, un détenteur d’une micropipette et un micromanipulateur permettant un réglage précis de la position de la pipette. Un stade XY est également nécessaire pour déplacer le microscope.
- Monter tout l’équipement sur une table d’isolement de vibration entourée d’une cage de Faraday. Connectez un moniteur vidéo de la caméra vidéo pour observer les neurones et visualiser les micropipettes.
-
Micropipettes
- Faire des électrodes d’enregistrement de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur d’une micropipette. Les gammes de résistance pipette typique de MΩ 3-6 lorsque rempli de solution intracellulaire.
-
Bloc de gélose
- Préparer un 1,2 x 1,5 cm x 2,0 cm blocs de gélose. Découper le bloc en les formes illustrés à la Figure 1 , comme l’exige.
3. préparation de tranches d’aiguë de la moelle épinière
Remarque : Les tranches de moelle épinière Transverse ou parasagittale sont préparés comme précédemment décrit18,19,20.
- Avant transcardial la perfusion et l’extraction de la moelle épinière, préparer ~ 500 mL saccharose-FSCA équilibrée avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 et refroidir la solution à glacée (0 – 4 ° C).
- Refroidir tous les outils de dissection (p. ex., dissection pince courbée, pince dentée, ciseaux, pinces fines, ciseaux iris) sur la glace. Le diagramme de la préparation de tranche médullaires aiguës est illustré à la Figure 1.
- Perfusion Transcardial
- Après une seule injection (voie intrapéritonéale, i.p.) d’uréthane (1,5 g/kg), attendre 2 à 3 min et évaluer la profondeur de l’anesthésie des rats en testant les réponses pincée orteil ou queue. Une fois un plan chirurgical de l’anesthésie est maintenu, placez le rat sur la glace pilée en décubitus dorsal.
Remarque : Pour produire suffisamment pour la non perception de la douleur profonde anesthésie au cours de la thoracotomie, suivre vos directives IACUC locales. - Faites une incision (3 à 4 cm) à travers la peau du processus xiphoïde, à la clavicule et ensuite faire une incision transversale sous le niveau du processus xiphoïde.
- Saisir et relancer le processus xiphoïde avec une paire de pinces courbée pour exposer le diaphragme complètement. Faire une incision transversale à travers la membrane et couper à travers la cage thoracique entre le sternum et les côtes sur le plan bilatéral d’ouvrir la cage thoracique. Utilisez la pince courbée pour saisir le processus xiphoïde alors la cage thoracique est fixe, et le cœur est suffisamment exposé.
- Maintenez le cœur avec une autre pince courbe doucement et puis insérer une aiguille de 22 G dans le ventricule gauche à la base de la crosse aortique.
- Couper l’oreillette droite avec des ciseaux fins immédiatement et commencez la perfusion de saccharose-FSCA glacée et oxygénée grâce à un système par gravité.
Remarque : Perfusion de transcardial rapide et suffisant avec saccharose-FSCA glacée peut faciliter le refroidissement rapide de la moelle épinière, tandis que la faible concentration de sodium et de calcium peut aider à atténuer la toxicité excitatrice et de protéger la fonction neuronale. En outre, culots globulaires de compensation serait bénéfique pour la réduction de la coloration de fond de la biocytine lorsque vous effectuez une étude morphologique. La perfusion est considéré comme suffisant et satisfait tant que le liquide sortant de l’oreillette droite est clair et la couleur du foie de rat et des pattes est pâle. La pointe de l’aiguille de 22 G doit être franc afin d’éviter une rupture du cœur et la crosse aortique.
- Après une seule injection (voie intrapéritonéale, i.p.) d’uréthane (1,5 g/kg), attendre 2 à 3 min et évaluer la profondeur de l’anesthésie des rats en testant les réponses pincée orteil ou queue. Une fois un plan chirurgical de l’anesthésie est maintenu, placez le rat sur la glace pilée en décubitus dorsal.
- Dissection de la moelle épinière et tranchage
- Faire une incision longitudinale (5 cm) sur la peau arrière de caudale à rostral, puis coupée à travers la cage thoracique entre la colonne vertébrale et les côtes de chaque côté dans l’état de la perfusion.
- Faire une incision à l’extrémité caudale de la colonne vertébrale, utiliser des ciseaux pour découper les tissus environnants et isoler le segment lombo-sacrée de la colonne vertébrale rapidement.
- Transférer le segment lombo-sacrée dans un plat en verre contenant glacee FSCA axée sur le saccharose. Avec la face ventrale vers le haut, utiliser des ciseaux pour couper à travers le pédicule vertébral bilatéralement et exposer la moelle épinière soigneusement. Isoler 2 cm long la moelle épinière lombo-sacrée l’élargissement (L1 – S3) et la section de la colonne vertébrale de transfert à un autre plat de verre rempli de saccharose-FSCA froid.
- Retirez les méninges et la membrane de pia-arachnoïde sous un microscope à dissection. Coupez tous les ventrale et dorsale racines aussi rapidement que possible.
- Placez la moelle épinière sur un bloc de gélose précédemment coupé. Pour préparer les tranches transversales, fixez la partie ventrale de la moelle épinière à l’agar et laisser la face dorsale à la lame. Pour préparer les tranches parasagittale, fixez le côté ventral avec colle à l’agar dans le sens vertical comme illustré à la Figure 1. Ensuite, montez le bloc de gélose à une plate-forme d’un vibratome avec superglue. Préparer 300 – 500 µm transversal ou parasagittale tranches avec une vitesse d’avancement de 0,025 mm/s et une fréquence de vibration de 80 Hz.
- Utiliser une pipette garnis de plastique pour transférer les tranches sur la maille en nylon dans une chambre de stockage contenant FSCA continuellement oxygéné à 32 ° C pendant au moins 30 min avant l’enregistrement.
Remarque : veiller à éviter toute blessure à la moelle épinière, en particulier dans la corne dorsale, en enlevant les méninges et des racines spinales. La moelle épinière devrait être tranchée dorsale-sur le ventre. Pour de meilleurs résultats, les tranches doivent être préparés rapidement (dans les 15 à 20 min). L’épaisseur d’une tranche de la colonne vertébrale doit être pas plus de 600 µm pour satisfaire la visibilité de la cellule. En outre, la technique décrite ci-dessus pourrait être utilisée pour obtenir des tranches horizontales de la colonne vertébrale.
4. cellule entière Patch-clamp Recordings
- Pour effectuer les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière de neurones SG, utiliser K+-basé intracellulaire solution pour la plupart des cas d’enregistrement, tout en appliquant une Cs+-solution uniquement pour l’enregistrement de courants postsynaptiques inhibiteurs à base de.
- Déplacez doucement une tranche de la moelle épinière à la chambre d’enregistrement et maintenir ensuite avec un fil de platine en U attaché avec des fils de nylon fermement pour une stabilité optimale de tranche. Régulièrement perfuse la tranche avec le FSCA propagé à ta grâce à un système par gravité et régler la vitesse de perfusion à 2 à 4 mL/min pour atteindre une oxygénation suffisante.
- Identifier la zone de SG (une bande translucide) en utilisant une lentille microscope basse résolution, choisissez un neurone sain en utilisant l’objectif haute résolution comme la cellule cible et réglez-la au centre de l’écran du moniteur vidéo.
- Remplir une micropipette avec un volume approprié de K+-basé ou Cs+-solution intracellulaire de base si nécessaire, insérez la micropipette dans le porte-électrode et veiller à ce que la solution intracellulaire est en contact avec le fil d’argent à l’intérieur de la titulaire.
- Apporter la micropipette dans le foyer et plongez-le dans le FSCA à l’aide d’un micromanipulateur et puis appliquer une légère pression positive (environ 1 lb/po2 lorsqu’elle est mesurée avec un manomètre) pour forcer la micropipette loin de toute saleté et les débris.
- Déplacer la micropipette vers le neurone cible progressivement. Relâchez la pression positive que la pipette s’approche le neurone et forme une très petite fossette sur la membrane neuronale pour former un gigaseal.
- Modifier l’exploitation potentielle de -70 mV, qui est proche du physiologique au repos potentiel membranaire (RMP) d’une cellule. Ensuite, appliquez une aspiration douce et transitoire à la micropipette pour rupture de la membrane et créer une bonne configuration cellule entière.
Remarque : Après le transfert de la tranche dans la chambre d’enregistrement, assurer une perfusion constante pendant au moins 5 min dégager les débris à la surface de la tranche. Il est à noter que la capacité de distinguer entre les neurones sains et malsains/morts est d’une importance primordiale pour la bonne étanchéité et enregistrement stable. Un neurone malsaine/morts a un aspect gonflé et ratatiné, avec un gros noyau visible, alors qu’un neurone sain se caractérise par une forme de 3 dimensions (3D) avec une membrane brillante et lisse, et son noyau est invisible. Pour obtenir une configuration cellule entière, il est essentiel de compenser rapide ou lent capacitance étape par étape, lorsque cela est nécessaire. À la droite, le potentiel de jonction liquid est fixée à 15.1 – 15,2 mV et 4.3-4.4 mV dans K+-basé et Cs+-fonction solution intracellulaire, respectivement. Dans nos études, les données enregistrées n’étaient pas corrigées pour potentiel de jonction liquide. - Enregistrements de propriétés membranaires intrinsèques
- Enregistrer les propriétés membranaires intrinsèques passive : dossier RMP immédiatement (moins de 20 s) après rodage. Déterminer la résistance d’entrée neuronale en mesurant la tension de réponse à un courant de dépolarisation (10 AP, 500 ms) au RMP en mode courant-clamp.
- Record de propriétés de tir : tester le modèle de mise à feu de chaque neurone en courant-clamp avec une série de 1 s dépolarisant des impulsions de courant (25 – 150 pA avec incrément de 25 pA) à RMP. Mesurer le seuil, l’amplitude et la moitié de la largeur d’un potentiel d’action unique en mode hors connexion.
- Enregistrer une courant : pour évaluer les courants une somatiques, tendez la membrane potentiels à -50 mV en mode voltage clamp. Ensuite, appliquez une série de hyperpolarisant impulsions de tension de 1 s durée de -60 mV à -120 mV, avec une diminution de 10-mV.
- Enregistrer les courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) : EPSCs Record avec le K+-basé solution intracellulaire en mode voltage clamp à un potentiel d’exploitation de -70 mV.
- CISP record : Appliquer Cs+-basé intracellulaire solution pour l’enregistrement de CISP. Une fois la configuration de la cellule entière est établie, tenez la membrane potentiels à -70 mV pendant ~ 5 min et puis changer l’exploitation potentielle à 0 mV progressivement. Attendez quelques minutes pour la stabilisation et ensuite commencer à enregistrer les événements de l’IPSC.
Remarque : Seuls les neurones dont un PMR est inférieure à-50 mV et affichage de remise des gaz doivent être sélectionnés pour une étude plus approfondie. Les résistances de la série dans notre étude sont en général 10-30 MΩ, et il convient d’exclure un enregistrement, une fois la résistance série change de plus de 20 %. EPSCs ont pu être confirmées par une application de bain de 50 µM APV et 20 µM CNQX, tandis que le CISP ont pu être confirmées avec 10 µM bicuculline et la strychnine de 1 µM.
5. morphological study
- Pour les expériences morphologiques, utiliser un K+-basé intracellulaire solution contenant 0,05 % neurobiotin 488.
- Après maintien stable pendant au moins 20 min d’enregistrement électrophysiologique, retirez lentement la micropipette vers le haut pour permettre à la membrane cellulaire refermer et transférer la tranche de la moelle épinière à un réservoir rempli de 4 % PFA. Fixez les tranches dans 4 % PFA à RT pendant 1 h puis à 4° C durant la nuit.
- Rincez les tranches dans du PBS et puis les plonger dans l’éthanol à 50 % pendant 30 min. Après un autre trois lavages en PBS, monter les tranches dans leur épaisseur initiale sur glissières avec un milieu de montage.
- Utiliser un microscope confocal (voir Table des matières) pour l’acquisition d’images et de reconstruction 3D neuronale. Scan des neurones à travers une lentille X 20 avec une z-pile de 1,5 µm.
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Representative Results
Tranches de médullaires aiguës ont été préparés selon le schéma indiqué à la Figure 1. Après le tranchage et la récupération, une tranche de la moelle épinière a été transférée à la chambre d’enregistrement. Les neurones en bonne santé ont été identifiés basé sur l’apparence de soma à l’aide de la microscopie IR-DIC. Ensuite, les potentiels d’action des neurones SG ont été provoquées par une série de dépolarisation des impulsions de courant (durée de 1 s) quand les neurones se sont tenues au RMP. Comme illustré à la Figure 2, les schémas de mise à feu observées dans les neurones de SG inclus tonique-tir, tir de retard, écart-tir, initiale-burst, phasique-éclatement, single-spike et réticents à tir, qui ont été décrits et classés par des études antérieures.
Mise en œuvre de cette préparation, nous avons enregistré aussi une courants et courants apparaissant spontanément en potentiel imposé. Des traces représentant une courants, y compris activés par une Hyperpolarisation présente (j’aih), courant à calcium type T (I,T) et potassium de type courant (IA), sont donnés dans la Figure 3 a. Ces courants ont été obtenus en organisant des cellules à -50 mV et progressivement passer en 10-mV décrémente de -60 à -120 mV. J’aih a été activé par hyperpolarisant mesures de tension. Cependant, j’aiT et IA avons été activés par hyperpolarisant pré-impulsions pour libérer de l’inactivation a suivi avec une tension dépolarisée. Figure 3 b 3C émission spontanée représentant EPSCs (sEPSCs) et CISP (sIPSCs) a enregistré des neurones de la SG, respectivement. L’amplitude et la fréquence de ces événements synaptiques pourraient être analysées en utilisant le logiciel d’analyse mini en mode hors connexion.
Afin de caractériser les caractéristiques morphologiques neuronales, parasagittale tranches ont été appliquées parce que la plupart des neurones SG ont significativement Rostro propagation des arbres dendritiques et neurobiotin 488 a été ajouté aux solutions intracellulaires. La taille du soma neuronale et de l’étendue et les dimensions de leurs prolongements dendritiques ont été évalués après l’imagerie microscopie confocale. Comme indiqué précédemment, les neurones SG montrent distinctions morphologiques et pourraient être classés dans les cellules centrales, cellules radiales, cellules verticales, cellules des îlots pancréatiques et les cellules non classifiés. Micrographies représentatifs de ces cellules sont indiquées à la Figure 4.
Figure 1 : schéma de préparation de tranches médullaires aiguës. Après avoir été profondément anesthésiés à l’uréthane (i.p.), les rats sont transcardially perfusé avec glacee carbogenated saccharose-FSCA. La colonne vertébrale est disséquée puis rapidement et une laminectomie ventrale est effectuée. Méninges, membrane de pia-arachnoïde et des racines nerveuses de la moelle attachée sont supprimés. Ensuite, l’échantillon de la moelle épinière est monté sur un bloc de gel d’agarose. Transversal ou parasagittale tranches sont coupés avec un vibratome selon les besoins. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : tir des patrons des neurones SG. Modes de cuisson sont déterminés par l’injection d’une série de 1 s à impulsions de courant de dépolarisation dans un neurone SG à RMP. Les modes de cuisson peuvent être classés comme tonique-tir, retardé-tir, tir à gap, initiale-burst, phasique-éclatement, single-spike et réticents à tir. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : enregistrements de Voltage clamp dans les neurones SG. (A) représentant traces montrant la réponse à hyperpolarisant injection de courant classifiée comme je l’aih, IA et IT. Le panneau inférieur présente le protocole évoquant des courants sous seuil en voltage clamp. (B) les traces représentatives de sEPSCs enregistrement de neurones SG à -70 mV en absence et en présence de 50 μM APV et 20 μM CNQX. Abaissez les traces consécutives, qui sont affichés dans une échelle de temps élargie avant (à gauche) et (droit), l’action de l’APV et CNQX, correspondent à une période indiquée par une barre ci-dessous l’enregistrement graphique. (C) représentant traces de sIPSCs a enregistré des neurones de SG en absence et en présence de 10 μM bicuculline et la strychnine 1 μM à 0 mV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : morphologie représentative des neurones de rat SG. Selon les propriétés de dendrite montrées dans les images de microscopie confocale et tailles de soma, neurones SG peuvent être classés comme la cellule centrale (A), cellule radiale (B), cellule verticale (C), cellules des îlots pancréatiques (D) et cellule non classifié (E ). V: ventrale ; D: dorsale ; R : rostrale ; C: caudale. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Composant | Poids moléculaire | Concentration (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glucose | 180 | 11 | 1.98 |
| Acide ascorbique | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Pyruvate de sodium | 110 | 2 | 0,22 |
Tableau 1 : Recette du FSCA.
| Composant | Poids moléculaire | Concentration (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glucose | 180 | 11 | 1.98 |
| Acide ascorbique | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Pyruvate de sodium | 110 | 2 | 0,22 |
Tableau 2 : Recette de saccharose-FSCA.
| Composant | Poids moléculaire | Concentration (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconate | 234,2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37,28 |
| Na2-phosphocréatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tableau 3 : Recette pour K+-basé solution intracellulaire.
| Composant | Poids moléculaire | Concentration (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-phosphocréatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| THÉ-Cl | 165.71 | 5 | 82,86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15,7 |
Tableau 4 : Recette pour Cs+-basé solution intracellulaire.
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Discussion
Ce protocole détaille les étapes pour la préparation de tranches de moelle épinière, que nous avons utilisée avec succès lors d’expériences de patch-clamp de la cellule entière sur SG neurones18,19,20,21. En appliquant cette méthode, nous avons récemment rapporté que la minocycline, une deuxième génération de tétracycline, pourraient améliorer sensiblement la transmission synaptique inhibitrice grâce à un mécanisme présynaptique dans SG neurones19. En outre, cet agent pourrait diminuer l’amplitude d’Ih et inhibent davantage l’excitabilité des neurones de SG21. À l’appui de ces publié les données et les résultats représentatifs que nous montrons ici, la méthode actuellement décrite est utilisable dans une large gamme d’études électrophysiologiques.
Comme nous avons remarqué précédemment, perfusion de transcardial est un élément crucial pour obtenir des échantillons en bonne santé. Tout d’abord, nous utilisons la solution glacée pour perfusion donc la moelle épinière peuvent être refroidie rapidement et le métabolisme neuronal peut être ralenti22. FSCA second, saccharose-substitués, une solution de « protection découpe » avec une faible concentration de Na+ , peut améliorer l’influx de Na+ passive et donc diminuer oedème neuronal par l’intermédiaire de l’eau entrée23. En troisième lieu, il est avantageux d’obtenir et d’analyser la morphologie neuronale parce que la perfusion pourrait minimiser le fond causé par la biocytine22. Pour des préparations réussies, il est également important d’utiliser certains antioxydants pour réduire les dommages oxydatifs, qui permet la préservation neuronale24. Par conséquent, dans notre protocole, nous complétons l’acide ascorbique et pyruvate de sodium, qui sont de puissants antioxydants et peut améliorer le œdème dans les tranches de moelle épinière efficacement, ACSF et saccharose-FSCA. Aussi, dans notre expérience, nous pouvons obtenir les tranches saines de la moelle épinière avec succès de néonatale ainsi que de 3 à 10 semaines vieux rats SD. Ainsi, pour que ce protocole soit réussie, nous recommandons d’utiliser des rats SD qui sont moins de 10 semaines.
Tout en effectuant une laminectomie « ventrale » et en supprimant les méninges et nerfs rachidiens, on doivent être patient et veiller à ne pas couper, étirement ou fractionnement de la moelle épinière. Dans certaines études, tranches de moelle épinière avec des racines dorsales ci-joint ont été utilisés pour évaluer la synaptique neurones transmission SG reçu accessoirement25,26. La procédure de suppression de pia-arachnoïde membrane est de difficulté technique dans ce cas, et il faut beaucoup de patience.
Cette tranche préparation technique aussi a quelques limitations. Un inconvénient évident est que même si aiguës tranches conserver les connexions synaptiques abondantes, il ne pouvait pas refléter l’état réel et aborder ce qui passe exactement de in vivo. Ainsi, certaines études ont mis en place dans vivo les enregistrements qui sont normalement effectués « blind »27,28,29. Toutefois, cette approche en vivo est techniquement difficile, et il est difficile de dire si un enregistrement est effectué à partir du soma ou dendrite sans une expérience suffisante. Une autre limitation de notre méthode actuelle est que saccharose-FSCA pourrait ne pas suffire pour préservation neuronale lors de la préparation des tranches de vieillissement des rongeurs. Une approche de mise à jour à l’aide de N-méthyl-D-glucamine comme un substitut de Na+ a été proposé, et cette méthodologie optimisée pourrait nettement améliorer la préservation morphologique et fonctionnelle des neurones en tranches aiguë30,31 ,32,,33. Enfin, les neurones SG montrent différentes propriétés morphologiques et électrophysiologiques3. Il semble difficile d’interpréter les données obtenues à partir des enregistrements de cellule entière tout en admirant l’hétérogénéité. Cette limitation peut être éludée par encore vérifier les détails morphologiques des neurones5 a enregistré ou à l’aide de souris transgéniques, qui pourraient aider les chercheurs à identifier les neurones spécifiques20,,34. En outre, optogenetics, un nouvel outil permettant de contrôler une sous-population de cellules35, pourrait être associée à la cellule entière patch clamp enregistrement d’étudier le rôle des canaux ioniques spécifiques ou de protéines et d’enquêter sur les circuits neuronaux spécifiques.
Dans l’ensemble, cette technique de préparation est un moyen idéal pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques, morphologiques, biologiques et pharmacologiques des neurones de SG, complétés par l’enregistrement patch-clamp, immunofluorescence, spécifiques agonistes ou antagonistes et la technique de RT-PCR unicellulaires. En outre, cette approche peut être appliquée conjointement avec les enregistrements de patch-clamp de la paire ou optogenetics, et c’est donc un outil précieux pour éclairer les microcircuits neurones.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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