Summary
Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.
Abstract
Ganze Zelle Patch-Clamp-Studien von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) haben einen großen Bestand an Informationen über die Wirbelsäulen Mechanismen sensorischer Übertragung, nozizeptiven Regulierung und chronische Schmerzen oder Juckreiz Entwicklung zur Verfügung gestellt. Implementierungen von elektrophysiologische Aufnahmen zusammen mit morphologischen Studien basierend auf die Nützlichkeit des akuten Rückenmark Scheiben haben unser Verständnis der neuronalen Eigenschaften und die Zusammensetzung der lokalen Schaltung in SG weiter verbessert. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche und praktische Anleitung für die Zubereitung von Rückenmark Scheiben und zeigen repräsentative ganze Zelle Aufnahme und morphologischen Ergebnisse. Dieses Protokoll ermöglicht ideale neuronalen Erhaltung und in-Vivo -Bedingungen bis zu einem gewissen Grad zu imitieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, die Fähigkeit, eine in-vitro- Vorbereitung des Rückenmarks Scheiben zu erhalten ermöglicht stabile Strom und Spannung-Klemme Aufnahmen und könnte somit detaillierte Untersuchungen in der inneren Membran Eigenschaften, lokalen Schaltung erleichtern und neuronale Struktur mit vielfältigen experimentellen Ansätzen.
Introduction
Die Substantia Gelatinosa (SG, Lamina II der spinalen Hinterhorn) ist ein unbestreitbar wichtig Relais für Sende- und Regulierung von sensorischen Informationen. Es besteht aus exzitatorischen und inhibitorischen Interneuronen, die Eingänge von den primären afferenten Fasern, lokale Interneuronen und der endogenen absteigenden hemmenden System1erhalten. In den letzten Jahrzehnten konnten die Entwicklung der akuten Rückenmark Slice Vorbereitung und dem Aufkommen der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verschiedene Studien über die inhärenten elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften von SG Neuronen2, 3 , 4 sowie Studien über die lokalen Schaltung in SG5,6. Darüber hinaus durch die Verwendung der in-vitro- Rückenmark Slice Vorbereitung, Forscher interpretieren können die Änderungen in neuronalen Excitabilities7,8, die Funktion der Ionen-Kanäle9,10, und synaptische Aktivitäten11,12 unter verschiedenen pathologischen Bedingungen. Diese Studien haben unser Verständnis von der Rolle der SG Neuronen in der Entwicklung und Instandhaltung von chronischen Schmerzen und neuropathischen Juckreiz vertieft.
Im Wesentlichen ist die wesentliche Voraussetzung für eine klare Visualisierung der neuronalen Soma und ideale ganze Zelle Patchen mit akuten Rückenmark Scheiben zu erreichen um die hervorragende Qualität der Scheiben zu gewährleisten, so gesunde und patchbare Neuronen erreicht werden können. Allerdings umfasst bereitet Rückenmark Scheiben mehrere Schritte, wie das Durchführen einer ventralen Laminektomie und Entfernen der Pia-Arachnoidea-Membran, die Hindernisse bei der Beschaffung von gesunder Scheiben werden kann. Obwohl es nicht einfach zuzubereitende Rückenmark Scheiben, hat Durchführung von Aufnahmen in Vitro am Rückenmark Scheiben mehrere Vorteile. Im Vergleich zu Zelle Kultur Vorbereitungen, erhalten Rückenmark Scheiben teilweise inhärente synaptische Verbindungen, die in einem physiologisch relevanten Zustand befinden. Darüber hinaus könnten ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahme mit Rückenmark Scheiben mit anderen Techniken, wie z. B. doppelte Patch Clamp13,14, morphologische Studien15,16 und einzellige RT-PCR kombiniert werden 17. daher, diese Technik enthält weitere Informationen zur Charakterisierung der anatomische und genetische Unterschiede innerhalb einer bestimmten Region und ermöglicht die Untersuchung der Zusammensetzung der lokalen Schaltung.
Hier bieten wir eine grundlegende und detaillierte Beschreibung unserer Methode für die Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben und ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von SG Neuronen zu erwerben.
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Protocol
Die Tier Ethik Komitee von Nanchang University (Nanchang, VR China, ethische No.2017-010) stimmten alle experimentelle Protokolle beschrieben. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Stress und die Schmerzen der Versuchstiere zu minimieren. Die elektrophysiologischen Aufnahmen, die hier aufgeführt wurden bei Raumtemperatur (RT, 22 – 25 ° C) durchgeführt.
(1) Tiere
- Verwenden Sie Sprague-Dawley Ratten (3 – 5 Wochen alt) beiderlei Geschlechts. Beherbergen Sie die Tiere unter einer 12 h hell-dunkel-Zyklus und Ihnen Sie Ad Libitum Zugang zu angemessener Nahrung und Wasser.
2. Vorbereitung der Lösungen und Materialien
- Lösungen
- Bereiten Sie künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) (in mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1,2 NaH2PO4·2H2O, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,2 MgCl2·6H2O, 25 Nahco33, 11 D-Glucose, 0,4 Ascorbinsäure und 2 Natrium-Pyruvat. Siehe Tabelle 1.
- Vorbereiten der Saccharose-ACFS (in mM): 240 Saccharose, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0,5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 Nahco33, 0,4 Ascorbinsäure und 2 Natrium Pyruvat. Siehe Tabelle 2.
- Bereiten Sie K+-basierte intrazellulären Lösung (in mM): 130 K-Gluconat, 5 KCl, 10 Na2-Phosphokreatin, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP und 0,3 Li-GTP. Siehe Tabelle 3.
- Bereiten Sie Cs+-basierte intrazellulären Lösung (in mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-Phosphokreatin, 5 Tetraethylammonium (Tee) - Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP und 0,3 Li-GTP. Siehe Tabelle 4.
Hinweis: Alle Lösungen müssen mit destilliertem Wasser vorbereitet werden. ACFS und Saccharose-ACFS sollte Carbogenated (95 % O2 und 5 % CO2 Mischung) vor Gebrauch weiterhin einen optimalen pH-Wert von etwa 7,4, und die Osmolalität dieser beiden Lösungen sollte 300-310 mOsm angepasst werden. Da Ascorbinsäure Calciumkanäle beeinträchtigen könnten, muss dieser Agent weggelassen werden, wenn man Kalzium Ströme aufnehmen möchte. Die Osmolalität und pH-Wert des intrazellulären Lösungen sollte gemessen und 290 – 300 mOsm und 7,2 – 7,3 bzw. angepasst. Es wird empfohlen, die intrazellulären Lösungen mit 0,2 µm-Filter filtern und speichern Sie die Lösungen als 1 mL Aliquote bei-20 ° C. CS+ und Tee gelten in Cs+-basierte intrazellulären Lösung zu blockieren Kalium-Kanal, der mit der Verstärker auf die Membran besitzen begünstigt stabil bei 0 mV beim inhibitorischen postsynaptischen Ströme (IPSCs) aufnehmen. - Bereiten Sie die 0,05 % Neurobiotin 488-Lösung. Auflösen von 2 mg von Neurobiotin 488 in 4 mL K+-basierte intrazellulären Lösung und die Osmolalität, 290 – 300 mOsm mithilfe destilliertes Wasser oder Saccharose, bei Bedarf anpassen.
Hinweis: 1 mM von Saccharose Osmolarität erhöht sich um 1 mOsm. - Rückenmark 3 % Agar als Block vorbereiten. Lösen Sie 7,5 g Agar in 250 mL gereinigtes Wasser in ein Becherglas auf, und verwenden Sie dann eine Mikrowelle erhitzen Sie es zum Kochen bringen und löschen. Schwenken Sie die Lösung und gießen Sie die Mischung in eine 17,5 x 10,5 cm x 1.8 cm Kunststoff-Box für Erstarrung danach. Halten Sie das Agar bei 4 ° C vor dem Gebrauch.
- Immunhistochemische Verarbeitung 4 % Paraformaldehyd (PFA) vorbereiten. -Mix 40 g PFA Pulver auf ~ 800 mL beheizt (ca. 60 ° C) 1 x PBS-Lösung (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Langsam passen Sie den pH-Wert durch Zugabe von 1 N NaOH Tropfen bis PFA Pulver vollständig gelöst ist. Sobald die Lösung klar geworden ist, passen Sie das Gesamtvolumen auf 1 L mit 1 X PBS. Passen Sie den pH-Wert auf 7,2 – 7,4 mit 1 N HCl bei Bedarf dann die 4 % PFA Lösung zu filtern und bis zur Verwendung bei-20 ° C lagern.
Hinweis: PFA ist giftig, so dass es nötig ist, Masken, Handschuhe und Schutzbrille zu tragen. Führen Sie den Prozess der Vorbereitung 4 % PFA in einem belüfteten Kapuze. PFA-Pulver kann bei einem pH-Wert von ca. 9 – 10 vollständig aufgelöst werden.
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Instrumente
- Für ein typisches elektrophysiologische System verwenden eine aufrechte Mikroskop mit Infrarot-differential Interferenz-Kontrast (IR-DIC) und eine hochauflösende eintauchen in Wasser-Ziel, eine CCD/CMOS-Kamera, ein Patch-Clamp-Verstärker, einer Mikropipette Halterung ausgestattet und eine Mikromanipulator Feineinstellung der Pipette Position ermöglicht. Ein Kreuztisch ist auch notwendig, um das Mikroskop zu bewegen.
- Montieren Sie alle Geräte auf einem Rütteltisch Isolierung umgeben durch einen Faradayschen Käfig. Verbinden Sie einen video-Monitor mit der Videokamera zu beobachten die Neuronen und visualisieren die Mikropipetten.
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Mikropipetten
- Aufnahme Elektroden aus Borosilikatglas Kapillaren mit einer Mikropipette Abzieher zu machen. Die typische Pipette Widerstand reicht von 3 bis 6 MΩ mit intrazellulären Lösung gefüllt.
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Agar-block
- Bereiten Sie eine 1,2 x 1,5 cm x 2,0 cm-Agar-Block. Schneiden Sie den Block in die Formen, die in Abbildung 1 dargestellt, je nach Bedarf.
(3) akuten Rückenmark Slice Vorbereitung
Hinweis: Quer oder parasagittalen Rückenmark-Scheiben werden als zuvor beschriebenen18,19,20vorbereitet.
- Vor Transcardial Perfusion und Rückenmark Extraktion, ~ 500 mL Saccharose-ACFS equilibriert mit 95 % O2 und 5 % CO2 bereiten und Abkühlen der Lösung für eiskalte (0 – 4 ° C).
- Die Dissektion Werkzeuge (z. B. sezieren Iris-Schere, gezahnten Zangen, feinen Pinzette, Schere, gebogenen Pinzette) auf dem Eis abkühlen. Das Diagramm der Vorbereitung der akuten Rückenmark Slice ist in Abbildung 1dargestellt.
- Transcardial perfusion
- Nach einer einzigen Injektion (intraperitoneal, i.p.) von Urethan (1,5 g/kg) 2 – 3 min. warten Sie, und bewerten Sie die Narkose Tiefe von Ratten durch Tests Zehe oder Schweif Prise Antworten. Sobald eine chirurgische Ebene der Narkose aufrechterhalten wird, legen Sie die Ratte auf zerstoßenem Eis in der Rückenlage.
Hinweis: Für die Herstellung von für nicht-Wahrnehmung von Schmerzen ausreichend Tiefe Anästhesie während Thorakotomie, Richtlinien Sie Ihrer lokalen IACUC. - Einen Einschnitt (3 – 4 cm) durch die Haut aus dem Xiphoid Prozess um das Schlüsselbein, und dann eine Quereinschnitt unterhalb der Ebene des Xiphoid Prozesses.
- Fassen Sie und heben Sie das Xiphoid Prozeß mit einer gebogenen Zange, das Zwerchfell vollständig verfügbar zu machen. Quereinschnitt durch das Diaphragma hindurch zu machen, und dann schneiden durch den Brustkorb zwischen dem Brustbein und die Rippen bilateral, den Brustkorb zu öffnen. Verwenden Sie die gebogene Pinzetten, um Xiphoid Prozeß zu erfassen, so dass der Brustkorb fixiert ist, und das Herz ausreichend ausgesetzt ist.
- Halten Sie das Herz mit einem anderen gebogenen Pinzette sanft, und fügen Sie dann eine 22 G Nadel durch den linken Ventrikel auf der Basis der Aortenbogen.
- Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer feinen Schere sofort, und starten Sie die Perfusion der eiskalte, sauerstoffreiches Saccharose-ACFS durch ein Schwerkraft-System.
Hinweis: Schnelle und ausreichende Transcardial Perfusion mit eiskalten Saccharose-ACFS erleichtern die schnelle Abkühlung des Rückenmarks, während niedriger Natrium und Kalzium-Konzentration helfen kann, zu lindern exzitatorischen Toxizität und neuronale Funktion schützen kann. Darüber hinaus wäre löschen roten Blutkörperchen von Vorteil für die Verringerung der Hintergrundfärbung von Biocytin bei der Durchführung einer morphologischen Studie. Die Perfusion gilt als ausreichend und zufrieden, solange die Flüssigkeit verlassen den rechten Vorhof klar ist und die Farbe der Leber und den Pfoten der Ratte blass ist. Die Spitze der 22 G Nadel sollte stumpf zu vermeiden, bersten, das Herz und Aortenbogen.
- Nach einer einzigen Injektion (intraperitoneal, i.p.) von Urethan (1,5 g/kg) 2 – 3 min. warten Sie, und bewerten Sie die Narkose Tiefe von Ratten durch Tests Zehe oder Schweif Prise Antworten. Sobald eine chirurgische Ebene der Narkose aufrechterhalten wird, legen Sie die Ratte auf zerstoßenem Eis in der Rückenlage.
- Rückenmark Dissektion und schneiden
- Machen Sie einen längs-Schnitt (5 cm) auf der Rückseite Haut von kaudalen rostral, dann Durchschneiden des Brustkorbs zwischen Wirbelsäule und Rippen auf beiden Seiten in den Stand der Perfusion.
- Machen Sie einen Schnitt am kaudalen Ende der Wirbelsäule, mit einer Schere umgebenden Gewebe weggeschnitten und isolieren Sie der lumbosakralen Segment der Wirbelsäule schnell zu.
- Übertragen der lumbosakralen Segment in einer Glasschale mit eiskalten Saccharose-basierte ACFS. Verwenden Sie mit der Bauchseite nach oben feine Schere durchschneiden die Wirbelkörper Pedikels bilateral und setzen Sie sorgfältig das Rückenmark. Eine 2 cm lange Rückenmark mit lumbosakralen Erweiterung (L1-S3) zu isolieren und spinalen Abschnitt auf einer anderen Glasschale gefüllt mit kaltem Saccharose-ACFS übertragen.
- Entfernen Sie die Hirnhäute und die Pia-Arachnoid Membrane unter dem sezierenden Mikroskop. Schneiden Sie Sie so schnell wie möglich die ventralen und dorsalen Wurzeln.
- Platzieren Sie das Rückenmark auf einem zuvor getrimmten Agar-Block. Bereiten Sie Quere Scheiben, legen die Bauchseite des Rückenmarks auf Agar und lassen der dorsalen Seite in Richtung der Klinge. Um parasagittalen Scheiben vorzubereiten, legen der Bauchseite mit Sekundenkleber auf Agar in vertikaler Richtung, wie in Abbildung 1dargestellt. Montieren Sie die Agar-Block auf eine Plattform der Vibratome mit Sekundenkleber. Bereiten Sie 300 – 500 µm quer oder parasagittalen Scheiben mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,025 mm/s und eine Schwingfrequenz von 80 Hz.
- Verwenden Sie eine Kunststoff-getrimmten Pipette, um die Scheiben auf Nylon-Netzgewebe in eine Vorratskammer mit ständig sauerstoffreiches ACFS bei 32 ° C für mindestens 30 min vor der Aufnahme übertragen.
Hinweis: darauf achten Sie, zur Vermeidung von Verletzungen des Rückenmarks, insbesondere Hinterhorn, wenn die Hirnhaut und spinalen Wurzeln entfernen. Das Rückenmark sollte dorsal-ventral geschnitten werden. Die besten Ergebnisse zu erzielen sollten die Scheiben schnell (innerhalb von 15-20 min) vorbereitet sein. Die Dicke einer spinalen Scheibe sollte nicht mehr als 600 µm Zelle Sichtbarkeit zu befriedigen. Darüber hinaus könnte die oben beschriebenen Technik verwendet werden, um horizontale spinalen Scheiben zu erhalten.
(4) Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahmen
- Um die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von SG Neuronen durchzuführen, verwenden K+-basierte intrazellulären Lösung in den meisten Fällen der Aufnahme während der Anwendung Cs+-basierte Lösung nur für die Aufzeichnung von inhibitorischen postsynaptischen Ströme.
- Bewegen Sie sanft eine Rückenmark-Scheibe zur Aufnahme Kammer, und dann behaupten Sie, es mit einem u-förmigen Platindraht mit Nylonfäden fest für optimale Slice Stabilität befestigt. Stetig Durchspülen Sie den Slice mit sprudelte ACFS bei RT durch ein Schwerkraft-System und stellen Sie die Perfusion bei 2 – 4 mL/min genügend Oxygenierung zu erreichen.
- Identifizieren der Region SG (eine transluzente Band) mit einem Objektiv mit geringer Auflösung Mikroskop, wählen Sie eine gesunde Nervenzelle mit hochauflösenden Ziel als der Zielzelle und anpassen, um die Mitte des Bildschirms Videomonitor.
- Füllen einer Mikropipette mit einem entsprechenden Volumen von K+-basierte oder Cs+-basierte intrazellulären Lösung bedarf die Mikropipette in der Elektrodenhalter einsetzen und dafür sorgen, dass die intrazelluläre Lösung Silberdraht in Kontakt mit der Halter.
- Die Mikropipette in den Fokus zu bringen und in der ACFS mit einem Mikromanipulator eintauchen und dann einen leichten Überdruck (~ 1 Psi mit einem Manometer gemessen) zwingen die Mikropipette entfernt Schmutz und Ablagerungen.
- Verschieben Sie die Mikropipette in Richtung der gezielten Neuron allmählich. Lassen Sie den positiven Druck, sobald die Pipette nähert sich das Neuron und bildet sich eine sehr kleine Grübchen auf neuronale Membran um eine Gigaseal zu bilden.
- Ändern die Holding zu-70 mV, die in der Nähe der physiologischen Membranpotential (RMP) einer Zelle ruht. Wenden Sie dann eine vorübergehende und sanfte Saugwirkung auf die Mikropipette Ruptur der Membran und eine gute ganz-Zell Konfiguration erstellen.
Hinweis: Nach der Übertragung der Scheibe in die Aufnahme Kammer, gewährleisten Sie kontinuierliche Perfusion für mindestens 5 min um die Trümmer auf der Oberfläche der Scheibe zu löschen. Es ist erwähnenswert, dass die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen gesunden und ungesunden/Toten Neuronen für gute Abdichtung und stabile Aufnahme von herausragender Bedeutung ist. Eine ungesunde/Toten Neuron wirkt geschwollen oder geschrumpften, zusammen mit einem sichtbaren großen Kern, während eine gesunde Nervenzelle sich durch eine 3-dimensionale (3D) Form mit einer hellen und glatten Membran zeichnet, und der Kern unsichtbar ist. Um eine ganz-Zell Konfiguration zu erreichen, gilt es, schnell oder langsam Kapazität Schritt für Schritt bei Bedarf zu kompensieren. Bei RT, errechnet sich die flüssige Kreuzung potenzielle 15,1 – 15,2 mV und 4.3, 4.4 mV in K+-basierte und Cs+-basierte intrazellulären Lösung, beziehungsweise. In unseren Studien wurden die aufgezeichneten Daten nicht für flüssige Verzweigung Potenzial korrigiert. - Aufnahmen der inneren Membran Eigenschaften
- Passive innere Membran Eigenschaften aufnehmen: Datensatz RMP sofort (innerhalb von 20 s) nach Unterbrechung. Bestimmen der neuronalen Eingangswiderstand durch Messung der Spannung auf eine aktuelle depolarisierende (10 pA, 500 ms) bei RMP im Strom-Clamp-Modus.
- Rekord feuern Eigenschaften: Testen Sie das Feuern Muster jedes Neurons in Strom-Klemme mit einer Reihe von 1 s depolarisierende Stromimpulse (25-150 pA mit 25 pA Inkrement) bei RMP. Messen Sie die Schwelle, die Amplitude und die Halbwertsbreite von einem einzigen Aktionspotential offline.
- Eingangssignale Strom aufnehmen: um den somatischen Eingangssignale Strömungen zu bewerten, halten die Membran potenzielle bei-50 mV in Voltage-Clamp-Modus. Wenden Sie dann eine Reihe von hyperpolarizing Spannungsimpulse von 1 s Dauer von-60 mV bis-120 mV, mit einem 10-mV-Dekrement.
- Aufzeichnen von exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs): Rekord-EPSCs mit dem K+-basierte intrazellulären Lösung im Spannung-Clamp-Modus auf einem Holding-Potenzial von-70 mV.
- Rekord IPSCs: Gelten Cs+-basierte intrazellulären Lösung zur Erfassung von IPSCs. Sobald die gesamte Zelle Konfiguration besteht, halten die Membran potenzielle-70 mV für ~ 5 min und dann Wechsel im Betrieb möglichen auf 0 mV allmählich. Warten Sie ein paar Minuten zur Stabilisierung, und starten Sie IPSC Ereignisse aufzeichnen.
Hinweis: Nur Neuronen mit einem RMP weniger als-50 mV und zeigt Überschwingen sollte für weitere Studien ausgewählt werden. Die Serie Widerstände in unserer Studie sind in der Regel 10-30 MΩ, und eine Aufnahme ausgeschlossen werden sollte, sobald der Reihenwiderstand um mehr als 20 % ändert. EPSCs konnte bestätigt werden, mit einer Bad-Anwendung von 50 µM APV und 20 µM CNQX, während IPSCs mit 10 µM Bicuculline und 1 µM Strychnin bestätigt werden konnte.
(5) morphologischen Studie
- Für morphologische Untersuchungen verwenden eine K+-basierte intrazellulären Lösung mit 0,05 % Neurobiotin 488.
- Nach der Aufrechterhaltung einer stabiles elektrophysiologische Aufnahme für mindestens 20 Minuten, entfernen Sie langsam die Mikropipette in Aufwärtsrichtung zu ermöglichen die Zellmembran verschließen und das Rückenmark Segment auf einen Behälter gefüllt mit 4 % PFA. Korrigieren Sie die Scheiben in 4 % PFA bei RT für 1 h und dann bei 4° C über Nacht.
- Spülen Sie die Scheiben mit PBS-Puffer, und dann tauchen sie in 50 % igem Ethanol für 30 min. Montieren Sie nach einer anderen drei Wäschen mit PBS-Puffer die Scheiben in ihrer ursprünglichen Stärke auf Objektträger mit einem Eindeckmittel.
- Verwenden Sie ein confocal Mikroskop (siehe Tabelle der Materialien) für Bildaufnahme und neuronale 3D-Rekonstruktion. Scannen Sie Neuronen durch eine 20 X Objektiv mit einem Z-Stapel von 1,5 µm.
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Representative Results
Akuten Rückenmark Scheiben wurden entsprechend dem Diagramm in Abbildung 1dargestellte vorbereitet. Nach dem Schneiden und Wiederherstellung wurde eine Rückenmark-Scheibe zur Aufnahme Kammer übertragen. Gesunde Neuronen wurden identifiziert, basierend auf Soma Auftritt mit IR-DIC Mikroskopie. Als nächstes wurden die Aktionspotentiale der SG Neuronen durch eine Reihe von depolarisierende Stromimpulse (1 s Dauer) ausgelöst wenn Neuronen bei RMP gehalten wurden. Wie in Abbildung 2, die Impulsmuster beobachteten in SG Neuronen enthalten Tonikum-brennen, verzögert feuern, Spalt-schießen, Initial-Burst, phasisch-platzen, Single-Spike und zurückhaltend-schießen, die beschrieben und von früheren Studien kategorisiert wurden.
Umsetzung dieses Präparat, verzeichneten wir auch Eingangssignale Strömungen und spontan auftretenden Ströme im Spannung Klemme. Repräsentative Spuren der Eingangssignale Strömungen, einschließlich der aktuellen Hyperpolarisation aktiviert (ichh), T-Typ-Kalzium aktuelle (IT) und A-Typ-Kalium aktuelle (IA), sind in Abbildung 3Aangegeben. Diese Ströme wurden durch das halten der Zellen bei-50 mV und schrittweise Anhebung im 10-mV dekrementiert von-60 auf-120 mV. Ichh durch hyperpolarizing Spannungsstufen aktiviert wurde. Jedoch waren ichT und IA aktiviert, indem hyperpolarizing Prepulses, von Inaktivierung gefolgt mit einer depolarisiert Spannung zu befreien. Abbildung 3 b 3 C zeigen Vertreter spontane EPSCs (sEPSCs) und IPSCs (sIPSCs) bzw. von SG Neuronen, erfasst. Die Amplitude und Frequenz dieser synaptische Ereignisse konnten mit der Mini-Analyse-Software offline analysiert werden.
Um neuronale morphologischen Merkmale zu charakterisieren, wurden parasagittalen Scheiben angewandt, weil die meisten der SG Neuronen deutlich Rostrocaudal Ausbreitung von dendritischen Bäume haben und Neurobiotin 488, um intrazelluläre Lösungen hinzugefügt wurde. Die Größe der neuronale Soma und die Maße und Dimensionen ihrer dendritischen Prozesse wurden nach dem konfokalen Mikroskopie Imaging ausgewertet. Wie bereits berichtet, SG Neuronen zeigen morphologische Unterschiede und könnte in zentralen Zellen, radiale Zellen, vertikale Zellen, Inselzellen und nicht klassifizierte Zellen kategorisiert werden. Repräsentative Mikrographen dieser Zellen sind in Abbildung 4dargestellt.
Abbildung 1: Diagramm zur akuten Rückenmark Slice Vorbereitung. Ratten sind nach betäubt wird tief mit Urethan (i.p.), Transcardially mit eiskalten Carbogenated Saccharose-ACFS durchblutet. Die Wirbelsäule wird dann schnell durchschnitten, und einen ventralen Laminektomie erfolgt. Die Hirnhaut, Pia-Arachnoidea Membran und angehängten Spinalnerven Wurzeln werden entfernt. Dann wird das Rückenmark Exemplar auf einem Agarose-Block montiert. Quer oder parasagittalen Scheiben sind mit einer Vibratome geschnitten, je nach Bedarf. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Muster der SG Neuronen feuern. Feuern Muster werden bestimmt durch die Injektion von einer Reihe von 1 s depolarisierende Stromimpulse in eine SG-Neuron bei RMP. Die Impulsmuster können als Tonikum-schießen, verzögert feuern Lücke-schießen, Initial-Burst, phasisch-platzen, Single-Spike und zurückhaltend-schießen eingestuft werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Voltage-Clamp-Aufnahmen in Neuronen SG. (A) repräsentative Spuren zeigen die Reaktion auf hyperpolarizing Stromeinspeisung als ichh, IA und IT. Im unteren Bereich zeigt die Glückszahl Protokoll für Sub-Schwelle Ströme in Spannung-Klemme. (B) repräsentative Spuren von sEPSCs aufgezeichnet von SG Neuronen bei-70 mV in Abwesenheit und Anwesenheit von 50 μM APV und 20 μM CNQX. Niedrigere aufeinanderfolgende Spuren, die in einem erweiterten Zeitskala vor (links) dargestellt werden und unter (rechts) die Wirkung der APV und CNQX, eine durch einen Balken Diagramm Aufnahme unten angegebenen Zeitraum entsprechen. (C) repräsentative Spuren von sIPSCs aufgezeichnet von SG Neuronen in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 μM Bicuculline und 1 μM Strychnin bei 0 mV. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Morphologie der Rattenneuronen SG. Nach Soma Größen und Dendrit Eigenschaften in konfokalen Mikroskopie-Bildern gezeigt können SG Neuronen als zentrale Zelle (A), radiale Zelle (B), vertikale Zelle (C), Inselzelle (D) und nicht klassifizierte Zelle (E eingestuft werden ). V: Ventral; D: dorsal; R: rostral; C: kaudalen. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Komponente | Molekulargewicht | Konzentration (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| Nahco33 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glucose | 180 | 11 | 1,98 |
| Ascorbinsäure | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium-Pyruvat | 110 | 2 | 0,22 |
Tabelle 1: Rezept für ACFS.
| Komponente | Molekulargewicht | Konzentration (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6,84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| Nahco33 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glucose | 180 | 11 | 1,98 |
| Ascorbinsäure | 198.11 | 0,4 | 0,08 |
| Natrium-Pyruvat | 110 | 2 | 0,22 |
Tabelle 2: Rezept für Saccharose-ACFS.
| Komponente | Molekulargewicht | Konzentration (mM) | mg/100 mL |
| K-Gluconat | 234,2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Phosphokreatin | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02. |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15.7 |
Tabelle 3: Rezept für K+-basierte intrazellulären Lösung.
| Komponente | Molekulargewicht | Konzentration (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-Phosphokreatin | 453.38 | 10 | 453.38 |
| Tee-Cl | 165.71 | 5 | 82,86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02. |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202.9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0,3 | 15.7 |
Tabelle 4: Rezept für Cs+-basierte intrazellulären Lösung.
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Discussion
Dieses Protokolldetails der Schritte für die Zubereitung von Rückenmark Slices, die wir erfolgreich eingesetzt haben, wenn ganze Zelle Patch-Clamp-Experimenten auf der SG Neuronen18,19,20,21. Durch die Implementierung dieser Methode, wir berichteten kürzlich, dass Minocyclin eine zweite Generation von Tetracyclin, inhibitorischen synaptischen Übertragung durch einen präsynaptischen Mechanismus in SG Neuronen19deutlich verbessern könnte. Darüber hinaus könnte dieser Agent verringern die Amplitude von Ih und weitere hemmen die Erregbarkeit der SG Neuronen21. Zur Unterstützung dieser Daten und die repräsentativen Ergebnisse, dass wir hier zeigen, die gerade beschriebene Methode eignet sich für den Einsatz in den unterschiedlichsten elektrophysiologische Studien veröffentlicht.
Wie wir bereits erwähnt, ist Transcardial Perfusion ein entscheidendes Element für den Erhalt der gesunden Exemplare. Zunächst verwenden wir eiskalte Lösung für Durchblutung, so das Rückenmark rasch abgekühlt kann und die neuronale Stoffwechsel kann verlangsamte22. Zweite, Saccharose ersetzt ACFS, eine "schützende Cutting" Lösung mit geringen Na+ Konzentration kann passive Na+ Zustrom zu verbessern und somit verringern neuronale Ödem durch Wasser Eintrag23. Drittens ist es vorteilhaft, zu erhalten und neuronale Morphologie zu analysieren, weil Perfusion verursachten durch Biocytin22Hintergrund minimieren könnten. Für erfolgreiche Vorbereitungen ist es auch wichtig, einige Antioxidantien zu verwenden, um oxidativen Schäden zu verringern, die neuronale Erhaltung24ermöglicht. Daher ergänzen wir in unserem Protokoll, Ascorbinsäure und Natrium Pyruvat, das sind starke Antioxidantien und können Ödeme im Rückenmark Scheiben effektiv ACFS und Saccharose-ACFS zu verbessern. Auch in unserer Erfahrung erhalten wir gesunden Rückenmark Scheiben erfolgreich von Neugeborenen sowie 3 – 10 Wochen alten SD-Ratten. Also, für dieses Protokoll um erfolgreich zu sein, empfehlen wir, mit SD-Ratten, die weniger als 10 Wochen alt sind.
Während "ventralen" Laminektomie durchführen und Entfernen der Hirnhäute und Spinalnerven, geduldig und vorsichtig schneiden, Dehnung oder Teilen des Rückenmarks zu vermeiden sein sollte. In einigen Studien, Rückenmark Scheiben mit angehängten dorsalen Wurzeln verwendet wurden, um bewerten die synaptische Übertragung SG Neuronen erhielt peripher25,26. Das Verfahren des Entfernens Pia-Arachnoidea Membran ist in diesem Fall der technischen Schwierigkeit, und es erfordert einiges an Geduld.
Dieses Stück Technik auch Vorbereitung hat einige Einschränkungen. Ein klarer Nachteil ist, dass obwohl akute Scheiben reichliche synaptische Verbindungen erhalten, könnte es nicht den tatsächlichen Zustand spiegeln und anzugehen, was genau passiert in Vivo. So haben einige Studien in Vivo umgesetzt Aufnahmen, die sind in der Regel durchgeführt 'blind'27,28,29. Jedoch dieser Ansatz in Vivo ist technisch anspruchsvoll, und es ist schwierig zu sagen, ob eine Aufnahme aus dem Soma oder Dendrit ohne ausreichende Erfahrung durchgeführt wird. Eine weitere Einschränkung unserer aktuellen Methode ist, dass Saccharose-ACFS möglicherweise nicht ausreicht für neuronale Erhaltung beim Scheiben von Nagetieren Altern vorbereiten. Ein aktualisierter Ansatz mit N-Methyl-D-Glucamine Na+ Ersatz vorgeschlagen wurde, und diese optimierte Methode deutlich verbessern könnte, morphologische und funktionelle Erhaltung der Neuronen im akuten Scheiben30,31 ,32,33. Zu guter Letzt zeigen SG Neuronen unterschiedliche morphologische und elektrophysiologische Eigenschaften3. Es scheint schwierig, Daten aus ganzen Zelle Aufnahmen mit Blick auf die Heterogenität zu interpretieren. Diese Einschränkung kann umgangen werden, durch weitere Überprüfung der morphologischen Details aufgezeichnet Neuronen5 oder mit transgenen Mäusen, die Forscher helfen könnte identifizieren bestimmte Neuronen20,34. Darüber hinaus könnte Optogenetik, eine neuartige Tool, mit dem Steuerelement von einer Subpopulation von Zellen35, kombinierbar mit ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahme, die Rolle der Proteine oder spezifische Ionenkanäle untersuchen und bestimmte neuronale Schaltkreise zu untersuchen.
Insgesamt ist diese Vorbereitung Technik eine ideale Möglichkeit, die elektrophysiologischen, morphologische, pharmakologischen und biologischen Eigenschaften von SG Neuronen, ergänzt durch Patch-Clamp-Aufnahme, immunofluorescent Färbung, spezifische untersuchen Agonisten oder Antagonisten und einzellige RT-PCR Technik. Darüber hinaus kann dieser Ansatz zusammen mit gepaarten Patch-Clamp-Aufnahmen oder Optogenetik angewendet werden, und es ist somit ein wertvolles Werkzeug für die Beleuchtung der neuronalen Mikroschaltungen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr. 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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