Summary
כפול גדילי RNA שהופק במהלך שכפול וירוס רנ א ניתן לזהות על ידי קולטנים זיהוי תבנית כדי ליצור תגובה חיסונית מולדת. וירוסים RNA שלילי-סנס, האינטראקציה בין dsRNA ברמה נמוכה PRRs עדיין לא ברור. פיתחנו שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית להמחיש arenavirus dsRNA ו- PRR בתאים בודדים.
Abstract
גדילי כפול (ds) RNA מופק כמו replicative ביניים במהלך זיהום בנגיף ה-RNA. זיהוי של dsRNA על-ידי המחשב המארח דפוס זיהוי קולטנים (PRRs) כגון חומצה retinoic (מעטה-אני) כמו רצפטורים (RLRs) מעטה-אני ומלנומה חלבונים הקשורים בידול 5 (מד א-5) מוביל תנאי הגיוס של התגובה החיסונית מולדת. היווצרות והפצה תאיים של dsRNA במובן חיובי להדבקת וירוס RNA טוב התאפיין מיקרוסקופ. וירוסים RNA שלילי-סנס רבים, כולל חלק arenaviruses, לעורר את התגובה החיסונית מולדת במהלך זיהום. עם זאת, וירוסי RNA שלילי-סנס נחשבו לייצר רמות נמוכות של dsRNA, שפוגעת המחקר הדמיה של הכרה PRR של dsRNA ויראלי. בנוסף, ניסויים זיהום עם arenaviruses פתוגני יש לבצע בלימה גבוהה רמת אבטחה במתקני (BSL-4). האינטראקציה בין נגיפי RNA ו PRRs עבור וירוס רנ א פתוגני לא ידוע בעיקר בשל האתגרים הטכניים נוספים חוקרים צריכים להתמודד במתקני BSL-4. לאחרונה, נוגדן חד שבטי (Mab) (שיבוט 9D 5) ששימש במקור לגילוי פאן-שכל נמצאה במיוחד לזהות dsRNA עם רגישות גבוהה יותר מאשר נוגדנים anti-dsRNA J2 או K1 מסורתיים. במסמך זה, על ידי ניצול 9D 5 נוגדן, נתאר פרוטוקול מיקרוסקופיה קונפוקלית שימש בהצלחה כדי להמחיש dsRNA, חלבון נגיפי, PRR בו זמנית בתאים בודדים נגוע arenavirus. הפרוטוקול מתאים גם הדמיה מחקרים של dsRNA והפצה PRR בתאים arenavirus פתוגניים נגוע BSL4 מתקנים.
Introduction
השלב הראשוני האינדוקציה של התגובה החיסונית מולדת הוא זיהוי המארח של גדילי כפול (ds) RNA על ידי קולטני זיהוי דפוס (PRRs) כגון חומצה retinoic (מעטה-אני) כמו רצפטורים (RLRs) מעטה-אני ומלנומה בידול-הקשורים חלבון 5 (מד א-5)1. וירוסים RNA חיוביות-סנס, dsRNA בדרך כלל ניתן בקלות להבחין באמצעות J2 או K1 אנטי-dsRNA נוגדנים חד-שבטיים (Mab)2. האינטראקציה בין dsRNA PRRs חיובי-גדיל RNA וירוסים, כגון נגיף פיקורנה, מאפיין באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית3. עם זאת, עבור שלילי-סנס וירוס רנ א, ויזואליזציה ואפיון של אינטראקציה PRR ו dsRNA יש כבר הפריע על ידי חוסר של נוגדנים רגיש dsRNA. RNA פלורסנט היברידיזציה (דגים) הוחלה על הפריט החזותי של נגיפי RNA ו- PRRs4. בכל זאת, המתודולוגיה דגים דורש ידיעת המטרה רצף ה-RNA, העלול להיות בלתי תואם עם PRR מכתים משותפת. לאחרונה, 9D 5 Mab, אשר פותחה במקור לאבחון של פאן-שכל זיהום, נמצאה להיות רגיש יותר J2 Mab ולא ניתן בקלות לזהות dsRNA במובן שלילי וירוס רנ א-זיהום-5,-6. לפיכך, Mab 9D 5 הוא רומן, כלי שימושי ללמוד שכפול ויראלי ו האינטראקציה בין PRR ו- RNA נגיפי עבור שלילי-סנס וירוס רנ א.
Arenaviruses הם משפחה של חד-גדילי, שלילי-תחושה RNA וירוסים, אשר כוללים מספר פתוגנים אנושי, כגון וירוס לאסה (LASV), חונין וירוס (JUNV), וירוס Machupo (MACV), הגורמים למחלות קשות קדחת דימומית ב בני7. נתונים קליניים של מקרים חמורים, חמורה של ארגנטינאי שפעת נגרמת על ידי העולם החדש arenavirus JUNV התערוכה רמות גבוהות במיוחד של סרום IFN-α8,9. הראינו כי arenaviruses NW פתוגניים (JUNV ו- MACV), אך לא את פתוגניים העולם הישן arenavirus, LASV, זירוז סוג אני בתגובה אינטרפרון (IFN) תאים דנדריטים נגזר מונוציט האנושי10. יתר על כן, מעטה-אני הוא אחד החיישנים תיווכה מסוג I IFN תגובת תאים הנגועים JUNV11. מצאנו גם כי הקולטן R (PKR) קינאז חלבון, אשר ידוע באופן מסורתי לזיהוי dsRNA, מופעל פתוגניים NW arenavirus זיהום12. כדי להבין עוד יותר את מנגנון התגובה IFN וירוס ספציפיים במהלך זיהום arenavirus, כיוונו לפתח פרוטוקול להמחיש את האינטראקציה בין נגיפי dsRNA את PRRs cytoplasmic.
זיהום ניסויים עם פתוגניים JUNV, MACV, LASV חייבת להתבצע באבטחה ברמה 4 מתקנים (BSL-4). לכן, בנוסף לרמת נמוך ככל הנראה dsRNA נוצר זיהום arenavirus, בדרישות אבטחה הוא טכניקה אתגר נוסף בעת ביצוע מחקרי הדמיה אלה וירוסים פתוגני. על ידי ניצול 9D 5 נוגדן, Candid1 # בחיסון מזן JUNV, פרוטוקול מבוסס-מיקרוסקופ קונפוקלי מתואר בדו ח זה, אשר שימש בהצלחה להמחיש dsRNA, חלבון נגיפי, PRR בו זמנית בתאים נגועים על ידי arenavirus ב BSL2 מעבדות. הפרוטוקול מתאים גם עבור ויזואליזציה של התפלגות תאיים של dsRNA ו PRR במהלך זיהום arenavirus פתוגניים במתקני BSL4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת A549 תאים ולדלקת JUNV
- זרע 2 x 105 אמבריולוגיה A549 לתאי האפיתל אל פולי-D-ליזין (PDL) מצופה coverslips זכוכית דקה ב 12-ובכן הצלחות ב- 24 שעות לפני זיהום.
- להכין aliquots של 150 מ ל JUNV13 -כפל של זיהום (MOI) של פלאק 1.0 ויוצרים יחידה בכל תא מדולל בתקשורת בינוני (DMEM) ששינה הנשר של Dulbecco בתוספת 2% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (P/S ).
- הסר את מדיה של תרבית תאים. להוסיף inoculum וירוס על כל coverslip טוב המכיל ולאחר תקופת דגירה של 1.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס. לנער את הצלחות בכל 15 דקות.
- להסיר את inoculum וירוס, להוסיף 1 מ"ל של DMEM בתוספת 5% FBS ו 1% P/S. דגירה את הצלחת ב 37 ° C עבור נקודת הזמן הרצויים.
2. קיבוע ו- immunostaining
- האחות התקשורת. יש לשטוף את התאים על-ידי הוספת 1 מ"ל תמיסת פוספט buffered (PBS) בתוספת סידן ומגנזיום כדי מכל קידוח.
- הסר PBS. להוסיף 1 מ"ל של מתנול (MeOH) טרום מקורר ב-20 ° C, דגירה ב-20 ° C, או על קרח יבש למשך 15 דקות.
- להסיר את MeOH.
- להוסיף 1 מ"ל של PBS מכל קידוח וחזור שטיפת דגימות ב 4 ° C עם נדנדה עדין עבור 5 דק. לשטוף את כולל של 4 פעמים.
- לשטוף את התאים קבוע על coverslips ב 1 מ"ל של 0.2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol עבור 5 דקות ב 4 ° C, עם נדנדה עדין.
- להוסיף 1 מ"ל של PBS מכל קידוח. רחץ דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם נדנדה עדין. חזור על השלב כביסה כולל של 4 פעמים.
- כדי לזהות dsRNA ו- MDA5, דגירה דגימות ב 200 מ של נוגדנים העיקרי מדולל ב 3% אלבומין שור (BSA). לדלל נוגדן anti-dsRNA 9D 5 ב- 1:2 לדילול ו לדלל נוגדן anti-מד א-5-1:250. דגירה עם נדנדה עדין ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להסיר נוגדנים העיקרי ולשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של PBS במשך חמש דקות עם עדין נדנדה-RT. חוזר זה לשטוף עוד ארבע פעמים.
- להוסיף 200 mL של נוגדנים משניים (1:2, 000 דילול) מדולל ב 3% BSA, דגירה-RT לשעה.
- להסיר נוגדנים משניים ולשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של PBS במשך חמש דקות עם עדין נדנדה-RT. חוזר זה לשטוף עוד ארבע פעמים.
- כדי לזהות נוקלאופרוטאין JUNV (NP) ושמא -, להוסיף 200 מ של נוגדנים מצומדת מדולל ב- BSA 3%. לדלל את NP מצומדת אנטי-JUNV (AG-12)-1:1,000, דגירה הדוגמאות עבור 2 h ב- RT עם נדנדה עדין. לדלל מצומדת אנטי-RIG-מה הנוגדן-שבערך, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נדנדה עדין.
- הסר נוגדנים מצומדת. ולשטוף את כל טוב עם 1 מ"ל של PBS במשך חמש דקות עם עדין נדנדה-RT. חוזר זה לשטוף עוד ארבע פעמים.
- Counterstain על coverslips עם דאפי (1:1, 000) למשך 3 דקות עם נדנדה עדין-RT.
- לשטוף את coverslips 3 פעמים, בכל פעם במשך 5 דקות ב- 1 מ"ל של 0.5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol עם נדנדה עדין-RT.
- לשטוף פעמיים ב 1 מ"ל של PBS עבור 5 דקות בכל פעם עם נדנדה עדין-RT.
- לשטוף פעם בתוך 1 מ"ל של ddH2O עבור 1 דקות ב- RT, נדנדה בעדינות.
- Coverslips הר על גבי זכוכית שקופיות באמצעות מדיה הרכבה. לתת תרופה למשך הלילה.
- חותם השקופיות עם לק, אוויר יבש לשעה.
- התמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי עם 60 x / 1.42 ג ' יגה מפתח נומרי שמן טבילה עדשה באמצעות את פליטת לייזר זהה עבור כל דגימה.
- בעת ניתוח הנתונים, במידת הצורך, לבצע התאמות עבור בהירות וחדות באמצעות ההתאמה ליניארי זהה עבור כל הדגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה הוחל ללמוד את התפלגות ו colocalization בין RLRs (מעטה-אני ל מד א-5) ו dsRNA בתאים נגועים JUNV. כפי שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, ההצטברות של dsRNA מגביר לאורך זמן כמו זיהום נגיפי מתקדם. מרוכז מד א-5 (איור 1) ושמא -אני (איור 2) אותות נמצאו colocalized עם המבנים punctate של NP ו dsRNA.
איור 1: מסלול הזמן של dsRNA ואת היווצרות JUNV NP והפצה של מד א-5- תאים A549 נגועה JUNV ו מעושה הנגועים היו קבוע, צבעונית, עם תמונה לפי הפרוטוקול-24, 36, 48 שעות פוסט זיהום. מדד מחירי הבתים (. של). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מסלול הזמן של dsRNA ואת היווצרות JUNV NP והפצה של המתקן-אני תאים A549 נגועה JUNV ו מעושה הנגועים היו קבוע, צבעונית, עם תמונה לפי הפרוטוקול 24, 36, ומדד מחירי הבתים של 48. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור וירוסי RNA חיוביות-סנס ווירוסים dsDNA, dsRNA מזוהה בקלות עם נוגדן anti-dsRNA J2 נפוץ. עם זאת, וירוסי RNA שלילי-סנס הם האמינו לייצר dsRNA בטמפרטורות נמוכות או מתחת לרמת זיהוי באמצעות נוגדן אותו2. כך, היבטים רבים של אינטראקציה נגיפי RNA ו- PRR הם בעיקר לא ברור של וירוסי RNA שלילי-סנס. ניסינו לשמור על כתם על dsRNA ב זיהום arenavirus באמצעות נוגדן J2 אבל האותות פלורסצנטיות היו לא דיפרנציאבילית בהשוואה הזיהום מעושה. Mab 9D 5, ששימש במקור לצורך זיהוי פאן-שכל, נמצאה להיות ספציפיות עבור dsRNA רגיש יותר נוגדן J25. נוגדן זה שימש בהצלחה לזיהוי נגיפי dsRNA במהלך שלילי-סנס זיהום וירוס רנ א, כולל טיפוס arenavirus choriomeningitis לימפוציטית וירוס5,6,14. בהתאם לכך, השתמשנו Mab 9D 5 שיתוף כתם לנוכחות של dsRNA, נגיפי NP ו PRRs להבין עוד יותר שלהם הפצה ואינטראקציה בתאים בודדים במהלך זיהום arenavirus.
ישנן מספר שיטות קיבוע יכול לשמש כדי לשמר את מבנה התא. קיבוע עם MeOH פועל על-ידי מאיצים חלבונים, ואילו חלבונים crosslinks paraformaldehyde ופורמלין. MeOH הוא יעיל יותר מאשר aldehydes על שימור חומצות גרעין בתאים ומספקת רקע נמוך immunostaining. מתנול גם מסיר שומנים מן התאים, ובכך permeabilizes קרום התא ב15באותו זמן. ב פרוטוקול זה, התאים קבועים באמצעות MeOH קר כקרח. שיטות קיבוע אחרות שהיו ניסיונות גם, כולל תיקון דגימות עם 4% paraformaldehyde, פורמלין, paraformaldehyde ואחריו מתנול מתנול ואחריו paraformaldehyde. עם זאת, גבוהה הבזליים רמת שאינם ספציפיים מכתים נצפתה ב תאים הנגועים ואימץ כאשר נעשה שימוש paraformaldehyde או פורמלין. שיטת קיבוע האופטימלי הוא טרח MeOH ב-20 ° C בהתבסס על רגישות וסגוליות של התוצאות. לפני צביעת נוגדן ראשוני, הדגימה חסימה עם 3% BSA, BSA 5%, 10% או 5% סרום עז במשך 30 דקות עד שעה נבחנה, אבל כל הובילה שאינם ספציפיים, רקע מכתים. התוצאות הטובות ביותר הושגו ללא חסימת שלב ו ישירות באמצעות 3% BSA דילול נוגדן. השלבים הקריטיים למזער את האותות רקע מגניב, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol שוטף לאחר קיבוע. בעוד 5 9D זמינים מסחרית נוגדן הוא מדולל על ידי ואנדאר ו מוכן ישיר לשימוש, לדילול 1:2 של הנוגדן עם 3% BSA עבד גם טוב. במקרה זה האות dsRNA חלש, הנוגדן יכול לשמש ללא דילול.
פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל את האינטראקציה בין dsRNA PRRs ב זיהום arenavirus. בעוד מתודולוגיה זו פותחה בסביבה BSL-2, הקיבעון מתנול המתוארים בזאת מאפשר איון מוחלט של arenavirus. לכן, ניתן להחיל באותו הפרוטוקול המחקר הדמיה עבור arenaviruses פתוגני (קרי, LASV, JUNV ו MACV) במתקן BSL-4. . זה גם ניתן להחיל לפרוטוקול זה על מחקרים על וירוס רנ א אחרים. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, שינוי של הפרוטוקול ייתכן שיהיה צורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות על מתקני הדמיה UTMB מקסים Ivannikov לסיוע מיקרוסקופ.
עבודה זו נתמכה על ידי שירותי הבריאות הציבוריים להעניק RO1AI093445 ו- RO1AI129198 הוענק ל SP, UTMB מחויבות קרן P84373 כדי CH, T32 AI007526 אל EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
