Summary
RNA virüsü çoğaltma sırasında üretilen çift iplikçikli RNA desen tanıma reseptörleri tarafından doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ikna etmek için kabul edilebilir. Negatif anlamda RNA virüsleri için alt düzey dsRNA ve PRRs arasındaki etkileşimi belirsizdir. Arenavirus dsRNA ve tek tek hücreleri içinde PRR görselleştirmek için confocal mikroskopi yöntemi geliştirdik.
Abstract
Çift iplikçikli (ds) RNA ikileştirici orta RNA virüsü enfeksiyonu sırasında elde edilir. DsRNA retinoik asit gibi ana desen tanıma reseptörleri (PRRs) tarafından tanınması (teçhizat-ben) tarihlerde reseptörleri (RLRs) teçhizat-ben ve melanom farklılaşma ilişkili protein 5 (MDA-5) doğuştan gelen bağışıklık yanıtı indüksiyon için yol açar. Oluşumu ve hücre içi dsRNA pozitif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu dağılımı de karakterize tarafından mikroskobu. Bazı arenaviruses de dahil olmak üzere birçok olumsuz anlamda RNA virüsleri doğuştan gelen bağışıklık yanıtı sırasında enfeksiyon tetikler. Ancak, negatif anlamda RNA virüsleri viral dsRNA tanınması PRR görüntüleme çalışma engel dsRNA seviyesinin düşük üretmek için düşünüldü. Ayrıca, yüksek patojenik arenaviruses ile enfeksiyon deneyler yüksek kapsama Biyogüvenlik düzeyi tesisleri (BSL-4) gerçekleştirilmesi gerekir. Viral RNA ve PRRs arasındaki etkileşim yüksek patojenik RNA virüsü için büyük ölçüde araştırmacılar BSL-4 tesislerinde yüz gereken ek teknik sorunlar nedeniyle bilinmiyor. Son zamanlarda, bir monoklonal pan-Enterovirüslerin algılama için başlangıçta kullanılan antikor (Mab) (klon 9 d 5) özellikle geleneksel J2 veya K1 anti-dsRNA antikorlar daha yüksek bir hassasiyetle dsRNA algılamak için bulundu. Burada, 9 d 5 kullanan tarafından antikor, biz başarılı bir şekilde dsRNA, viral protein ve aynı anda bireysel hücrelerdeki arenavirus tarafından enfekte PRR görselleştirmek için kullanılan bir confocal mikroskobu protokol tanımlamak. Ayrıca dsRNA ve BSL4 tesislerinde patojen arenavirus enfekte hücrelerde PRR dağıtım görüntüleme için uygun iletişim kuralıdır.
Introduction
Çift iplikçikli (ds) RNA retinoik asit gibi desen tanıma reseptörleri (PRRs) tarafından tanınması ana indüksiyon doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ilk adımdır (teçhizat-ben) tarihlerde reseptörleri (RLRs) teçhizat-ben ve melanom farklılaşma ilişkili protein 5 (MDA-5)1. Pozitif anlamda RNA virüsleri, dsRNA genellikle kolayca J2 veya K1 anti-dsRNA monoklonal antikorlar (Mab)2kullanarak tespit edilebilir. Pozitif iplikçikli RNA virüsleri, gibi picornavirus, dsRNA ve PRRs arasındaki etkileşimi confocal mikroskobu3ile karakterize. Ancak, negatif anlamda için RNA virüsü, görselleştirme ve karakterizasyonu PRR ve dsRNA etkileşim engel dsRNA hassas antikorlar eksikliği ile. RNA floresan In situ hibridizasyon (balık) viral RNA ve PRRs4görsel öğeye uygulanmıştır. Yine de, balık metodoloji hedef RNA dizisi bilgi gerektirir ve ortak PRR boyama ile uyumlu olmayabilir. Son zamanlarda, 9 d 5 başlangıçta pan-Enterovirüslerin enfeksiyonu tanısı için geliştirilmiş, Mab J2 Mab hassas ve kolayca olabilir bulundu negatif-anlamda RNA virüsü enfeksiyonu5,6dsRNA algılamak. Böylece, Mab 9 d 5 bir roman ve viral çoğaltma ve PRR ve negatif anlamda RNA virüsü için viral RNA arasındaki etkileşimi incelemek için yararlı bir araç var.
Arenaviruses tek iplikçikli, negatif anlamda RNA virüsleri, Lassa virüs (LASV), Junin virüs (JUNV) ve Machupo virüs (MACV), ağır kanamalı ateş hastalıkları insanlar7' neden gibi birçok insan patojenleri dahil bir aileyiz. Arjantin kanamalı ateşi yeni dünya arenavirus JUNV tarafından neden olduğu ciddi ve ölümcül vakaları klinik verileri normalden daha yüksek düzeyleri serum IFN-α8,9sergi. Patojenik NW arenaviruses (JUNV ve MACV), ama değil patojenik eski dünya arenavirus, LASV, bir tür teşvik göstermiştir ben interferon (IFN) yanıt monosit elde edilen insan dendritik hücreler10. Ayrıca, teçhizat-ben biridir sensörler arabuluculuk tip ı IFN yanıt JUNV enfekte hücreleri11'. Ayrıca dsRNA tanıma için geleneksel olarak bilinir, protein kinaz R (PKR) reseptör patojenik NW arenavirus enfeksiyon12' aktif bulduk. Daha virüs özgü IFN yanıt mekanizması arenavirus enfeksiyon sırasında anlamak için viral dsRNA ve sitoplazmik PRRs arasındaki etkileşimi görselleştirmek için bir protokol geliştirmek amaçlanmıştır.
Enfeksiyon deneyler patojen JUNV, MACV ve LASV var Biyogüvenlik içinde gerçekleştirilecek seviye 4 (BSL-4) özellikleri. Böylece, arenavirus hastalık içinde oluşan dsRNA muhtemelen düşük düzeyine ek olarak, Biyogüvenlik gereksinimleri toplantı başka bir tekniği görüntüleme çalışmaları için bu yüksek patojenik virüs gerçekleştirirken mücadeledir. 9 d 5 kullanan tarafından antikor ve JUNV Candid1 # aşı suşu, confocal mikroskobu tabanlı bir protokol başarıyla dsRNA, viral protein ve aynı anda arenavirus içinde tarafından enfekte hücrelerde PRR görselleştirmek için kullanılan bu raporda açıklanan BSL2 labs. Protokol ayrıca dsRNA ve PRR hücre içi dağıtımını BSL4 tesislerinde patojen arenavirus enfeksiyon sırasında görselleştirme için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. A549 hücreleri ve JUNV enfeksiyon hazırlanması
- Tohum 2 x 105 insan akciğer epitel A549 hücreleri üzerine poli-D-lizin (PDL) 12-şey levha cam coverslips az 24 saat önce enfeksiyon kaplı.
- Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) medya % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin ve streptomisin (P/S ile seyreltilmiş hücre başına birim oluşturan 1.0 plak aliquots JUNV13 bir çarpma enfeksiyon (MOI), 150 ml hazırlamak ).
- Medya hücre kültürü kaldırın. Virüs inoculum üzerinde de içeren her coverslip ekleyin ve 37 ° C'de 1,5 saat için kuluçkaya Levhalar her 15dk sallamak.
- Virüs inoculum kaldırmak %5 FBS ve %1 P DMEM 1 mL ekleyin/S. kuluçkaya istenen saat noktası için 37 ° C'de plaka.
2. fiksasyon ve immunostaining
- Medya Aspire edin. Hücreleri 1 mL kalsiyum ve magnezyum için her şey ile takıma fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyerek durulayın.
- PBS kaldırın. 1-20 ° C'de önceden soğutulmuş mL metanol (MeOH) ekleyin ve 15 dakika Kuru buz üstünde ya da -20 ° C'de kuluçkaya.
- MeOH kaldırın.
- Her şey için PBS 1 mL ekleyin ve yıkama örnekleri 4 ° C'de nazik için 5 dk. sallanan ile yıkama toplam 4 kez tekrarlayın.
- Coverslips 1 ml % 0,2 t-octylphenoxypolyethoxyethanol 4 ° c hafif sallanan ile 5 min için sabit hücrelerdeyse yıkayın.
- PBS 1 mL her şey için ekleyin. Örnekleri 4 ° c hafif sallanan ile 5 dakika yıkayın. Çamaşır toplam 4 kez tekrarlayın.
- DsRNA ve MDA5 algılamak için birincil antikorlar % 3 Sığır serum albumin (BSA) içinde seyreltilmiş 200 mL örneklerinde kuluçkaya. 1:2 seyreltme adlı anti-dsRNA 9 d 5 antikor sulandırmak ve 1:250, anti-MDA-5 antikor oranında seyreltin. Nazik 4 ° C'de gecede sallanan ile kuluçkaya.
- Birincil antikorlar kaldırmak ve her yıkama PBS 1 mL RT. tekrarı bu yıkama dört kez daha sallanan nazik ile 5 min için ile iyi.
- 200 mL % 3 BSA içinde seyreltilmiş ikincil antikor (1:2, 000 seyreltme) ekleyin ve RT 1 h için kuluçkaya.
- İkincil antikorlar kaldırmak ve her yıkama PBS 1 mL RT. tekrarı bu yıkama dört kez daha sallanan nazik ile 5 min için ile iyi.
- JUNV nükleoprotein (NP) tespit etmek ve teçhizat-eklerim konjuge antikorlar % 3 BSA içinde seyreltilmiş 200 mL. 1:1,000, konjuge anti-JUNV NP (AG-12) sulandırmak ve örnekleri RT hafif sallanan ile 2 h için kuluçkaya. Konjuge anti-RIG-ben antikor 1:500, seyreltik ve 4 ° C'de gecede hafif sallanan ile kuluçkaya.
- Konjuge antikorlar kaldırmak ve her yıkama PBS 1 mL RT. tekrarı bu yıkama dört kez daha sallanan nazik ile 5 min için ile iyi.
- Nazik RT. sallanan ile 3 dk DAPI (1:1, 000) ile coverslips counterstain
- Coverslips 3 kez, her zaman nazik RT. sallanan ile t-octylphenoxypolyethoxyethanol %0,5 1 ml 5 min için yıkama
- İki kez PBS 1 mL 5 min için her zaman nazik RT. sallanan ile yıkayın
- Bir kez GKD2O RT, hafifçe sallanır, 1 dk. için 1 mL yıkayın.
- Mount coverslips cam üzerine montaj medya kullanarak slaytlar. Bir gecede tedavi izin.
- Mühür tırnak cilası ve hava ile slaytlar için 1 h kuru.
- Confocal 60 x mikroskopla görüntü / 1,42 sayısal diyafram yağı daldırma lens ile aynı lazer emisyon her örnek için.
- Gerekirse verileri analiz ederken, parlaklık ve kontrast aynı linear ayar için tüm numuneleri kullanılarak için ayarlamalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı dağıtım ve colocalization RLRs arasında çalışma uygulandı (teçhizat-ben ve MDA-5) ve dsRNA JUNV enfeksiyonlu hücrelerdeki. Şekil 1 ve Şekil 2' de gösterildiği viral enfeksiyon ilerledikçe zamanla dsRNA birikimi artar. Konsantre MDA-5 (Şekil 1) ve teçhizat-ben (Şekil 2) sinyalleri ile NP ve dsRNA yapıları punctate colocalized bulundu.
Şekil 1: zaman ders dsRNA ve JUNV NP oluşumu ve MDA-5 dağılımı. JUNV-enfekte ve sahte enfekte A549 hücreleri sabit, lekeli ve 24, 36 ve 48 saat sonrası enfeksiyon (HPI) protokolüne göre görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: zaman ders dsRNA ve JUNV NP oluşumu ve teçhizat-ı. dağıtım JUNV-enfekte ve sahte enfekte A549 hücreleri sabit, lekeli ve 24, 36 ve 48 HPI protokolüne göre görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DsRNA pozitif anlamda RNA virüsleri ve dsDNA virüsler için yaygın olarak kullanılan J2 anti-dsRNA antikor ile kolayca tespit edilmiştir. Ancak, negatif anlamda RNA virüsleri dsRNA bir düşük düzeyindeki veya altındaki aynı antikor2kullanarak tespiti üretmek inanılıyor. Böylece, viral RNA ve PRR etkileşim birçok açıdan olumsuz anlamda RNA virüsleri için büyük ölçüde pek açık değildir. DsRNA J2 antikor kullanarak arenavirus enfeksiyon için leke denedi ancak floresan sinyallerini sahte enfeksiyon karşılaştırıldığında türevlenebilir değildi. Mab 9 d 5, pan-Enterovirüslerin algılama için başlangıçta kullanılan dsRNA için özel ve J2 antikor5' ten daha duyarlı olduğu anlaşıldı. Bu antikor, viral dsRNA sırasında olumsuz anlamda RNA virüsü enfeksiyonu, prototip arenavirus lenfositik choriomeningitis virüs5,6,14dahil olmak üzere algılamak için başarıyla kullanılmıştır. Buna göre Mab 9 d 5 ortak dsRNA, viral NP ve daha kendi dağıtım ve arenavirus enfeksiyon sırasında tek tek hücreleri içinde etkileşimi anlamak için PRRs varlığı için leke için kullanılır.
Hücre yapısı korumak için kullanılan birden çok fiksasyon yöntemi vardır. MeOH ile fiksasyon davranır proteinler, presipite tarafından ise paraformaldehyde ve formalin Glossar proteinler. MeOH aldehitler nükleik asitler hücrelerdeki korunması, daha etkilidir ve düşük arka plan immunostaining sağlar. Metanol Ayrıca lipidler hücrelerden kaldırır ve böylece hücre zarlarında aynı saat15permeabilizes. Bu protokol için hücreleri buz gibi MeOH kullanarak sabitlenir. Diğer fiksasyon yöntemi de, %4 paraformaldehyde, formalin, metanol tarafından takip paraformaldehyde ve paraformaldehyde tarafından takip metanol ile örnekleri sabitleme dahil olmak üzere denendi. Ancak, paraformaldehyde veya formalin kullanıldığında sahte enfekte hücrelerde yüksek bazal düzey non-spesifik boyama gözlendi. En iyi fiksasyon yöntemi-20 ° C'de MeOH ile fiksasyon duyarlılık ve özgüllük sonuçları üzerinde dayanır. Birincil antikor boyama önce % 3 BSA, %5 BSA ve 30 dk ila 1 saat için % 10 veya % 5 keçi serum ile örnek engelleme, tüm sonuçlandı içinde non-spesifik, arka plan boyama ama test edildi. En iyi sonuçları olmadan adım engelleme ve doğrudan % 3 BSA içinde antikor dilüsyonu kullanılarak elde edildi. Arka plan sinyalleri en aza indirmek kritik adım PBS ve fiksasyon sonra t-Octylphenoxypolyethoxyethanol yıkar. Piyasada bulunan 9 d 5 antikor işportacı ve hazır için seyreltilmiş kullanım doğrudan iken, % 3 BSA ile antikor bir 1:2 seyreltme da iyi çalıştı. DsRNA Sinyal zayıf durumda, antikor seyreltme kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı arenavirus enfeksiyon dsRNA ve PRRs arasında etkileşiminde eğitim için yararlı olabilir. Bu metodoloji BSL-2 ortamında geliştirilmiş olsa da, burada açıklanan metanol fiksasyon arenavirus tam inactivation sağlar. Bu nedenle, aynı iletişim kuralını görüntüleme çalışma yüksek patojenik arenaviruses (yani, LASV, JUNV ve MACV) BSL-4 tesis için uygulanabilir. Diğer RNA virüsü üzerinde çalışmalar bu iletişim kuralı uygulamak mümkündür. En iyi sonuçları elde etmek için bir değişiklik iletişim kuralı gerekli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
UTMB görüntüleme çekirdek imkanları ve Maxim Ivannikov mikroskop yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser halk sağlığı hizmeti tarafından desteklenen RO1AI093445 ve RO1AI129198 layık için SP, UTMB taahhüdü Fonu P84373 CH için ve T32 AI007526 EM için vermek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
