Summary
Dubbelsträngat RNA produceras under RNA-virus replikering kan kännas igen av mönster erkännande receptorer att inducera ett medfödda immunsvar. För negativ-sense RNA virus oklar samspelet mellan lågaktivt dsRNA och föräldrarättigheter och-skyldigheter. Vi har utvecklat en konfokalmikroskopi metod att visualisera arenavirus dsRNA och PRR i enskilda celler.
Abstract
Dubbelsträngat (ds) RNA produceras som en replikationsförmåga intermediär under RNA-virusinfektion. Erkännande av dsRNA värd mönster erkännande receptorer (PRRs) såsom retinoinsyra (RIG-jag) gillar receptorer (RLR) RIG-jag och melanom differentiering-associerade protein 5 (MDA-5) leder till induktion av medfödda immunsvaret. Bildning och intracellulär distribution av dsRNA i positiv-sense RNA-virusinfektion har också präglats av mikroskopi. Många negativa-sense RNA virus, inklusive några arenaviruses, utlösa medfödda immunförsvaret vid infektion. Negativ-sense RNA virus ansågs dock låga halter av dsRNA, som hindrar bildtagningsstudien PRR erkännande av viral dsRNA. Dessutom måste infektion experiment med högpatogen arenaviruses utföras i hög inneslutning biosäkerhet nivå faciliteter (BSL-4). Samspelet mellan viral RNA och föräldrarättigheter och-skyldigheter för högpatogen RNA-virus är i stort sett okänd på grund av de ytterligare tekniska utmaningar som forskare behöver möta i BSL-4 anläggningar. Nyligen, en monoklonal antikropp (Mab) (klon 9 d 5) ursprungligen användes för pan-enterovirus upptäckt konstaterats att specifikt identifiera dsRNA med en högre känslighet än de traditionella J2 eller K1 anti-dsRNA antikropparna. Häri, genom att utnyttja den 9 d 5 antikropp, beskriver vi ett konfokalmikroskopi protokoll som använts framgångsrikt att visualisera dsRNA, virala protein och PRR samtidigt i enskilda celler infekterade av arenavirus. Protokollet är också lämplig för studier av dsRNA och PRR distribution i patogena arenavirus infekterade celler i BSL4 faciliteter avbildning.
Introduction
Det första steget av induktion av medfödda immunsvaret är värd erkännande av dubbelsträngat (ds) RNA av mönster erkännande receptorerna (PRRs) såsom retinoinsyra (RIG-jag) gillar receptorer (RLR) RIG-jag och melanom differentiering-associerade protein 5 (MDA-5)1. För positiva-sense RNA virus, kan dsRNA oftast lätt upptäckas med J2 eller K1 anti-dsRNA monoklonala antikroppar (Mab)2. Interaktion mellan dsRNA och PRRs i positiv-strand RNA virus, till exempel picornavirus, har präglats med konfokalmikroskopi3. Dock för negativ-känsla RNA-virus, har visualisering och karakterisering av PRR och dsRNA interaktion hindrats av avsaknaden av känsliga antikroppar mot dsRNA. RNA fluorescerande in situ hybridisering (FISH) har tillämpats på visualisering av viral RNA och PRRs4. Dock metoden fisk kräver kunskap om målet RNA-sekvens och kanske inte är kompatibla med PRR Co färgning. Nyligen, den 9 d 5 Mab, som ursprungligen utvecklades för diagnos av pan-enterovirus infektion, befanns vara känsligare än den J2 Mab och kan lätt upptäcka dsRNA i negativ-sense RNA-virus infektion5,6. Mab 9 d 5 alltså en roman och användbart verktyg för att studera virusreplikation och samspelet mellan PRR och viral RNA för negativ-sense RNA-virus.
Arenaviruses är en familj av enkelsträngat, negativ-sense RNA-virus, som omfattar flera mänskliga patogener, såsom Lassa (LASV), Junín virus (JUNV) och Machupo viruset (MACV), som orsakar allvarlig hemorragisk feber sjukdomar i människor7. Kliniska data från svåra och dödliga fall av argentinsk hemorrhagic feber orsakas av nya världens arenavirus JUNV uppvisar ovanligt höga nivåer av serum IFN-α8,9. Vi har visat att den patogena NW-arenaviruses (JUNV och MACV), men inte den patogena gamla världens arenavirus, LASV, inducerar en typ I interferon (IFN) svar i mänskliga monocyt-derived dendritiska celler10. Dessutom rigg-jag är en av sensorerna medla typ I IFN svar i JUNV-infekterade celler11. Vi fann också att protein kinase R (PKR) receptorn, som kallas traditionellt för dsRNA erkännande, aktiveras i patogena NW arenavirus infektion12. För att ytterligare förstå mekanismen av virus-specifika IFN svar under arenavirus infektion, syftar vi till att utveckla ett protokoll för att visualisera samspelet mellan viral dsRNA och de cytoplasmiska PRRs.
Infektion experiment med patogena JUNV, MACV och LASV måste utföras i biosäkerhet nivå 4 (BSL-4) faciliteter. Således, förutom den förmodligen låg nivån av dsRNA bildades arenavirus infektion, uppfylla biosäkerhet är en annan teknik utmaning när du utför imaging studier för dessa högpatogena virus. Genom att utnyttja den 9 d 5 antikropp och vaccinstammen Candid1 # av JUNV, en confocal microscopy-baserat protokoll som beskrivs i detta betänkande, som har använts framgångsrikt att visualisera dsRNA, virala protein och PRR samtidigt i celler som smittats av arenavirus i BSL2 labs. Protokollet är också lämplig för visualisering av intracellulär distribution av dsRNA och PRR under patogena arenavirus infektion i BSL4 faciliteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av A549 celler och JUNV infektion
- Utsäde 2 x 105 mänskliga lungan A549 epitelceller på poly-D-lysin (PDL) belagda glas coverslips i 12 brunnar på 24 timmar före infektion.
- Förbereda alikvoter av 150 mL JUNV13 vid en multiplikation av infektion (MOI) för 1,0 plackbildande enhet per cell utspätt i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) media kompletteras med 2% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin och streptomycin (P/S ).
- Ta bort medier från cellodling. Lägg till virus inokulum på varje brunn innehållande täckglas och inkubera i 1,5 timmar vid 37 ° C. Skaka plattorna varje 15 min.
- Ta bort det virus inokulatet, tillsätt 1 mL DMEM kompletteras med 5% FBS och 1% P/S. Inkubera plattan vid 37 ° C för önskad tidpunkt.
2. fixering och immunfärgning
- Aspirera media. Skölj cellerna genom att tillsätta 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletteras med kalcium och magnesium till varje brunn.
- Ta bort PBS. Tillsätt 1 mL metanol (MeOH) före kyld vid-20 ° C och inkubera vid-20 ° C eller på torris i 15 min.
- Ta bort MeOH.
- Tillsätt 1 mL PBS till varje brunn och tvätta prover vid 4 ° C med mild gunga för 5 min. Upprepa tvätten för totalt 4 gånger.
- Tvätta fast cellerna på coverslips i 1 mL 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol för 5 min vid 4 ° C, med mild gunga.
- Tillsätt 1 mL PBS till varje brunn. Tvätta prover vid 4 ° C i 5 min med mild gunga. Upprepa steget tvätt för totalt 4 gånger.
- För att upptäcka dsRNA och MDA5, inkubera prover i 200 mL av primära antikroppar utspätt i 3% bovint serumalbumin (BSA). Späd den anti-dsRNA 9 d 5 antikroppen vid en spädning 1:2 och späd anti-MDA-5 antikroppen på 1: 250. Inkubera med mild gunga vid 4 ° C över natten.
- Ta bort primär antikroppar och tvätta vart bra med 1 mL PBS för 5 min med mild gunga på RT. Upprepa detta tvätta fyra gånger.
- Tillsätt 200 mL av sekundära antikroppar (1:2, 000 utspädning) utspätt i 3% BSA och inkubera vid RT för 1 h.
- Ta bort sekundära antikroppar och tvätta vart bra med 1 mL PBS för 5 min med mild gunga på RT. Upprepa detta tvätta fyra gånger.
- Att upptäcka JUNV nucleoprotein (NP) och rigg-I, tillsätt 200 mL av konjugerade antikroppar utspätt i 3% BSA. Späd den konjugerade anti-JUNV NP (AG-12) på 1:1,000 och inkubera prover för 2 h på RT med mild gunga. Späd den konjugerade anti-RIG-jag antikroppen på 1: 500 och inkubera vid 4 ° C över natten med mild gunga.
- Ta bort konjugerade antikroppar och tvätta vart bra med 1 mL PBS för 5 min med mild gunga på RT. Upprepa detta tvätta fyra gånger.
- Counterstain coverslips med DAPI (1:1, 000) för 3 min med mild gunga på RT.
- Tvätta coverslips 3 gånger, varje gång för 5 min i 1 mL av 0,5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol med mild gunga på RT.
- Tvätta två gånger i 1 mL PBS för 5 min varje gång med mild gunga på RT.
- Tvätta en gång i 1 mL av ddH2O för 1 min på RT, gunga försiktigt.
- Montera coverslips på objektglas med montering media. Låt bota över natten.
- Försegla glasen med nagellack och lufttorka för 1 h.
- Bild på confocal Mikroskop med 60 x / 1,42 numeriska bländaröppningen olja nedsänkning lins med samma laser utsläppen för varje prov.
- När analysera data, om nödvändigt, göra justeringar för ljusstyrka och kontrast med den samma linjär justeringen för alla prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll användes för att studera fördelningen och colocalization mellan RLR (RIG-jag och MDA-5) och dsRNA i JUNV-infekterade celler. Som visas i figur 1 och figur 2, ökar ansamling av dsRNA över tid som virusinfektion fortskrider. Koncentrerad MDA-5 (figur 1) och RIG-jag (figur 2) signaler hittades colocalized med punktuell strukturer av NP och dsRNA.
Figur 1: tidsförloppet för dsRNA och JUNV NP bildandet och fördelningen av MDA-5. JUNV-infekterade och mock-infekterade A549 celler var fast, målat och avbildas enligt protokollet på 24, 36 och 48 timmar efter infektion (HPI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: tidsförloppet för dsRNA och JUNV NP bildandet och fördelningen av RIG-I. JUNV-infekterade och mock-infekterade A549 celler var fast, målat och avbildas enligt protokollet på 24, 36 och 48 HPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För positiva-sense RNA och dsDNA virus upptäcks dsRNA lätt med den utbredda J2 anti-dsRNA antikroppen. Dock tros negativ-sense RNA virus producera dsRNA låga eller under detektionsgränsen använder samma antikropp2. Många aspekter av viral RNA och PRR interaktion är således till stor del oklart för negativ-sense RNA-virus. Vi försökte färga för dsRNA arenavirus infektion med den J2 antikroppen men fluorescens signalerna var inte deriverbar jämfört med mock infektionen. Mab 9 d 5, ursprungligen användes för pan-enterovirus detektering, befanns vara specifika för dsRNA och känsligare än den J2 antikropp5. Denna antikropp har framgångsrikt använts för att upptäcka viral dsRNA vid negativ-sense RNA-virusinfektion, inklusive den prototyp arenavirus lymfocytisk choriomeningitis virus5,6,14. Således brukade vi Mab 9 d 5 Co stain för förekomst av dsRNA, viral NP och föräldrarättigheter och-skyldigheter att ytterligare förstå sin distribution och interaktion i enskilda celler under arenavirus infektion.
I området i närheten finns det flera fixering-metoder som kan användas för att bevara cellens struktur. Fixering med MeOH fungerar genom utfällning av proteiner, medan PARAFORMALDEHYD och formalin antipyridinantikropp proteiner. MeOH är effektivare än aldehyder på bevara nukleinsyror i celler och ger låg bakgrund immunfärgning. Metanol tar också bort lipider från celler och därmed permeabilizes cellmembran på samma tid15. I detta protokoll, är cellerna fasta med iskall MeOH. Andra fixering var också metoderna, inklusive fastställande prover med 4% paraformaldehyd, formalin, paraformaldehyd följt av metanol och metanol följt av PARAFORMALDEHYD. Emellertid observerades hög basal nivå icke-specifik färgning i mock-infekterade celler när PARAFORMALDEHYD eller formalin användes. Optimal fixering metoden är fixering med MeOH vid-20 ° C baserat på känslighet och specificitet av resultaten. Innan primär antikropp färgning, testades prov blockering med 3% BSA, 5% BSA och 10% eller 5% get serum för 30 min till 1 timme, men alla resulterade i icke-specifik, bakgrundsfärgning. De bästa resultaten uppnåddes utan att blockera steg och direkt med 3% BSA i antikropp utspädning. De kritiska steg i att minimera bakgrund signalerna är PBS och t-Octylphenoxypolyethoxyethanol tvättar efter fixering. Medan de kommersiellt tillgängliga 9 d 5 antikropp späds av vender och redo för direkt användning, en 1:2 utspädning av antikropp med 3% BSA också fungerat bra. I fall att dsRNA signalen är svag, kan antikroppen användas utan spädning.
Detta protokoll kan utnyttjas för att studera interaktionen mellan dsRNA och PRRs i arenavirus infektion. Medan denna metod utvecklades i en BSL-2-miljön, kan metanol fixering beskrivs häri komplett inaktivering av arenavirus. Samma protokoll kan därför tillämpas på bildtagningsstudie för högpatogen arenaviruses (dvs. LASV, JUNV och MACV) i en BSL-4 anläggning. Det är också möjligt att tillämpa detta protokoll till studier på andra RNA-virus. För att uppnå optimala resultat, kan det krävas en ändring av protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka Sophiaalbertina imaging corefaciliteter och Maxim Ivannikov för Mikroskop stöd.
Detta arbete stöddes av Public Health Service bevilja RO1AI093445 och RO1AI129198 tilldelas till SP, Sophiaalbertina engagemang fonden P84373 till CH och T32 AI007526 till EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
