Summary
RNA 바이러스 복제 생산 하는 이중 가닥 RNA는 타고 난 면역 반응 유도 하 패턴 인식 수용 체에 의해 인식할 수 있습니다. 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 낮은 수준의 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 불분명 남아 있습니다. Arenavirus dsRNA와 개별 셀에서 PRR를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법 방법을 개발 했습니다.
Abstract
더블-좌초 (ds) RNA는 RNA 바이러스 감염 시 일차 중간으로 생산 됩니다. 호스트 패턴 인식 수용 체 (호흡기) retinoic 산 등으로 dsRNA의 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5) 타고 난 면역 반응의 유도에 이르게. 형성 및 세포내 분포 긍정적인 감 RNA 바이러스 감염에서에서 dsRNA가 되었습니다 잘 특징 현미경 검사 법. 일부 arenaviruses를 포함 하 여 많은 부정적인 감 RNA 바이러스 감염 시 타고 난 면역 반응을 트리거합니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 바이러스 성 dsRNA의 PRR 인식의 이미징 연구를 방해 하는 낮은 수준의 생산으로 생각 되었다. 또한, 감염 실험 높게 병원 성 arenaviruses 높은 견제 biosafety 수준 시설 (BSL-4)에서 수행 되어야 합니다. 높게 병원 성 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA와 호흡기 간의 상호 작용 크게 알려진 연구자 BSL-4 시설에서 직면 하는 추가 기술 도전 때문입니다. 최근, 단일 클론 항 체 (Mab) (클론 9D 5) 원래 팬 엔테로바이러스 감지에 사용 특히 dsRNA 전통적인 J2 또는 K1 안티 dsRNA 항 체 보다 더 높은 감도와 감지 하 발견 되었습니다. 9D 5를 이용 하 여 여기, 항 체, confocal 현미경 검사 법 프로토콜 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR arenavirus에 의해 감염 하는 개별 셀에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된 설명. 프로토콜은 또한 이미징 연구 dsRNA 및 PRR 분포 BSL4 시설에서 감염 하는 병원 성 arenavirus 세포에 적합 합니다.
Introduction
타고 난 면역 반응의 유도의 초기 단계는 더블-좌초 (ds) RNA retinoic 산 등 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 호스트 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5)1. 긍정적인 감 RNA 바이러스, dsRNA 수 있습니다 일반적으로 쉽게 감지가 J2 또는 K1 안티 dsRNA 단일 클론 항 체 (Mab)2를 사용 하 여. DsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 picornavirus, 같은 긍정적인 물가 RNA 바이러스에 confocal 현미경 검사 법3을 사용 하 여 특징 되었습니다 했다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 시각화 및 PRR 및 dsRNA 상호 작용의 특성은 되었습니다 의해 방해 dsRNA에 중요 한 항 체의 부족. RNA 형광 제자리 교 잡 (물고기) 바이러스 성 RNA와 호흡기4의 시각화에 적용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 물고기 방법론 대상 RNA 시퀀스의 지식이 필요 하 고 PRR 공동 얼룩과 호환 되지 않을 수 있습니다. 최근, 9D 5는 원래 팬 엔테로바이러스 감염의 진단에 대 한 개발, Mab 발견 됐다 J2 Mab 보다 더 예민 하 고 쉽게 수 부정적인 감 RNA 바이러스 감염5,6에서 dsRNA를 감지. 따라서, Mab 9D 5 소설과 바이러스 성 복제 및 PRR 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA의 상호작용 연구에 유용한 도구 이다.
Arenaviruses는 Lassa 바이러스 (LASV), Junín 바이러스 (JUNV)와 Machupo (MACV), 인간7에서 심각한 출혈 질병의 원인이 그 같은 여러 인간 병원 체를 포함 하는 단일 가닥, 부정적인 감 RNA 바이러스의 가족입니다. 임상 데이터로 새로운 세계 arenavirus JUNV에 의해 발생 하는 아르헨티나 출혈의 심각 하 고 치명적인 경우 혈 청 IFN-α8,9의 비정상적으로 높은 수준의 전시. 우리 병원 성 NW arenaviruses (JUNV, MACV), 하지만 하지는 병원 성 올드 월드 arenavirus, LASV, 유도 종류 것으로 나타났습니다 내가 인간 monocyte 파생 된 모 수석 세포10인터페론 (IFN) 응답. 또한, 장비-센서 중 하나입니다 중재 유형 I IFN 응답 JUNV 감염 세포11. 우리는 또한 전통적으로 dsRNA 인식에 대 한 알려져 있다는 단백질 키 니 아 제 R (PKR) 수용 체 병원 성 NW arenavirus 감염12활성화 됩니다 발견. 더 arenavirus 감염 시 바이러스 관련 IFN 응답의 메커니즘을 이해, 우리는 바이러스 성 dsRNA와 세포질 호흡기 간의 상호 작용을 시각화 하기 위해 프로토콜을 개발 목적.
병원 성 JUNV, MACV 및 LASV 감염 실험 biosafety에서 수행 되어야 하는 레벨 4 (BSL-4) 시설. 따라서, 뿐만 아니라 arenavirus 감염에 dsRNA의 아마도 낮은 수준 biosafety 요구 사항을 충족입니다 다른 기술 도전이 높게 병원 성 바이러스에 대 한 이미징 연구를 수행할 때. 9D 5를 이용 하 여 항 체와 JUNV의 Candid1 # 백신 긴장, confocal 현미경 검사 법 기반 프로토콜은 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR에 arenavirus에 의해 감염 된 세포에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된이 보고서에 설명 BSL2 실험실입니다. 프로토콜 또한 세포내의 분포 dsRNA와 PRR BSL4 시설에서 병원 성 arenavirus 감염 시의 시각화를 위해 적당 하다.
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Protocol
1. 준비 A549 세포 및 JUNV 감염의
- 폴 리-D-리 (PDL)에 시드 2 x 105 인간 폐 상피 A549 세포 감염 이전 24 시간에 유리 coverslips 12-잘 접시에 코팅.
- JUNV13 감염 (MOI)의 곱셈에서의 150 mL의 aliquots 단위를 형성 하는 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 미디어 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린과 스 (P/S 보충에 희석 셀당 1.0 플 라크의 준비 ).
- 세포 배양에서 미디어를 제거 합니다. 각 잘 포함 coverslip에 바이러스 inoculum을 추가 하 고 37 ° c.에 1.5 h에 대 한 품 어 접시 마다 15 분 흔들.
- 제거 바이러스 inoculum DMEM 5 %FBS 1 %P 보충의 1 mL을 추가/미 품 어 원하는 시간 지점에 대 한 37 ° C에서 접시.
2. 고정 및 immunostaining
- 미디어 발음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 칼슘과 마그네슘을 각 영역 보충의 1 mL을 추가 하 여 셀을 씻어.
- PBS를 제거 합니다. 사전-20 ° C에서 냉장 메탄올 (MeOH)의 1 mL을 추가 하 고 15 분을 위한 드라이 아이스 또는-20 ° C에서 품 어.
- MeOH를 제거 합니다.
- 1 mL PBS의 각 음을 추가 하 고 부드러운 락을 5 분으로 4 ° C에서 워시 샘플 총 4 번의 세척을 반복.
- 0.2 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol 부드러운 락와 4 ° C에서 5 분의 1 mL에 coverslips에 고정 된 세포를 씻어.
- 각 우물에 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 부드러운 락으로 5 분 동안 4 ° C에서 샘플을 씻으십시오. 총 4 번에 대 한 세척 단계를 반복 합니다.
- DsRNA와 MDA5를 검출, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 희석 하는 주 항 체의 200 mL에 샘플을 품 어. 1:2 희석에 안티-dsRNA 9D 5 항 체를 희석 하 고 1: 250에서 안티-MDA-5 항 체 희석. 부드러운 락을 4 ° C에서 하룻밤 함께 품 어.
- 1 차 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
- 200ml 2 차 항 체 (1:2, 000 희석)의 3 %BSA 희석을 추가 하 고 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
- 2 차 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
- JUNV nucleoprotein (NP)를 감지 하 고 장비-, 추가 3 %BSA 희석 활용 된 항 체의 200 mL. 1:1,000에서 활용 된 안티-JUNV NP (AG-12)을 묽 게 하십시오 그리고 부드러운 락 RT에서 h 2에 대 한 샘플을 품 어. 활용 된 안티-RIG-나 항 체 1: 500에 희석 하 고 부드러운 락으로 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
- 활용 된 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
- 실시간에 부드러운 락으로 3 분 DAPI (1:1, 000)와 coverslips counterstain
- 워시는 coverslips 3 번, 실시간에 부드러운 락으로 0.5 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol의 1 mL에 5 분 동안 각 시간
- 실시간에 부드러운 락 각 시간 5 분에 대 한 PBS의 1 mL에 두 번 씻으십시오
- DdH2O RT, 부드럽게 락에 1 분의 1 mL에 한 번 씻어.
- 설치 미디어를 사용 하 여 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다. 하룻밤 사이 치료 하자.
- 매니큐어와 슬라이드를 밀봉 하 고 1 시간 동안 건조 공기.
- 60 x confocal 현미경 이미지 / 1.42 숫자 조리개 기름 침수 렌즈 같은 레이저 방사를 사용 하 여 각 샘플에 대 한.
- 필요한 경우 데이터를 분석, 밝기 및 대비 모든 샘플에 대 한 동일한 선형 조정을 사용 하 여 조정을 합니다.
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Representative Results
이 프로토콜 배포 및 colocalization는 RLRs 사이 연구에 적용 된 (장비-어 MDA-5) 및 JUNV에 감염 된 세포에 dsRNA. 그림 1 과 그림 2에서 같이, dsRNA의 축적 바이러스 감염 진행으로 시간이 지남에 따라 증가 합니다. MDA-5 (그림 1) 및 장비를 집중-(그림 2) 신호는 NP의 dsRNA punctate 구조와 colocalized 발견 했다.
그림 1: dsRNA와 JUNV NP 형성과 MDA-5의 분포의 시간 과정. JUNV 감염 및 모의 감염 A549 세포 고정, 스테인드 되었고 24, 36, 및 48 시간 게시물 감염 (HPI) 프로토콜에 따라 몇 군데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: dsRNA와 JUNV NP 형성 및 장비-I. 분포의 시간 과정 JUNV 감염 및 모의 감염 A549 세포 고정, 스테인드 되었고 24, 36, 48 HPI에서 프로토콜에 따라 몇 군데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
긍정적인 감 RNA 바이러스 및 dsDNA 바이러스, dsRNA J2 안티 dsRNA 널리 사용 항 체로 쉽게 검색 됩니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 동일한 항 체2를 사용 하 여 감지 수준 이하로 낮은 생산 하는으로 추정 된다. 따라서, 바이러스 성 RNA 및 PRR 상호 작용의 여러 측면 크게 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 명확 하지 않다. 우리는 dsRNA J2 항 체를 사용 하 여 arenavirus 감염에 대 한 얼룩 하려고 했지만 형광 신호 모의 감염에 비해 미분 가능 했다. Mab 9D 5, 원래 팬 엔테로바이러스 검색에 사용 되는 dsRNA에 대 한 구체적이 고 J2 항 체5보다 더 중요 한 것을 발견 되었다. 이 항 체는 부정적인 감 RNA 바이러스 감염, 프로토 타입 arenavirus 림프 choriomeningitis 바이러스5,,614를 포함 하 여 동안 바이러스 성 dsRNA를 검출 하기 위하여 성공적으로 이용 되었다. 따라서, 우리는 공동 dsRNA 바이러스 NP, 더욱 그들의 배급 및 arenavirus 감염 시 개별 셀에 상호 작용을 이해 하는 호흡기의 존재에 대 한 얼룩 Mab 9D 5를 사용 합니다.
세포 구조를 유지 하는 데 사용할 수 있는 여러 종류의 고정 방식이 있습니다. 반면 단백질, 계기에 의해 MeOH와 고정 역할 paraformaldehyde 및 포 르 말린 crosslinks 단백질. MeOH는 알데하이드 세포에서 핵 산을 보존에 보다 더 효과적이 고 낮은 배경 immunostaining를 제공 한다. 메탄올 또한 세포에서 지질을 제거 하 고 따라서 permeabilizes 같은 시간15에서 세포 막. 이 프로토콜에서 셀 차가운 MeOH를 사용 하 여 고정 됩니다. 다른 고정 방법 또한 4 %paraformaldehyde, 포 르 말린, 메탄올, 뒤 paraformaldehyde와 메탄올 paraformaldehyde 뒤 샘플을 해결을 포함 하 여, 시도 했다. 그러나, paraformaldehyde 또는 포 르 말린을 사용 하는 높은 기저 수준의 일반적인 얼룩 모의 감염 세포에서 관찰 되었다. 최적의 고정 방법은 감도 및 특이성의 결과 기반으로-20 ° C에서 MeOH와 고정 합니다. 1 차적인 항 체 얼룩이 지기, 전에 BSA는 3%, 5 %BSA 1 시간 30 분 동안 10% 또는 5% 염소 혈 청 샘플 차단 시험 되었다, 하지만 모든 결과 아닌 특정 배경 얼룩. 최상의 결과 단계를 차단 하 고 항 체 희석 3 %BSA 사용 하 여 직접 없이 달성 했다. 배경 신호를 최소화 하는 중요 한 단계는 PBS 그리고 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol 고정 후 씻어. 자동 판매기에 대 한 준비에 의해 항 체 희석 상용 9D 5 직접 사용, 동안 3 %BSA 항 체의 1:2 희석도 잘 됐 어. DsRNA 신호는 약한 경우, 항 체는 희석 하지 않고 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 arenavirus 감염에 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용을 공부 하 활용할 수 있습니다. 이 방법론은 BSL-2 환경에서 개발 되었다, 하는 동안 여기에 설명 된 메탄올 고정 arenavirus의 완전 한 비활성화 수 있습니다. 따라서, 동일한 프로토콜 BSL-4 시설에 높게 병원 성 arenaviruses (LASV, JUNV 및 MACV)에 대 한 이미징 연구에 적용할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 RNA 바이러스에 대 한 연구에이 프로토콜을 적용 하입니다. 최적의 결과 얻기 위해 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 UTMB 이미징 핵심 시설과 Maxim Ivannikov 현미경 지원에 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 공중 보건 서비스에 의해 지원 되었다 RO1AI093445 및 RO1AI129198 및 수 여에 SP, UTMB 지 펀드 P84373 채널, T32 AI007526 그들을 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
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