Summary
Double-strandet RNA produsert under RNA-virus replikering kan bli gjenkjent av mønster anerkjennelse reseptorer å indusere en medfødte immunforsvaret. Negative-sense RNA virus, samspillet mellom lavt nivå dsRNA og PRRs er fortsatt uklart. Vi har utviklet en AC confocal mikroskopi metode for å visualisere arenavirus dsRNA og PRR i individuelle celler.
Abstract
Double-strandet (ds) RNA er produsert som en replicative mellomliggende under RNA-virusinfeksjon. Anerkjennelse av dsRNA av verten mønster anerkjennelse reseptorer (PRRs) som retinsyre (RIGG-jeg) som reseptorer (RLRs) RIGG-jeg og melanom differensiering-assosiert protein 5 (MDA-5) fører til induksjon av medfødte immunforsvaret. Dannelse og intracellulær distribusjon av dsRNA i positiv-følelse RNA-virusinfeksjon har vært godt preget av mikroskopi. Mange negative-sense RNA virus, inkludert noen arenaviruses, utløse medfødte immunforsvaret under infeksjon. Imidlertid, negativ-sense RNA virus ble antatt å produsere lave nivåer av dsRNA, som hindrer imaging studier av PRR anerkjennelse av viral dsRNA. I tillegg må infeksjon eksperimenter med svært patogene arenaviruses utføres i høy containment biosikkerhet nivå anlegg (BSL-4). Samspillet mellom viral RNA og PRRs for svært patogene RNA-virus er i hovedsak ukjent på grunn av de ekstra tekniske utfordringene det forskning nød å ansikt i BSL-4 anlegg. Nylig har funnet et monoklonalt antistoff (Mab) (klone 9 d 5) opprinnelig brukt for pan-enterovirus gjenkjenning spesielt oppdage dsRNA med en høyere følsomhet enn tradisjonelle J2 eller K1 anti-dsRNA antistoffer. Her, ved å utnytte 9 d 5 antistoff, beskriver vi en AC confocal mikroskopi protokoll som har vært brukt med hell å visualisere dsRNA, viral protein og PRR samtidig i enkeltceller infisert av arenavirus. Protokollen er også egnet for imaging studier av dsRNA og PRR distribusjon i sykdomsfremkallende arenavirus infiserte celler i BSL4 fasiliteter.
Introduction
Det første trinnet av induksjon av medfødte immunforsvaret er vert anerkjennelse av double-strandet (ds) RNA av mønster anerkjennelse receptors (PRRs) som retinsyre (RIGG-jeg) som reseptorer (RLRs) RIGG-jeg og melanom differensiering-assosiert protein 5 (MDA-5)1. For positiv-følelse RNA virus, kan dsRNA vanligvis lett oppdages ved hjelp av J2 eller K1 anti-dsRNA monoklonale antistoffer (Mab)2. Samspillet mellom dsRNA og PRRs i positiv-strand RNA-virus, som picornavirus, har vært preget med AC confocal mikroskopi3. Men for negative-følelse RNA-virus, har visualisering og karakterisering av PRR og dsRNA samspill blitt hindret av mangelen på sensitive antistoffer mot dsRNA. RNA fluorescerende i situ hybridisering (fisk) er aktivert på visualisering av viral RNA og PRRs4. Likevel fisk metodene krever kunnskap om målet RNA sekvens og kanskje ikke er kompatibelt med PRR co flekker. Nylig 9 d 5 Mab, som opprinnelig ble utviklet for diagnostisering av pan-enterovirus, ble funnet å være mer sensitive enn det J2 Mab og kan lett oppdage dsRNA i negativ forstand RNA-virus infeksjon5,6. Dermed er Mab 9 d 5 en ny og nyttig verktøy for å studere viral replikasjon og samspillet mellom PRR og viral RNA for negative-følelse RNA-virus.
Arenaviruses er en enkelt-strandet, negativ-følelse RNA-virus, som inkluderer flere human patogener, som Lassa virus (LASV), ved Junín virus (JUNV) og Machupo virus (MACV), som kan forårsake alvorlige hemoragisk feber sykdommer i mennesker7. Kliniske data fra alvorlig og dødelig tilfeller av argentinske hemoragisk feber av den nye verden arenavirus JUNV utstilling usedvanlig høye nivåer av serum IFN-α8,9. Vi har vist at den patogene NW-arenaviruses (JUNV og MACV), men ikke den patogene gammeldags arenavirus, LASV, induserer en type jeg interferon (IFN) respons i menneskelige monocytt-avledet dendrittiske celler10. Videre RIGG-jeg er en av sensorene formidling skriver jeg IFN svaret i JUNV-infiserte celler11. Vi fant også at protein kinase R (PKR) reseptoren, som er tradisjonelt kjent for dsRNA anerkjennelse, aktiveres i patogene NW arenavirus infeksjon12. For ytterligere å forstå mekanismen av virus-spesifikk IFN reaksjon under arenavirus infeksjon, har vi som mål å utvikle en protokoll for å visualisere samspillet mellom viral dsRNA og de cytoplasmatiske PRRs.
Infeksjon eksperimenter med patogene JUNV, MACV og LASV må utføres i biosikkerhet nivå 4 (BSL-4) fasiliteter. Dermed i tillegg antagelig lavt nivå av dsRNA dannet i arenavirus infeksjon, er møte kravene biosikkerhet en annen teknikk utfordring når tenkelig studier for disse svært patogene virus. Ved å benytte de 9 d 5 antistoff og Candid1 # vaksine påkjenningen av JUNV, en AC confocal mikroskopi-basert protokoll er beskrevet i denne rapporten, som har vært brukt med hell å visualisere dsRNA, viral protein og PRR samtidig i celler som er infisert av arenavirus i BSL2 labs. Protokollen er også egnet for visualisering av intracellulær distribusjon av dsRNA og PRR under sykdomsfremkallende arenavirus infeksjon i BSL4 fasiliteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av A549 celler og JUNV infeksjon
- Frø 2 x 105 menneskelige lunge A549 epitelceller på poly-D-lysine (PDL) belagt glass coverslips i 12-vel plater på 24 timer før infeksjon.
- Forberede dele 150 mL JUNV13 på en multiplikasjon av infeksjon (MOI) av 1.0 plaque danner enhet per celle fortynnet i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) media med 2% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin og streptomycin (P/S ).
- Fjern medier fra cellekultur. Legg virus inoculum på hver godt som inneholder dekkglassvæske og ruge 1.5 h på 37 ° C. Riste platene hvert 15 min.
- Fjerne det virus inoculum, legge til 1 mL av DMEM med 5% FBS og 1% P/S. ruge platen ved 37 ° C i ønsket tidspunkt.
2. fiksering og immunostai-
- Sug opp media. Skyll cellene ved å legge til 1 mL av fosfat bufret saltvann (PBS) med kalsium og magnesium i hver brønn.
- Fjerne PBS. Legg 1 mL av metanol (MeOH) før kjølt på 20 ° C og ruge 20 ° C eller tørris i 15 min.
- Fjern MeOH.
- Tilsett 1 mL av PBS hver brønn, og vask samples ved 4 ° C med milde rocking for 5 min. Gjenta vask for totalt 4 ganger.
- Vask fast cellene i coverslips i 1 mL av 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol i 5 minutter ved 4 ° C, med milde rocking.
- Tilsett 1 mL av PBS hver brønn. Vask eksempler på 4 ° C i 5 min med milde rocking. Gjenta trinnet vask for totalt 4 ganger.
- For å finne dsRNA og MDA5, ruge prøver i 200 mL av primære antistoffer fortynnet i 3% bovin serum albumin (BSA). Fortynne anti-dsRNA 9 d 5 antistoffer på en 1:2 fortynning og fortynne anti-MDA-5 antistoffer på 1:250. Inkuber med milde rocking på 4 ° C over natten.
- Fjerne primære antistoffer og vask hver med 1 mL av PBS i 5 min med milde rocking på RT. Gjenta denne vask fire ganger.
- Legg til 200 mL av sekundær antistoffer (1:2, 000 fortynning) fortynnet i 3% BSA og ruge på RT 1t.
- Fjerne sekundære antistoffer og vask hver med 1 mL av PBS i 5 min med milde rocking på RT. Gjenta denne vask fire ganger.
- Å oppdage JUNV nucleoprotein (NP) og RIGG-jeg, til 200 mL av konjugert antistoffer fortynnet i 3% BSA. Fortynne konjugert anti-JUNV NP (AG-12) på 1:1,000 og ruge prøver for 2t på RT med milde rocking. Fortynne konjugert anti-RIG-jeg antistoffer på 1:500 og ruge på 4 ° C over natten med milde rocking.
- Fjerne konjugert antistoffer og vask hver med 1 mL av PBS i 5 min med milde rocking på RT. Gjenta denne vask fire ganger.
- Counterstain coverslips med DAPI (1:1, 000) for 3 min med milde rocking på RT.
- Vask coverslips 3 ganger, hver gang etter 5 min i 1 mL av 0,5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol med milde rocking på RT.
- Vaske to ganger i 1 mL av PBS i 5 min hver gang med milde rocking på RT.
- Vask en gang i 1 mL av ddH2O for 1 min på RT, rocking forsiktig.
- Montere coverslips på glass lysbilder med monterer medier. La kur over natten.
- Seal lysbildene med neglelakk og lufttørke 1t.
- Bildet på AC confocal mikroskop med 60 x / 1,42 numeriske olje nedsenking blenderåpning bruker samme laser utslippene for hvert utvalg.
- Når du analyserer dataene, om nødvendig, lage tilpasningene for lysstyrke og kontrast med den samme lineær justeringen for alle prøvene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen ble brukt til å studere distribusjon og colocalization mellom RLRs (RIGG-jeg og MDA-5) og dsRNA i JUNV-infiserte celler. Som vist i figur 1 og figur 2, øker akkumulering av dsRNA over tid som virusinfeksjon pågår. Konsentrert MDA-5 (figur 1) og RIGG-jeg (figur 2) signaler fant colocalized med vises punctate strukturer av NP og dsRNA.
Figur 1: gang løpet av dsRNA og JUNV NP dannelse og distribusjon av MDA-5. JUNV-infiserte og uekte-infiserte A549 celler var fast, beiset og fotografert i henhold til protokollen på 24, 36 og 48 timer innlegget infeksjon (HPI). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: gang løpet av dsRNA og JUNV NP dannelse og distribusjon av RIGG-I. JUNV-infiserte og uekte-infiserte A549 celler var fast, beiset og fotografert i henhold til protokollen på 24, 36 og 48 HPI. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Positiv-følelse RNA virus og dsDNA virus, blir dsRNA lett funnet med brukte J2 anti-dsRNA antistoffer. Imidlertid antas negativ-sense RNA virus å produsere dsRNA på et lavt eller under gjenkjenning nivå bruker den samme antistoff2. Dermed er mange aspekter av viral RNA og PRR samspill hovedsakelig uklart negative-sense RNA virus. Vi forsøkte å flekk for dsRNA i arenavirus infeksjon med J2 antistoffer men fluorescens signalene var ikke deriverbare sammenlignet med uekte infeksjonen. Mab 9 d 5, opprinnelig brukt for påvisning av pan-enterovirus, ble funnet for å være spesifikke for dsRNA og mer følsom enn J2 antistoff5. Denne antistoff har vært brukt med hell å oppdage viral dsRNA under negativ-sense RNA-virusinfeksjon, inkludert den prototype arenavirus lymfatisk choriomeningitis virus5,6,14. Følgelig, vi brukte Mab 9 d 5 CO stain etter dsRNA, viral NP og PRRs til videre forstå deres distribusjon og samhandling i enkeltceller under arenavirus infeksjon.
Det er flere fiksering metoder som kan brukes å bevare cellestruktur. Fiksering med MeOH handlinger ved å fremskynde proteiner, mens paraformaldehyde og formalin krysskoblinger proteiner. MeOH er mer effektiv enn aldehyder på spare nucleic syrer i celler og gir lave bakgrunn immunostaining. Metanol fjerner også lipider fra celler og dermed permeabilizes cellemembraner på samme tid15. I denne protokollen, er cellene løst ved hjelp av iskalde MeOH. Andre fiksering metoder var også forsøkt, inkludert reparerer prøver med 4% paraformaldehyde, formalin, paraformaldehyde etterfulgt av metanol og metanol etterfulgt av paraformaldehyde. Men ble høy basale nivå uspesifisert flekker observert i uekte-infiserte celler når paraformaldehyde eller formell ble brukt. Den optimale fiksering metoden er fiksering med MeOH på 20 ° C basert på sensitivitet og spesifisitet av resultatene. Før primære antistoff flekker, var eksempel blokkerer med 3% BSA, 5% BSA og 10% eller 5% geit serum i 30 minutter til 1 time testet, men alle resulterte i ikke-spesifikk, bakgrunn flekker. De beste resultatene ble oppnådd uten sperring trinn og direkte med 3% BSA i antistoff fortynning. T-Octylphenoxypolyethoxyethanol vasker etter fiksering kritiske trinnene i minimere bakgrunn signalene er PBS. Mens kommersielt tilgjengelig 9 d 5 antistoff er utvannet av vender og klar for direkte bruk, en 1:2 fortynning av antistoffer med 3% BSA også jobbet godt. I tilfelle at dsRNA signalet er svakt, kan antistoffer brukes uten fortynning.
Denne protokollen kan benyttes for å studere samspillet mellom dsRNA og PRRs i arenavirus infeksjon. Mens denne metoden ble utviklet i et BSL-2 miljø, kan metanol fiksering beskrevet her fullstendig inaktivering av arenavirus. Derfor kan den samme protokollen brukes tenkelig studie for svært patogene arenaviruses (dvs. LASV, JUNV og MACV) i BSL-4 anlegg. Det er også mulig å bruke denne protokollen til studier på andre RNA-virus. For å oppnå optimale resultater, kan en endring av protokollen være nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke UTMB imaging kjernen anlegg og Maxim Ivannikov for mikroskop hjelp.
Dette arbeidet ble støttet av helsevesenet gi RO1AI093445 og RO1AI129198 tildelt til SP, UTMB engasjement fondet P84373 på lm og T32 AI007526 EM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
