Summary
二本鎖 RNA ウイルス RNA の複製中に生産は、生来の免疫応答を誘導するパターン認識受容体によって認識できます。否定的な感覚の RNA のウイルスの低レベルの dsRNA と PRRs の相互作用は不明します。アレナ ウイルス科 dsRNA と個々 の細胞における PRR を視覚化する共焦点顕微鏡法を行った。
Abstract
二本鎖 (ds) RNA が RNA ウイルス感染複製中間体として生成されます。レチノイン酸などには、[ホストのパターン認識の受容器 (PRRs) による dsRNA の認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5) は、生得の免疫反応の誘導に 。形成と肯定的な感覚の RNA ウイルス感染における dsRNA の細胞内分布をよく顕微鏡によって特徴づけられています。多く否定的な感覚の RNA のウイルスなどいくつかのアレナは、感染時に生得の免疫反応をトリガーします。しかし、否定的な感覚の RNA のウイルスは dsRNA ウイルス dsRNA の PRR 認識のイメージング研究を妨げるの低レベルを生成すると考えられました。さらに、高い封じ込めバイオ セーフティ レベル設備 (BSL-4) で高病原性アレナでの感染実験を行う必要があります。高病原性 RNA ウイルスのウイルスの RNA と PRRs の相互作用は主研究者は BSL 4 施設に直面する必要がある追加の技術的な課題のため知られています。最近では、もともとパン エンテロ ウイルス検出用モノクローナル抗体 (Mab) (クローン 9 5) は特に伝統的な J2 または K1 アンチ dsRNA の抗体よりも高い感度で dsRNA を検出する発見されています。9 5 を用いて、抗体、dsRNA ウイルス蛋白質、アレナ ウイルスに感染した細胞で同時に PRR を視覚化するために正常に使用されている共焦点の顕微鏡検査プロトコルについて述べる。プロトコルの dsRNA の PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染細胞分布のイメージングにも適しています
Introduction
生得の免疫反応の誘導の最初のステップは二本鎖 (ds) RNA によって、パターン認識の受容器 (PRRs) レチノイン酸などの宿主認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5)1。肯定的な感覚の RNA のウイルスの dsRNA 容易に検出できる J2 または K1 アンチ dsRNA のモノクローナル抗体 (Mab)2を使用しています。DsRNA と PRRs のピコルナ ウイルスなどのプラス鎖 RNA ウイルスの相互作用は、共焦点顕微鏡3を使用して特徴づけられています。ただし、否定的な感覚 RNA ウイルス、PRR と dsRNA の相互作用の可視化とによって妨げられている dsRNA に敏感な抗体の欠如。RNA 蛍光そのままの交配 (魚) は、ウイルスの RNA と PRRs4の可視化に適用されています。それにもかかわらず、魚方法論はターゲット RNA シーケンスの知識が必要です、PRR は共同染色と互換性がない可能性があります。最近、9 5 パン エンテロ ウイルス感染症の診断のため開発された、Mab 見つかり J2 モノクローナル抗体よりも高感度が容易に否定的な感覚の RNA ウイルス感染症5,6に dsRNA を検出します。したがって、Mab 9 5 が斬新で、ウイルスの複製と PRR および否定的な感覚の RNA ウイルスのウイルスの RNA 間の相互作用を検討するときに役立ちます。
アレナは、単一座礁させた、否定的な感覚の RNA ウイルス、ラッサ ウイルス (LASV)、フニン ウイルス (JUNV)、Machupo ウイルス (MACV)、人間7に重度の出血熱の病気を引き起こすなど、いくつかの人間の病原体を含む家族です。JUNV 新世界アレナ ウイルスによって引き起こされるアルゼンチン出血熱の重症や死亡するケースから臨床データを表わす血清 IFN α8,9の異常に高いレベル。病原性の NW アレナ (JUNV、MACV) がない、病原性旧世界アレナ ウイルス科、LASV、型を誘発することを示した私10ひと単球由来樹状細胞におけるインターフェロン (IFN) 応答します。さらに、リグ-私は、センサーの一つを仲介する I 型 IFN の応答 JUNV 感染細胞11。DsRNA 認識のため伝統的に知られている蛋白質キナーゼ (PKR) R 受容体が病原性 NW アレナ ウイルス感染12でアクティブであることが分かった。アレナ ウイルス感染ウイルスに特有な IFN 応答のメカニズムをさらに理解するには、dsRNA ウイルスと細胞質の PRRs の相互作用を視覚化するためのプロトコルの開発を目的とします。
病原性 JUNV、MACV LASV と感染実験は、バイオ セーフティにおける行いますレベル 4 (BSL-4) 施設。したがって、アレナ ウイルス感染で形成された dsRNA のおそらく低レベル、に加えてバイオセイフティ要件を満たす別技術課題ですこれらの高病原性ウイルスのイメージングを行う際。9 5 を用いた抗体と JUNV の Candid1 # ワクチン株、共焦点顕微鏡ベースのプロトコルは dsRNA ウイルス蛋白質、PRR のアレナ ウイルスによる感染細胞で同時に視覚化に正常に使用されているこのレポートに記載されています。BSL2 実験室。プロトコルは、dsRNA と PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染時に細胞内に分布の可視化に適しています。
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Protocol
1 作成 A549 細胞と JUNV 感染症
- ポリ-D-リジン (PDL) に種子 2 x 10 の5ひと肺上皮 A549 細胞は、感染前に 24 時間で 12 ウェルのプレートにガラス coverslips をコーティングしました。
- 1.0 プラーク ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 培地 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリンとストレプトマイシン (P/S で希釈したセルごとユニットを形成 JUNV13感染症 (MOI) の乗算での 150 mL の因数を準備します。).
- 細胞培養からメディアを削除します。各上も含むウイルスの接種材料を追加し、37 ° C で 1.5 時間インキュベートプレート 15 分毎を振る。
- ウイルスの接種材料を削除 5 %fbs と 1% P DMEM の 1 mL を追加/s. 希望の時間ポイントの 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
2. 固定・染色
- メディアを吸い出しなさい。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) カルシウムとマグネシウム各ウェルに補足の 1 mL を追加することによって、細胞をすすいでください。
- PBS を削除します。-20 ° C であらかじめ冷やして 1 mL のメタノール (メタノール) を追加し、-20 ° c またはドライアイス 15 分間インキュベートします。
- メタノールを削除します。
- 各ウェルに 1 mL の PBS を追加し、4 ° C で 5 分間穏やかな揺動洗浄サンプルは合計 4 回の洗浄を繰り返します。
- 穏やかなロッキングの 4 ° C で 5 分間 0.2% t octylphenoxypolyethoxyethanol 1 ml coverslips に固定セルを洗浄します。
- 1 mL の PBS を各ウェルに加えます。穏やかな揺動と 5 分のための 4 ° C でサンプルを洗います。合計 4 回の洗浄のステップを繰り返します。
- DsRNA と MDA5 を検出するためには、3% ウシ血清アルブミン (BSA) で希釈した一次抗体の 200 mL のサンプルをインキュベートします。1:2 希釈反 dsRNA 9 5 抗体を希釈し、抗 MDA 5 抗体を希釈します。穏やかなロッキング 4 ° C で一晩インキュベートします。
- 一次抗体を外し、それぞれ洗浄穏やかな揺動した繰り返しこの洗浄 4 回以上分の 1 mL の PBS とも。
- 3 %bsa で希釈した二次抗体 (1:2, 000 希釈) の 200 mL を追加し、RT で 1 時間インキュベートします。
- 二次抗体を外し、それぞれ洗浄穏やかな揺動した繰り返しこの洗浄 4 回以上分の 1 mL の PBS とも。
- JUNV 核タンパク質 (NP) を検出してリグ-、追加 3 %bsa の希釈に活用された抗体の 200 mL。縮尺で共役反 JUNV NP (AG-12) を希釈し、穏やかな揺動で常温 2 時間サンプルをインキュベートします。共役アンチ-RIG-I 抗体 1: 500 でを希釈し、4 ° C 穏やかな揺動と一晩で孵化させなさい。
- 活用された抗体を外し、それぞれ洗浄穏やかな揺動した繰り返しこの洗浄 4 回以上分の 1 mL の PBS とも。
- 室温穏やかな揺動と 3 分のために DAPI (1:1, 000) coverslips を counterstain します。
- 洗って、coverslips 3 回 0.5 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol 室温穏やかなロッキングの 1 mL で 5 分間ずつ
- 室温穏やかな揺動をするたびに 5 分の 1 mL の PBS で 2 回洗う
- DdH2O RT、穏やかに揺れるで 1 分間の 1 つの mL で一度洗います。
- メディアをマウントを使用してスライド ガラスに coverslips をマウントします。夜間治療をしましょう。
- マニキュアとスライドを密封し、空気乾燥 1 時間。
- 60 x と共焦点顕微鏡画像/1.42 開口油侵のレンズの各サンプルに対して同じレーザー排出量を使用して。
- 必要に応じて、データの分析している場合の明るさとコントラストのすべてのサンプルの同じ線形調整を使用して調整を行います。
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Representative Results
このプロトコルは、配布し、RLRs の間の共存の研究に応用された (リグ-私は、MDA 5) と JUNV 感染細胞における dsRNA。図 1と図 2のように、ウイルス感染の進行につれて dsRNA の蓄積が増加します。MDA-5 (図 1) とリグを集中-(図 2) 信号は、NP、dsRNA の点状の構造の結果発見されました。
図 1: dsRNA と JUNV NP 形成と MDA 5 の分布の経時します。JUNV 感染し、モック感染 A549 細胞固定、染色、24、36、48 時間ポスト感染 (HPI) でプロトコルに従ってイメージングします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: リグ I. の分布と JUNV NP 形成 dsRNA の時間コースJUNV 感染し、モック感染 A549 細胞固定、ステンド グラス、24、36、48 時間でプロトコルに従ってイメージを作成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
肯定的な感覚の RNA のウイルスは、dsDNA ウイルス dsRNA は J2 アンチ dsRNA の広く使用される抗体を容易に検出されます。ただし、否定的な感覚の RNA のウイルスは、低または2同じ抗体を使用して検出のレベルの下の dsRNA を生成すると考えられています。したがって、ウイルスの RNA と PRR の相互作用の多くの側面は否定的な感覚の RNA のウイルスの明確な主ではありません。J2 抗体を用いたアレナ ウイルス感染における dsRNA のステインを試みたなかった蛍光信号微分可能モックの感染症に比べています。DsRNA の特定と J2 抗体5より敏感に Mab パン エンテロ ウイルス検出は、もともと 9 5 が見つかりました。この抗体は陰性意味プロトタイプ アレナ ウイルス科リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス5,6,14を含む RNA ウイルスに感染中に dsRNA のウイルスを検出する正常に使用されています。したがって、共同 dsRNA ウイルス NP、さらにその分布とアレナ ウイルス感染時に細胞の相互作用を理解する PRRs の存在を染色する Mab 9 5 を使用しました。
細胞の構造を維持するために使用することができます複数の固定方法があります。メタノール固定行為、蛋白質を沈殿させるに対しパラホルムアルデヒドとホルマリンの架橋タンパク質。メタノールは細胞の核酸を保全アルデヒドよりも効果的、低バック グラウンド免疫染色を提供しています。メタノールはまた細胞から脂質を削除し、こうして同じ時間15で細胞膜を permeabilizes します。このプロトコルでセルは氷冷メタノールを使用して固定されます。他の固定方法が 4% パラホルムアルデヒド、ホルマリン、メタノール、続いてパラホルムアルデヒド パラホルムアルデヒド続いてメタノールとサンプルの修正など、また試されました。ただし、高い基底レベル非特異染色と、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンが使用されたときに、モック感染細胞で観察された.最適な固定方法は、感度と特異度の結果に基づいて、-20 ° C でメタノールで固定です。前に一次抗体の汚損、サンプル ブロック 3 %bsa、5 %bsa を 1 時間に 30 分間、10% または 5% ヤギ血清とはテスト、すべてをもたらした非固有バック グラウンド染色しますが、。最良の結果は、ブロッキングと直接抗体希釈で 3 %bsa を使用せず達成されました。バック グラウンド信号を最小限に抑えることで重要な手順は、PBS と t Octylphenoxypolyethoxyethanol を固定後洗います。一方、抗体を希釈するには、ベンダーとの準備ができて、市販の 9 5 直接使用、3 %bsa を用いた抗体の 1:2 希釈もうまくいった。DsRNA の信号が弱い場合、抗体を希釈せず使用できます。
このプロトコルは、アレナ ウイルス感染における dsRNA と PRRs の相互作用の研究に利用できます。この方法論は、BSL 2 環境で開発された、記載メタノール固定アレナ ウイルスの完全な不活化が可能になります。したがって、同じプロトコルは、高病原性のアレナ (すなわち、LASV、JUNV、MACV) BSL 4 施設でのイメージング研究に適用できます。また、他の RNA ウイルスに関する研究をこのプロトコルを適用することが可能です。最適な結果を達成するために、プロトコルの変更が必要かもしれません。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
顕微鏡支援のための UTMB イメージングの中核施設とマキシム ・ イワニコフに感謝したいと思います。
この作品は、公衆衛生サービスによって支えられた RO1AI093445 と RO1AI129198 受賞に SP、ch、UTMB コミットメント基金 P84373 と EM を T32 AI007526 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
