Summary
Мы представляем оптимизированную локальную процедуру выброса с использованием стеклянной микропипетты и быстрого метода визуализации двухфотонного гиперстога, который позволяет точно измерять изменения диаметра капилляров и исследует его регулирование в трех измерениях.
Abstract
Поддержание нормальной функции мозга требует достаточного и эффективного снабжения кислородом и питанием сложной сетью сосудов. Однако регуляция мозгового кровотока (CBF) понимается неполно, особенно на уровне капилляров. Двухфотоническая микроскопия является мощным инструментом, широко используемым для изучения CBF и его регулирования. В настоящее время эта область ограничена отсутствием в ививо двухфотонных микроскопических исследований, исследующих (1) cbF ответы в трех измерениях, (2) провел сосудистые реакции, и (3) локализованных вмешательств в сосудистой сети. Здесь мы описываем метод 3D in vivo с использованием двухфотонной микроскопии для изучения проведенных сосудистых реакций, вызванных локальным выбросом АТФ со стеклянной микропипеткой. Наш метод использует быструю и повторяющиеся гиперстек двухфотонные изображения, обеспечивающие точные измерения диаметра по максимальной интенсивности проекции полученных изображений. Кроме того, мы показываем, что этот метод также может быть использован для изучения 3D астроцитарных реакций кальция. Мы также обсуждаем преимущества и ограничения вставки стеклянной микропипетты и двухфотонного гиперстакта.
Introduction
Мозг имеет высокий уровень потребления энергии. Около 20% кислорода и 25% глюкозы, потребляемой человеческим телом, предназначены для работы мозга, в то время как мозг занимает только 2% от общей массы тела. Поддержание нормальной функции мозга требует достаточного и эффективного снабжения кислородом и питания кровотоком в сложной сети сосудов. Местная мозговая активность и мозговой кровоток (CBF) надежно связаны, в зависимости от функциональных свойств нейронов, астроцитов, перицитов, гладких мышечных клеток (СМК) и эндотелиальных клеток (ЭК)1. В последнее время первые несколько заказов капилляров, разветвляющихсяиз проникающих артериол, стали «горячей точкой» 2, показывая активную регуляцию капиллярного кровотока. Медленно проводимых сосудистой реакции (CVR) был обнаружен в этой "горячей точке" в мыши соматосенсорной коры во время как стимуляции усов и местного выброса (пыхтя) АТФ со стеклянной микро-пипеткой3.
Хотя in vivo изображений с помощью двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии широко используется для изучения нервно-сосудистых реакций в коре головного мозга, большинство исследований измеряли диаметры кровеносных сосудов и исследовали их регуляцию в двухмерная (2D) плоскость x-y. Проблемы: Во-первых, церебральные кровеносные сосуды и их охватывающие астроциты, перициты и СМК строят ветви в трех измерениях (3D). Поэтому очень важно изучить их взаимодействия в 3D. Во-вторых, даже небольшое количество дрейфа в фокусе повлияет на точное измерение как диаметров судов, так и клеточных флуоресцентных сигналов. Наконец, ССЗ быстро и далеко идущие в трех измерениях. 3D-сканирование объема оптимально для обнаружения СВРс и открытия их механизмов. Мы внедрили цель пьезо мотора в двухфотонный микроскоп для изучения соматосенсорной коры мыши in vivo, что позволило точно измерить диаметр максимальной интенсивности проекций полученных изображений.
Стеклянные микро-пипетки часто используются для исследования мозга in vivo, например, для навалом загрузки органических красителей4, записи EEGs5 и для зажима патча6. Тем не менее, ограничения остаются. Как правило, кончик стеклянной микро-пипетки неточно помещается, или микро-пипетка не используется для местных вмешательств. Здесь мы оптимизировали процедуру вставки микропипетты и локального выброса.
Кроме того, сочетание трехфотонной микроскопии и генетически закодированных флуоресцентных индикаторов дает беспрецедентную возможность исследовать нервно-сосудистые связи в 3D сфере. В этом исследовании мы воспользовались этим и ввели вирусные векторы, несущие астроцитные специфические генетически закодированные индикаторы кальция в соматосенсорную кору мыши. Астроциты, а также диаметры судов были изображены одновременно путем объединения различных флуоресцентных маркеров.
В целом, мы представляем оптимизированный метод локального выброса (пыхтя) стеклянным микропипеткой и быстрой двухфотонной гиперстековой визуализацией, которая позволяет точно измерять изменения диаметра капилляров. Кроме того, наш метод предоставляет новый инструмент для одновременного изучения 3D-профилей ответов Ca2 в ответах астроцитов и сосудистого диаметра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, касающиеся животных, были одобрены Датским национальным комитетом по этике в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Конвенции Европейского совета по защите животных-позвоночных, используемых в экспериментальных и других научных целях и в соответствии с руководящими принципами ARRIVE. Это терминальная процедура с мышами усыплены до анестезии восстановления.
1. Предоперационная подготовка
- Очистите хирургический стол и всю прилегающую территорию с 70% этанола. Тщательно очистить и высушить хирургические инструменты перед операцией.
- Анестезия NG2DsRed мышь (Tg (Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; оба пола; 4-8 месяцев; 4-8 месяцев) путем перитонеальной инъекции кетамина и ксилазина (60 мг/кг 10 мг/кг), растворенных в стерилизованной воде, рН 7,4. Вводят дополнительные дозы кетамина (30 мг/кг) каждые 25 мин до завершения хирургической процедуры. Регулярно проверяйте рефлексы хвоста и ног, чтобы проверить глубину анестезии.
- Вводят солин подкожно в четырех различных местах на задней части мыши в общей сумме 1 мл для предотвращения обезвоживания во время эксперимента. Чтобы защитить глаза от высыхания, нанесите смазку для глаз. Поддерживайте температуру тела при температуре 37 градусов по Цельсию с помощью ректального датчика температуры и нагревательного одеяла.
2. Хирургическая процедура
- Трахеотомия
- Поместите мышь на спину. Вводят 0,04 мл 0,5% лидокаина подкожно под запланированным разрезом и ждите 2 мин. Сделайте 10-мм разрез над грудной костью (манубриум). Разделите подчелюстные железы и стернотиреоидные мышцы, а затем разоблачить трахею.
- Сделайте трахеостомию между двумя кольцами трахеи ножницами. Вставьте в трахею небольшую металлическую трубку длиной 16,2 мм и диаметром 1 мм. Подключите трубку к механическому вентилятору и капрофуму для мониторинга конечных CO2 (рисунок1А).
- Вставка катетера
- Вводят 0,5% лидокаина (0,04 мл) подкожно под запланированным разрезом и ждите 2 мин.
- Используя тонкие наконечникщины мягко отделить артерию от вены. Остановите поток крови вверх по течению с микрососудистым зажимом. Сужение кровотока вниз по течению с 10-0 нейлоновый шов ligating обоих кровеносных сосудов.
- Используйте микро-рассекающие ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в артерии и вены. Вставьте пластиковые катетеры в оба кровеносных сосуда. Защищайте катетеры, затягивая швы (8-0 или 10-0 нейлоновых швов, зависящих от размера судна) без ущерба для люменов катетера. Удалить микрососудистый зажим и закрыть кожу.
- Мониторинг артериального давления через артериальный катетер. Измерение уровня газов крови в образцах артериальной крови (50 л) до ипосле каждого эксперимента (нормальные значения: PO 2, 90-120 мм рт. ст.; pCO2,35-40 мм рт.; рН, 7,25-7,45) с использованием анализатора газа крови. Используйте катетер вены для инфузии флуоресцеина и анестезии.
- Краниотомия
- Сбрить мех с головы мыши между ушами. Вводят 0,04 мл 0,5% лидокаина подкожно под запланированным разрезом и ждите 2 мин.
- Протрите череп с помощью 10% раствора железа хлорида, чтобы удалить периостеум. Тщательно промыть череп сольным раствором. Клей металлической головной бар к черепу с cyanoacrylate клей и активатор(Рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Металлическая головная прутья имеет длину 75 мм и ширину 13,5 мм, а в центре - круглое отверстие диаметром 5 мм. - Просверлить краниотомии диаметром 4 мм, по центру на 0,5 мм позади и 3 мм справа от брегмы над правой сенсорной головной коры ствола. Удалите дюру с тонкой наконечником расширителя сосуда.
- Обложка открытой коры с 0,75% агарозный гель, растворенный в искусственной спинномозговой жидкости (aCSF; рН 7,4) и охлажденных до 35 градусов по Цельсию. Обложка 80-90% краниотомии со стеклянным покрытием под углом 10-15 "к металлической головке бар (Рисунок 1B), что позволяет вставки и размещения стекла микро-пипетка.
- Чтобы свести к минимуму пульсацию мозга, приклейте два угла стеклянного покрывала на металлическую головную штангу с помощью клея цианоакрилата и активатора. Применить активатор тщательно, чтобы предотвратить попадание на открытый мозг. Промыть склеенное стекло крышкой тщательно с сольным после этого.
- Выполните вставку зонда стимуляции усов. Вставьте набор изготовленных на заказ биполярных электродов (длина 8 мм и толщина 0,25 мм) в левую сторону лица, чтобы стимулировать рамус инфраорбиталис тройничного нерва контралатерального к краниотомии. Расположите катод близко к перерыву infraorbitalis, и вставьте анод в маститационные мышцы7. Выполните стимуляцию с электрическим стимулятором при интенсивности 1,5 мА на 1 мс в поездах по 2 Гц при 2 Гц.
- По завершении операции, ввести болюс 0,05 мл флуоресцеина изотиоциоцианат-декект (FITC-dextran, 4% ж / V, молекулярный вес (Mw) 50000) в бедренной вены для обозначения плазмы крови. Прекратите кетамин и переключите анестезию на непрерывный внутривенный вливание хлоралоза (17% w/v, конечная концентрация), смешанного с FITC-dextran (2% w/v, конечная концентрация) при 0,02 мл/10 г/ч. Подождите около получаса для стабилизации нового анестезируетическое состояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: И FITC-декстран, и хлоралоза растворяются в 0,9% сольнца.
3. Первый двухфотонный сеанс визуализации
- Перенос мыши на стадию коммерческого двухфотонный микроскоп(Таблицаматериалов). Под красным флуоресцентным белком (RFP, Рисунок 1С) и зеленым флуоресцентным белком (GFP, Рисунок 1С)режимы эпифлуоресцентного освещения, сфотографировать открытые коры с 5x цели. Используйте изображение RFP в качестве «карты» для вставки стеклянной микропипетки в следующем сеансе.
ПРИМЕЧАНИЕ: GFP 'карта' используется для различения вен / вен от артерий / артериологов. - Выполните двухфотонную визуализацию с помощью двухфотонного микроскопа и 25x 1.0 численной диафрагмы (NA) цели погружения с пьезо мотором. Установите длину волн возбуждения до 900 нм. Поиск коры и следовать каждому проникающего артериола и найти его горизонтальные ветви (1-го порядка капилляров).
- Изображение проникающих артериол и их1-го порядка капилляров в покое и во время стимуляции усов площадку. Подробные параметры изображения смотрите в разделе 5.
- Отметьте места проведения капилляров1-го порядка с вазодилатацией усов во время стимуляции усов на карте RFP (рисунок1C). Места с вазодилатациями йlt;5% считаются за пределами области коры коры ствола усов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании диких мышей вместо NG2DsRed мышей в эксперименте, GFP изображение используется в качестве "карты" вместо.
4. Вставка стеклянной микропипетты
- Подготовка стеклянных микро-пипетки для пыхтя с помощью пипетки тягач (Таблица материалов). Стеклянные микропипетты имеют сопротивление 3-3,5 МЗ и конусность длиной 4,5-5 мм. Загрузите пипетку со смесью 1 мМ АТФ и 10 ММ Alexa 594, чтобы визуализировать наконечник пипетки под эпифлуоресцентной лампой и двухфотонным микроскопом.
- Установите стеклянный микропипетна на держатель зажима патча и соедините его с воздушным насосом. Установите давление насоса, удерживая до 0 пси.
- Используя красное эпифлуоресцентное освещение, сосредоточьтесь на наконечнике пипетки с 5x целью. Поместите стеклянную микропипетку в aCSF над агарозой. Отрегулируйте удерживая давление воздушного насоса до 0.2 psi. Небольшое красное облако можно наблюдать выталкивание из пипетки наконечник в aCSF. Это необходимо для предотвращения засорения во время вставки пипетки.
- Выберите одно из отмеченных мест в «карте» RFP в качестве пункта назначения. Переместите кончик пипетки к горизонтальной плоскости края стекла крышки с расстоянием 30 мкм, ориентируя к месту назначения в плоскости x-y.
- Аккуратно опустите наконечник пипетки в z-оси под крышкой стекла скольжения. Затем начните продвижение стеклянной пипетки к месту назначения до 500 мкм над поверхностью мозга. Переключите фокус часто между краем стекла крышки, кончиком pipette и поверхностью мозга, убеждаясь что достаточно свободно космос для двигать пипетку.
- Переключите цель на 25x. Re-центр пипетка отзыв и заранее пипетка отзыв дальше к месту назначения на RFP "карта". Держите кончик пипетки в слое агарозы.
- Когда наконечник пипетки находится на 100 мкм над поверхностью мозга, переключите режим изображения на двухфотонную микроскопию. Сосредоточьтесь на целевом месте, в котором пыхтеть. Запишите его x, yкоординаты (x 0, y0)и его глубину ниже поверхности (z0). Рассчитайте координаты точки вставкина поверхности мозга (x i, yi)следующим образом:
хх х0 q0 / загар
уя й й0
где угол между держателем пипетки и горизонтальной плоскостью. - Расположите кончик пипеткик координатам (x i, yi)на поверхности мозга. Аккуратно и медленно вставьте пипетку,пока она не достигнет (x 0, y0,z0). Если судно находится на пути пути вставки, снимите пипетку и пересчет других координат и пути вставки; или слегка повернуть сценическую пластину (как указано на рисунке 1А).
- Установите давление насоса, удерживая на уровне 0 пси и давление выброса при 10-15 пси. Слоеный АТФ на 200-400 мс в целевом месте во время двухфотонной визуализации. Отрегулируйте давление и продолжительность пыхтя для каждого пипетки и с течением времени, как это объясняется в разделе обсуждения.
5. Гиперстек двухфотон изображения
- Выполняйте эксперименты с использованием двухфотонного микроскопа и цели погружения в воду 25 x 1.0 NA с мотором пьезо. Установите длину волн возбуждения до 900 нм. Фильтр излучаемых света для сбора красного света от DsRed (перициты) / тетраметилродамина изотиоциозата-декестран (TRITC-dextran) окрашивания плазмы крови и зеленый свет от FITC-dextran (плазма крови) / GCaMP6 (GFP, астроцититарный).
- Производите стек с высоким разрешением в месте интереса, содержащий проникающий артериол, капилляр1-го порядка, капилляр2-го порядка и, возможно, соседние флуоресцентные клетки (например, перициты, астроциты). Определите объем гиперстековой визуализации, включив в нее 3D-структуру кровеносных сосудов. Общая высота каждого стека может варьироваться от 30-50 мкм, в то время как плоскость x-y примерно покрывает площадь 60 мкм х 40 мкм.
- Установите стек изображения в программном обеспечении для визуализации, который будет состоять из 8-10 плоскостей с межсамолетной дистанцией 4-5 мкм. Пьезо-моторная цель останавливается на каждом уровне на оси z, чтобы приобрести изображение каждой плоскости. Частота выборки составляет 1 с на стек и пиксельное разрешение в плоскости x-y 0.2-0.3 мкм(рисунок 2A). Одна запись обычно включает в себя 10 предварительно слоеных стеков изображений и 150 пост-слоеных стеков изображений.
6. Обработка данных
- Обработка данных с помощью специального аналитического программного обеспечения. Сгладить каждое изображение стек в одно изображение по максимальной интенсивности проекции(Рисунок 2B). Нарисуйте прямоугольную область интереса (ROI) шириной 3 мкм перпендикулярно через судно интереса(рисунок 2C).
- Чтобы свести к минимуму помехи от теней красных кровяных телец и от незначительных вибраций коры головного мозга, усреднейте прямоугольную рентабельность инвестиций, проецируя ее на одну линию, которая затем представляет средний профиль сегмента сосуда. Сделайте это для каждого изображения максимальной интенсивности.
- Участок линий профиля как 2D-изображение с x-оси, представляющих максимальную интенсивность изображений в хронологическом порядке(Рисунок 2D, верхняя панель). Используйте алгоритм активного контура (сегментация Chan-Vese), чтобынайти края судна 8,9 (указано красными кривыми; Рисунок 2 D, верхняя панель).
- Рассчитайте временной ход изменения диаметра по мере того, как разница между краями кровеносных сосудов (вертикальное расстояние между верхними и нижними красными кривыми на рисунке 2D,нижняя панель). Нормализация изменения диаметра до предварительнопывая диаметр базовых и сюжет кривых диаметра изменения с течением времени. Сделайте это для каждого рентабельности инвестиций(рисунок 2E).
- Амплитуда реакции судна определяется как самая высокая/самая низкая пиковая амплитуда после пыхтя. Задержка реакции определяется как задержка полумаксимальной амплитуды(рисунок 2G). Вручную прослеживается скелетизированная сосудистая структура, помещая узлы вдоль сосудов(рисунок 2F)и измеряя географическое расстояние между каждой рентабельностью инвестиций и проникающим артериолем. Рассчитайте скорость CVR, разделив расстояния на различия в задержке.
7. Вирусная векторная инъекция
- Для того, чтобы одновременно изучить астроцитарные реакции кальция, вводят объем вируса-вектора 0,6 л (p'ac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) в соматосенсорную кору мышей NG2DsRed, следуя стандартной процедуре стереотаксического вирусного впрыска 10.
- Через три недели астроциты в мышечной соматосенсорной коре выражают генетически закодированный индикатор кальция GCaMP6f. Следуйте вышеупомянутой хирургической процедуре и двухфотонизображению для мышей. Чтобы различать астроциты и светило сосуда, TRITC-dextran вместо FITC-dextran используется для окрашивать сосуд наятиной в красный цвет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После завершения операции мышей перевезли в двухфотонный микроскоп(рисунок 1А). Стеклянная микропипетка, содержащая 1 мМ АТЦ, была вставлена в непосредственной близости от кровяного сосуда назначения в целевом месте(рисунок 1B).
Мы выполнили гиперстек изображения, давая слойка 1 мМ АТФ(Рисунок 2A, Дополнительное видео 1). Каждый стек изображения был сплющен к одному изображению максимальной проекцией интенсивности(рисунок 2B). Прямоугольные ROIs были помещены перпендикулярно через сосуд для измерения изменения диаметра судна на ATP пыхтя(Рисунок 2C). Диаметры судов измерялись с помощью сегментации Chan-Vese(рисунок 2D). В одиночных записях слоеного, нормализованные изменения диаметра на каждой рентабельности инвестиций были наложены для сравнения реакций различных сегментов судна(рисунок 2E). Расстояние от каждой рентабельности инвестиций до проникающего артериола было рассчитано путем ручного рисования сосудистого скелета(рисунок 2F). Амплитуда и запоздалые расширение и сужение при каждой рентабельности инвестиций в одиночных записях слоеного были построены на расчетных расстояниях от ROIs до проникающего артериола(рисунок 2H-K). Вазодилатация при пыхтении, размножающейся линейно со скоростью 14,69 мкм/с (вверх по течению) и 2,8 м/с (вниз по течению), начиная с стыка1-го и2-го капилляров (рисунок2Н). Сосудосуживание также размножается линейно на 3,92 мкм /с, начиная с проникающего артериола(рисунок 2I). Максимальная амплитуда как сосудосуживающих, так и сосудосуживающих произошло в капиллярах1-го порядка (рисунок2J-K).
Кроме того, сочетание астроцитов конкретных вирусных векторных переносчиков флуоресцентных индикаторов кальция и двухфотон гиперстек изображения, астроцитарные реакции кальция на АТФ пыхтя были исследованы (Рисунок 3A, Дополнительное видео 2 ). Прямоугольные ROIs были помещены в астроцитарной соматы и процессов. АТФ индуцированный рост внутриклеточного кальция в астроцитарных процессах, но не в астроцитов сомата(Рисунок 3B).
Рисунок 1 : Диаграмма in vivo двухфотонного 3D-изображения и стеклянного микропипетля. (A) Обезопеченная мышь крепится к металлической штанге и механически проветривается. Конечный прилив CO2 контролируется капрографом. Как стимуляция усов, так и микро-пипетка, используемые для индуцирования изменений диаметра сосудов. Стеклянный держатель микропипетты установлен на сценической пластине. Бедренная артерия и вены катетеризируются для мониторинга артериального давления и газов крови, а также для наполнить анестезией и флуоресцейном, соответственно. (B) Стеклянный покрывало краниотомию под углом, который позволяет свободно движение pipette. Пыхтящий микропипетка расположен в непосредственной близости от проникающего артериола и его капилляров и содержит смесь 10 мкм Alexa 594 (красный цвет в стеклянной микро-пипетке) и 1 мМ АТФ. Двухфотон изображения является быстрое и повторяющееся 3D объем сканирования, которое включает в себя проникающий артериол и первые несколько капилляров порядка, а также соседние астроциты и перициты. (C) Показаны репрезентативные изображения красного флуоресцентного белка (RFP) и зеленого флуоресцентного белка (GFP) с использованием эпифлуоресцентного освещения. Они используются в качестве "карт" во время вставки пипетки. Красные круги отмечают места1-го порядка капилляров с вазодилатации во время стимуляции усов площадку. Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : АТФ пыхтя микро-пипеткой вызывает расширение сосуда, а затем сужение. (A) Каскад самолетов в одном репрезентативном стеке изображения включая проникающий артериол и1-й и2-й капилляры порядка. Перициты помечены красным фторофором (NG2-DsRed), а люмюна судна помечена FITC-dextran (зеленый). (B) Максимальная интенсивность проекции стека изображений. (C) Несколько уникально покрашенных зон интереса (ROIs) помещенные перпендикулярно через сосуд для того чтобы измерить диаметр сосуда. (D) Топ, представитель флуоресцентной интенсивности с течением времени на темно-синий рентабельности от панели C. Две красные кривые определяют края стенки судна. Вертикальное расстояние между двумя красными кривыми является диаметром сосуда и отображается как функция времени (внизу). (E) Нормализованный диаметр изменяется с течением времени на каждой рентабельности инвестиций в ответ на 1 мМ АТФ пыхтя. Измерения основаны на одном эксперименте. (F) Сосудистый скелет был вручную прослеживается путем размещения узлов вдоль сосудов. (G) Амплитуды расширения или сужения были определены как максимальный положительный или отрицательный сосудистый ответ, соответственно, во время записи сессии. Задержка расширений и сужений были сообщены как время до половины положительного или отрицательного максимума после пыхтя начала. (H-K) Графики показывают задержку расширения (H), задержка сужения (I), амплитуда расширения (J), и амплитуда сужения (K) всех ROIs показано в панели C по сравнению с расстоянием каждой рентабельности инвестиций от проникающий артериол. Разбитые линии представляют линейную установку проводящих реакций вверх по течению и вниз по течению. p.a.: проникающий артериол. Шкала бар: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : АТФ пыхтя микро-пипеткой индуцирует астроцитарную деятельность кальция. (A) Астроцитарные вирусные векторы, несущие флуоресцентный индикатор кальция, были введены в мышь соматосенсорной коры за три недели до экспериментальной процедуры. На рисунке показана сосуда светящаяся, помеченная TRITC-dextran (красный) и астроцитарным кальцием в зеленом цвете. (B) Множественные ROIs помещаются в астроцитарной соматы и процессов. При 1 мМ АТФ пыхтя внутриклеточный кальций увеличивался в астроцитарных процессах, но не в соматах (пунктирных коробках), где уровни кальция превышали средние плюс 1,5 х стандартное отклонение, были определены как значительные. Шкала бар: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительное видео 1: Время серии фильма сплющенный от гиперстек изображения судов в ответ на пыхтя 1 мМ АТФ. Зеленый: FITC-dextran, окрашивание просвета судна. Красный: NG2DsRed, окрашивание перицитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Дополнительное видео 2: Время серии фильма сплющенный от гиперстек изображения астроцитарного кальция в ответ на пыхтя 1 мМ АТФ. Зеленый: астроцитарный кальций. Красный: TRITC-dextran, окрашивающий люмь сосуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одной из проблем для сосудистых исследований является точное измерение диаметров сосудов. Метод, который мы описываем здесь, использовал моторизованную цель пьезо, чтобы сделать быструю и повторяющееся гиперстек-изображение с помощью двухфотонной микроскопии. Во-первых, этот метод позволяет повторно еледять проникающие артериол,1-й порядок и капилляры2-го порядка без потери фокуса и привел к открытию медленно проводимых сосудистых реакций в капиллярах in vivo. Во-вторых, в сочетании с методом инъекций вирусного вектора, это позволяет нам исследовать астроцитарные реакции кальция в трех измерениях, что необходимо для изучения регуляции кровотока.
Этот метод не без ограничений. Во-первых, перед 3D-изображением определяется узкое прямоугольное поле зрения для достижения высокого временного разрешения. Это обычно ограничивает изображение первыми тремя порядками капилляров. Во-вторых, лазеры из двухфотонных микроскопов должны быть идеально выровнены. Лазерная несогласованность будет ложно децентрцентрать каждый кадр и увеличить измерение диаметра судна. В-третьих, частота выборки 3D-изображений способна фиксировать медленные СВРсИ и медленные изменения кальция в астроцитах. 1-2 Гц на стек по-прежнему не достаточно быстро, чтобы изучать быстрые CVRs11 или быстрые сигналы кальция в астроцитах12,13.
Кроме того, для того, чтобы повлиять на сосуды, представляющие интерес локально, мы оптимизировали процедуру точного вставки стеклянной микро-пипетки в определенное расположение коры головного мозга мыши. Существует несколько важных шагов для успешного применения этого метода. Во-первых, необходимо тщательно отрегулировать угол стеклянного держателя микропипетки. Это должно позволить микро-пипетки свободно маневрировать под целью и стеклянный покрывало над открытой коры. Во-вторых, во время вставки стеклянной микропипетты в слой агарозы и коры головного мозга, небольшое удерживание давления необходимо держать кончик пипетки unclogged. Тем не менее, осторожность должна быть оказана не применять слишком большое давление проведения так, что соединение не протекает до пыхтя. В-третьих, пыхтя пипетки должны быть проверены в слое агарозы над мозгом, чтобы найти оптимальное давление и продолжительность выпуска достаточно пыхтя соединения на один слой, не вводя очевидное смещение клеток и сосудов из-за механических Давления.
Для более точного измерения скорости CVR необходимо повысить скорость сканирования громкости. Есть и другие недавно разработанные микроскопы для сканирования громкости, например, двухфотонный микроскоп с акустическим оптическим дефлекторами (AOD) сканирует так быстро, как 5 томов в секунду с тем же пространственным разрешением и размером громкости (электронная связь). Световые микроскопы сканируют даже больший размер громкости (350 мкм х 800 мкм х 100 мкм) с 10 объемами в секунду14.
Наша подготовка мыши также имеет ограничения. Острая хирургия мыши может иметь потенциальные осложнения. Обезболивающее лекарство и анестезия могут повлиять на нейрососудистые реакции. Острый нейровоспаление также может быть вызвано, в результате микроглиальной активации и лейкоцитоза в корковых тканях и сосудах. Хотя размер наконечника стеклянных микропипетков, как правило, очень мал (Злт;1 мкм), процедура вставки и атфа пыхтя может также потенциально вызвать микроглиальную миграцию и объятие места вставки в течение 0,5-1 часа после вставки.
В заключение, сочетание 3D-изображения в двухфотонической микроскопии и локализованного пыхтя стеклянного микропипетика является передовым инструментом для изучения нервно-сосудистой деятельности и их механизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Фондом Лундбека, Фондом NOVO-Nordisk, Датским советом независимых исследований Медицинские науки, и грант Фонда NORDEA в Центр здорового старения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
