Summary
We presenteren een geoptimaliseerde lokale ejectieprocedure met behulp van een glazen micro-pipet en een snelle twee-fotonen hyperstack-beeldvormings methode, die nauwkeurige meting van veranderingen in de capillaire diameter mogelijk maakt en het onderzoek van de verordening in drie dimensies.
Abstract
Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door een complex netwerk van schepen. Echter, de regulering van cerebrale doorbloeding (CBF) is niet volledig begrepen, vooral op het capillaire niveau. Two-photon microscopie is een krachtig hulpmiddel op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van CBF en de verordening. Momenteel wordt dit veld beperkt door het ontbreken van in vivo twee-fotonen microscopie studies die onderzoeken (1) CBF-responsen in drie dimensies, (2) voerden vasculaire reacties uit en (3) gelokaliseerde interventies binnen het vasculaire netwerk. Hier beschrijven we een 3D in vivo-methode met behulp van twee-fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire reacties te bestuderen die worden opgewekt door lokale uitwerpen van ATP met een glazen micro pipet. Onze methode maakt gebruik van snelle en repetitieve hyperstack Two-photon Imaging voor nauwkeurige diameter metingen door de maximale intensiteit projectie van de verkregen beelden. Bovendien tonen we aan dat deze methode ook kan worden gebruikt om 3D astrocytische calcium responsen te bestuderen. We bespreken ook de voordelen en beperkingen van het inbrengen van glazen micropipetten en twee Fobe hyperstack-beeldvorming.
Introduction
De hersenen hebben een hoog energieverbruikpercentage. Ongeveer 20% van de zuurstof en 25% van de glucose verbruikt door het menselijk lichaam zijn gewijd aan de hersenfunctie, terwijl de hersenen slechts 2% van de totale lichaamsmassa inneemt. Het behoud van de normale hersenfunctie vereist een voldoende en efficiënte toevoer van zuurstof en voeding door de bloedtoevoer in een complex netwerk van schepen. Lokale hersenactiviteit en cerebrale doorbloeding (CBF) zijn robuust gekoppeld, afhankelijk van de functionele eigenschappen van neuronen, astrocyten, pericytes, gladde spiercellen (Smc's) en endotheel cellen (ECs)1. Onlangs zijn de eerste paar orders van capillairen vertakkingen van penetrerende arteriolen ontstaan als een ' hotspot '2, met actieve regulering van capillaire bloedstroom. Een traag uitgevoerde vasculaire respons (CVR) werd ontdekt in deze ' hotspot ' in de muis Somatosensorische cortex tijdens zowel whisker stimulatie en lokale ejectie (puffing) van ATP met een glazen micro-pipet3.
Hoewel in vivo imaging by Two-photon laser scanning fluorescerende microscopie is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neurovasculaire reacties in de hersenschors, de meeste van de studies gemeten bloedvat diameters en onderzocht hun verordening in een tweedimensionaal (2D) x-y-vlak. De uitdagingen zijn: ten eerste, cerebrale bloedvaten en hun omarmen astrocyten, pericytes en SMCs construeren takken in drie dimensies (3D). Het is daarom van cruciaal belang om hun interacties in 3D te bestuderen. Ten tweede zal zelfs een kleine hoeveelheid drift in de focus de precieze meting van zowel de diameter van het vaartuig als de cellulaire fluorescerende signalen beïnvloeden. Tot slot zijn de CVRs snel en verreikend in drie dimensies. 3D-volume scanning is optimaal voor het opsporen van Cvr's en het ontdekken van hun mechanismen. We implementeerden een piëzo-motorische doelstelling in een twee-Fobe Microscoop om de muis Somatosensorische cortex in vivo te bestuderen, waardoor precieze diameter metingen mogelijk werden door maximale intensiteits projecties van de verkregen beelden.
Glas micro-pipetten zijn vaak gebruikt voor in vivo hersenstudies, bijvoorbeeld om organische kleurstoffen in bulk te laden4, EEGs5 op te nemen en voor patch klemmen6. Niettemin, beperkingen blijven. Gewoonlijk wordt de punt van de glazen micro-pipet onrustig geplaatst of wordt de micro pipet niet gebruikt voor lokale ingrepen. Hier hebben we de procedure voor het inbrengen van micropipetten en lokale uitwerpen geoptimaliseerd.
Bovendien biedt de combinatie van 3D twee-photon microscopie en genetisch gecodeerde fluorescerende indicatoren een ongekende kans om neurovasculaire koppeling in een 3D-scope te onderzoeken. In deze studie, we profiteerde van deze en geïnjecteerd virale vectoren die astrociet specifieke genetisch gecodeerde calcium indicatoren in de muis Somatosensorische cortex. Astrocyten en de diameter van het vat werden gelijktijdig afgebeeld door verschillende fluorescerende markers te combineren.
Over het algemeen presenteren we een geoptimaliseerde methode van lokale ejectie (puffing) door glazen micro-pipet en snelle Two-photon hyperstack Imaging, die nauwkeurige meting van capillaire diameter wijzigingen mogelijk maakt. Daarnaast biedt onze methode een nieuwe tool om tegelijkertijd 3D-profielen van CA2 + -reacties in astrocyten en vasculaire diameter reacties te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Deens nationaal ethisch comité overeenkomstig de richtsnoeren die zijn uiteengezet in het Verdrag van de Europese Raad inzake de bescherming van gewervelde dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden en voldoen aan de richtlijnen voor de aankomst. Dit is een terminale procedure waarbij de muizen voorafgaand aan verdovings herstel worden geëmoriseerd.
1. pre-chirurgische voorbereiding
- Reinig de chirurgische tafel en alle omliggende gebied met 70% ethanol. Grondig reinigen en drogen van de chirurgische gereedschappen voor de operatie.
- Anesthetiseer een NG2DsRed Mouse (TG (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; beide geslachten; 4-8 maanden oud) door een peritoneale injectie van ketamine + xylazine (60 mg/kg + 10 mg/kg) opgelost in gesteriliseerd water, pH 7,4. Dien elke 25 minuten aanvullende doses ketamine (30 mg/kg) toe tot de voltooiing van de chirurgische ingreep. Controleer de staart-en teen knijp reflexen regelmatig om de diepte van de anesthesie te controleren.
- Injecteer de zoutoplossing subcutaan op vier verschillende plaatsen op de achterzijde van de muis voor een totaal volume van 1 mL om uitdroging tijdens het experiment te voorkomen. Om de ogen te beschermen tegen uitdroging, moet u een oogsmeer middel aanbrengen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37 °C met een rectale temperatuursonde en een verwarmings deken.
2. chirurgische ingreep
- Tracheotomie
- Plaats de muis op de achterkant. Injecteer 0,04 mL 0,5% lidocaïne subcutaan onder de geplande incisie en wacht 2 min. Maak een 10 mm lange incisie boven het borstbeen (manubrium). Scheid de submandibulaire klieren en sternoschildklier spieren, en vervolgens bloot de luchtpijp.
- Maak tracheostomie tussen twee tracheale ringen met een schaar. Plaats een kleine metalen buis met een lengte van 16,2 mm en een diameter van 1 mm in de luchtpijp. Sluit de buis aan op een mechanische ventilator en capnograph om de end-expiratory CO2 (Figuur 1a) te bewaken.
- Inbrengen van de katheter
- Injecteer 0,5% lidocaïne (0,04 mL) subcutaan onder de geplande incisie en wacht 2 minuten.
- Met behulp van fijne tip Tang voorzichtig scheiden van de slagader van de ader. Stop de bloedstroom stroomopwaarts met een microvasculaire klem. Vernauwing van de bloedstroom stroomafwaarts met een 10-0 nylon hechtdraad die beide bloedvaten liggende.
- Gebruik micro-dissecting schaar om een kleine incisie te maken in zowel de slagader als de ader. Plaats plastic katheters in beide bloedvaten. Zet de katheters vast door de hechtingen te verdraaien (8-0 of 10-0 nylon hechtingen afhankelijk van de grootte van het vat) zonder afbreuk te doen aan katheter lumens. Verwijder de microvasculaire klem en sluit de huid.
- Controleer de bloeddruk via de arteriële katheter. Meetniveaus van bloedgassen in arteriële bloedmonsters (50 μL) voor en na elk experiment (normale waarden: pO2, 90-120 mmHg; PCO2, 35-40 mmHg; pH, 7,25-7.45) met behulp van een bloedgasanalysator. Gebruik de ader katheter voor infusie van fluoresceïne en anesthesie.
- Craniotomie
- Scheer de vacht van het hoofd van de muis tussen de oren. Injecteer 0,04 mL 0,5% lidocaïne subcutaan onder de geplande incisie en wacht 2 min.
- Veeg de schedel met een ijzer chloride oplossing van 10% om het periosteum te verwijderen. Spoel de schedel grondig met een zoutoplossing. Lijm een metalen kopbar aan de schedel met Cyanoacrylaat lijm en activator (Figuur 1a).
Let op: de metalen kopbar is 75 mm lang en 13,5 mm breed, met een rond gat van 5 mm diameter in het midden. - Boor een craniotomie met een diameter van 4 mm, gecentreerd op 0,5 mm achter en 3 mm rechts van de bregma over de juiste sensorische Barrel cortex. Verwijder de Dura met een fijn-Tip vat dilator.
- Bedek de blootgestelde cortex met 0,75% agarose-gel, opgelost in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF; pH = 7,4) en gekoeld tot 35 °C. Bedek 80-90% van de craniotomie met een glazen afdekplaat onder een hoek van 10-15 ° tot de metalen kopbalk (Figuur 1B) die het inbrengen en plaatsen van de glazen micro pipet toestaat.
- Om de hersen pulsatie te minimaliseren, lijm de twee hoeken van de glazen afdekplaat op de metalen hoofdbar met Cyanoacrylaat lijm en activator. Breng de activator zorgvuldig aan om te voorkomen dat je op de blootgestelde hersenen. Spoel de gelijmde glazen dekslip grondig af met een zoutoplossing achteraf.
- Voer het inbrengen van de whisker pad stimulatie sonde uit. Plaats een set van op maat gemaakte bipolaire elektroden (8 mm lengte en 0,25 mm dikte) in de linker kant van het gezicht om de Ramus infraorbitalis van de trigeminuszenuw contralateraal aan de craniotomie te stimuleren. Plaats de kathode dicht bij de hiatus infraorbitalis, en steek de anode in de kauw stelsel spieren7. Voer de stimulatie uit met een elektrische stimulator met een intensiteit van 1,5 mA voor 1 MS in treinen van 20 sec. bij 2 Hz.
- Dien na voltooiing van de operatie een bolus van 0,05 mL fluoresceïne isothiocyanaat-dextran (FITC-dextran, 4% m/v, molecuulgewicht [MW] 50.000) in de dijader in om het bloed plasma te labelen. Stop met ketamine en schakel de anesthesie naar continue intraveneuze infusie van α-chloralose (17% w/v, eindconcentratie) vermengd met FITC-dextran (2% w/v, eindconcentratie) bij 0,02 mL/10 g/h. wacht ongeveer een half uur voor stabilisatie van de nieuwe anesthetische toestand.
Opmerking: zowel FITC-dextran als α-chloralose worden opgelost in 0,9% zoutoplossing.
3. eerste twee-Photon Imaging Session
- Breng de muis over naar het podium van een commerciële twee-photon-Microscoop (tabel met materialen). Onder zowel rode fluorescerende eiwitten (RFP, Figuur 1c) en groen fluorescerende eiwitten (GFP, Figuur 1c) modi van epi-fluorescerende verlichting, neem een foto van de blootgestelde cortex met een 5x doelstelling. Gebruik de RFP-foto als een ' map ' voor het inbrengen van de glazen micro pipet in de volgende sessie.
Opmerking: de GFP ' kaart ' wordt gebruikt om aderen/venules van slagaders/arteriolen te onderscheiden. - Voer Two-photon Imaging uit met behulp van de Two-photon Microscoop en een 25x 1,0 numerieke diafragma (NA) water-immersie doelstelling met piëzo-motor. Stel de golflengte van de excitatie in op 900 nm. Zoek de cortex en volg elke penetrerende Arteriole en vind de horizontale takken (1St orde capillairen).
- Beeld penetrerende arteriolen en hun 1St orde capillairen in rust en tijdens de whisker pad stimulatie. Zie de gedetailleerde beeldvormings parameters in sectie 5.
- Markeer locaties van 1St orde capillairen met > 5% vasodilatatie tijdens de whisker pad stimulatie op de RFP ' map ' (Figuur 1C). Locaties met < 5% vasodilatatie worden beschouwd als buiten de whisker Barrel cortex regio.
Opmerking: bij gebruik van wild-type muizen in plaats van NG2DsRed muizen in het experiment, wordt de GFP-afbeelding in plaats daarvan gebruikt als ' map '.
4. inbrengen van de glazen micro pipet
- Maak glazen micropipetten klaar voor het puffen met behulp van een pipet trekker (tabel met materialen). De glazen micropipetten hebben een weerstand van 3-3.5 MΩ en een conus lengte van 4,5-5 mm. Laad een pipet met een mengsel van 1 mM ATP en 10 μM Alexa 594 om de pipetpunt onder de epi-fluorescentielamp en de twee-fotopmicroscoop te visualiseren.
- Monteer de glazen micro pipet op een patch houder en sluit deze aan op een luchtpomp. Zet de pomp met druk op 0 psi.
- Gebruik rode epi-Fluorescentieverlichting en concentreer u op de pipetpunt met de 5x-doelstelling. Plaats de glazen micro pipet in de aCSF boven de agarose. Stel de houd druk van de luchtpomp in op 0,2 psi. Een kleine rode wolk kan worden waargenomen uitwerpen uit de pipetpunt in de aCSF. Dit is om verstopping te voorkomen tijdens pipet inbrengen.
- Kies een van de gemarkeerde locaties in de RFP ' map ' als bestemming. Verplaats de pipetpunt naar het horizontale vlak van de afdekglas rand met een afstand van 30 μm, die ongeveer naar de bestemming in het x-y-vlak wijst.
- Verlaag de pipetpunt voorzichtig in de z-as onder de afdekglas strook. Begin vervolgens met het bevorderen van de glazen pipet naar de bestemming tot ~ 500 μm boven het hersen oppervlak. Schakel regelmatig scherp tussen de afdekglas rand, de pipetpunt en het hersen oppervlak en zorg ervoor dat er voldoende vrije ruimte is om de pipet te verplaatsen.
- Stel de doelstelling in op 25x. Plaats de pipetpunt opnieuw en de pipetpunt verder naar de bestemming op de kaart van de RFP. Houd de pipetpunt in de agarose-laag.
- Wanneer de pipetpunt ~ 100 μm boven het hersen oppervlak ligt, schakelt u de beeldvormings modus in op twee-photon-microscopie. Concentreer u op een doellocatie waar u wilt bladerdeeg. Noteer de x-, y-coördinaten (x0, y0) en de diepte onder het oppervlak (z0). Bereken de coördinaten van het invoegpunt op het hersen oppervlak (xi, yi) als volgt:
xi = x0 + z0 /Tan θ
yi = y0
waarbij θ de hoek is tussen de pipet houder en het horizontale vlak. - Plaats de pipetpunt op de coördinaten (xi, yi) op het hersen oppervlak. Plaats de pipet voorzichtig en langzaam totdat deze bereikt (x0, y0, z0). Als een vat in de weg staat van een insertie pad, trekt u de pipet in en berekent u andere invoegings coördinaten en het pad; of draai de werk plaat lichtjes (zoals aangegeven in Figuur 1A).
- Stel de pomp met druk op 0 psi en ejectiedruk bij 10-15 psi. Puff ATP voor 200-400 MS op de doellocatie tijdens twee-Photon Imaging. Pas de druk en de duur van de puffing voor elke pipet en na verloop van tijd aan zoals uitgelegd in de sectie discussie.
5. hyperstack Two-photon Imaging
- Voer experimenten uit met de twee-photon Microscoop en een 25 x 1,0 NA water-immersie doelstelling met piëzo-motor. Stel de golflengte van de excitatie in op 900 nm. Filter het uitgezonden licht om rood licht te verzamelen van DsRed (pericytes)/tetramethylrhodamine isothiocyanaat-dextran (TRITC-dextran) kleuring bloed plasma en groen licht van FITC-dextran (bloed plasma)/GCaMP6 (GFP, astrocytisch calcium).
- Produceer een z-stack met hoge resolutie op de locatie van belang die een penetrerende Arteriole bevat, een 1St -orde capillair, een 2ND -volgorde capillair en mogelijk naburige fluorescerende cellen (bijv. pericytes, astrocyten). Bepaal het x * y * z-volume van hyperstack-beeldvorming door de 3D-structuur van de bloedvaten zoveel mogelijk te opnemen. De totale hoogte van elke stapel kan variëren van 30-50 μm, terwijl het x-y-vlak ruwweg een oppervlakte van 60 μm x 40 μm beslaat.
- Stel de afbeeldingsstapel in de beeldvormings software in op 8-10 vlakken met een interplane-afstand van 4-5 μm. De piëzo-motorische doelstelling stopt op elk niveau op de z-as om het beeld van elk vlak te verwerven. De bemonsteringsfrequentie is 1 s per stapel en de pixel resolutie in het x-y-vlak is 0,2-0,3 μm (Figuur 2A). Een opname omvat normaalgesproken 10 pre-Puff afbeeldingsstapels en 150 post-Puff afbeeldingsstapels.
6. gegevensverwerking
- Gegevens verwerken met behulp van op maat gemaakte analytische software. Afvlakken van elke afbeeldingsstapel in één afbeelding door projectie met maximale intensiteit (Figuur 2B). Teken een rechthoekig gebied van belang (ROI) met een breedte van 3 μm loodrechte over het betreffende vaartuig (Figuur 2C).
- Om interferentie door schaduwen van rode bloedcellen en kleine trillingen van de cortex te minimaliseren, gemiddelde de rechthoekige ROI door het te projecteren in één regel, die vervolgens het gemiddelde Profiel van het vaartuig segment vertegenwoordigt. Doe dit voor elke afbeelding met maximale intensiteit.
- Plot de profiel lijnen als een 2D-afbeelding met de x-as die maximale intensiteit beelden in chronologische volgorde vertegenwoordigt (Figuur 2D, bovenste paneel). Gebruik een actieve contour algoritme (Chan-Vese segmentatie) om de randen van het vat te vinden8,9 (aangegeven door rode bochten; Figuur 2 D, bovenste paneel).
- Bereken de tijdsduur van de diameter verandert als het verschil tussen de randen van de bloedvat (verticale afstand tussen de bovenste en onderste rode krommen in Figuur 2D, onderste paneel). Normaliseren diameter wijzigingen in voor-puffing diameter basislijn en plot curven van diameter verandering in de tijd. Doe dit voor elke ROI (Figuur 2E).
- De respons amplitude van het vat wordt na het puffen gedefinieerd als de hoogste/laagste piek amplitude. De respons latentie wordt gedefinieerd als de latentie van de halve Max amplitude (afbeelding 2G). Volg handmatig de geskeletteerde vasculaire structuur door knopen langs de vaten te plaatsen (Figuur 2F) en de geografische afstand tussen elke ROI en de penetrerende Arteriole te meten. Bereken de snelheid van CVR door de afstanden te delen door latentie verschillen.
7. virale vector injectie
- Om gelijktijdig astrocytische calcium responsen te bestuderen, injecteert u een volume van 0,6 μL virale vector (pZac 2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) in de Somatosensorische cortex van NG2DsRed muizen, na de standaard stereotactische virale vector injectieprocedure 10.
- Na drie weken, de astrocyten in de muis Somatosensorische cortex Express de genetisch gecodeerde calcium indicator, GCaMP6f. Volg de bovengenoemde chirurgische ingreep en Two-photon Imaging voor muizen. Om onderscheid te maken tussen astrocyten en het vat lumina, wordt TRITC-dextran in plaats van FITC-dextran gebruikt voor het vlekken van het vat Lumina Red.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nadat de operatie voltooid was, werden muizen getransporteerd naar twee-photon Microscoop (Figuur 1A). Er werd een glazen micro pipet met 1 mM ATP in de nabijheid van het bestemmings bloedvat op de doellocatie ingebracht (Figuur 1B).
We voerden hyperstack Imaging uit terwijl we een Puff van 1 mM ATP gaven (afbeelding 2a, aanvullende video 1). Elke afbeeldingsstapel werd afgevlakt tot één afbeelding door projectie met maximale intensiteit (Figuur 2B). Rechthoekige ROIs werden loodrechte over het vat geplaatst om de verandering van de diameter van de vaten bij de ATP-puffing te meten (Figuur 2C). De diameter van het vaartuig werd gemeten met behulp van de segmentatie van Chan-Vese (Figuur 2D). Bij enkele bladerdeeg opnames werden genormaliseerde diameter veranderingen bij elke ROI overgelegd om de responsen van verschillende vaartuig segmenten te vergelijken (Figuur 2E). De afstand van elke ROI tot de penetrerende Arteriole werd berekend door het vasculaire skelet met de hand te tekenen (Figuur 2F). Amplitudes en latenties van verwijding en vernauwing bij elke ROI in enkele Puff opnames werden getekend over de berekende afstanden van de ROIs naar de penetrerende Arteriole (Figuur 2H-K). Vasodilatatie bij puffing vermeerderd lineair met een snelheid van 14,69 μm/s (stroomopwaarts) en van 2,8 μm/s (stroomafwaarts), beginnend vanaf de kruising van 1St en 2ND orde capillairen (Figuur 2H). Vasoconstrictie ook gepropageerd lineair bij 3,92 μm/s, beginnend bij de penetrerende Arteriole (Figuur 2I). Maximale amplitude van zowel vasodilatatie en vasoconstrictie opgetreden in 1St orde capillairen (Figuur 2J-K).
Bovendien werden astrocyten-specifieke virale vector-dragende fluorescerende calcium indicatoren en Two-photon hyperstack Imaging, astrocytische calcium responsen op ATP puffing onderzocht (Figuur 3A, aanvullende video 2 ). Rechthoekige ROIs werden geplaatst op astrocytische somata en processen. ATP veroorzaakte een stijging van het intracellulaire calcium in astrocytische processen, maar niet in de astrocyten somata (Figuur 3B).
Figuur 1 : Diagram van in vivo Two-photon 3D-beeldvorming en glazen micropipet puffing. (A) de verdoofd Mouse is hoofd-vast aan een metalen staaf en mechanisch geventileerd. End-Tidal CO2 wordt bewaakt door een capnograph. Beide whisker pad stimulatie en micro-pipet puffing worden gebruikt voor het induceren van vasculaire diameter veranderingen. De glazen micro pipet houder is gemonteerd op de podium plaat. De femorale slagader en ader zijn katheterized om de bloeddruk en bloedgassen te controleren, respectievelijk om anesthesie en fluorescein te inhalen. B) de glazen afdekplaat bedekt de craniotomie onder een hoek, waardoor het vrije verkeer van de pipet mogelijk is. De puffing micro-pipet wordt geplaatst in de nabijheid van een penetrerende Arteriole en haar haarvaten en bevat een mengsel van 10 μM Alexa 594 (rode kleur in glazen micro-pipet) en 1 mM ATP. De Two-photon Imaging is een snelle en repetitieve 3D volume scanning met de penetrerende Arteriole en de eerste paar orde capillairen, evenals naburige astrocyten en pericytes. C) representatieve beelden van rood fluorescerende eiwit (RFP) en groen fluorescerende proteïne (GFP) met behulp van epi-Fluorescentieverlichting worden weergegeven. Ze worden gebruikt als ' Maps ' tijdens pipet-invoeging. Rode cirkels markeren locaties van 1St orde capillairen met > 5% vasodilatatie tijdens de stimulatie van de whisker pad. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : De ATP-puffing met micro pipet induceert de verwijding van het vaartuig, gevolgd door vernauwing. A) cascade van vliegtuigen in één representatieve beeld stapel met inbegrip van penetrerende Arteriole en 1St en 2ND orde capillairen. Pericytes zijn gelabeld met een rode de (ng2-dsred) en het lumen van het vat is gelabeld met FITC-dextran (groen). B) projectie met maximale intensiteit van de afbeeldingsstapel. C) meerdere uniek gekleurde gebieden van belang (Rois) loodlijnen over de vasculatuur zijn geplaatst om de diameter van het vat te meten. D) top, representatieve fluorescentie intensiteit in de tijd bij de donker blauwe ROI van panel C. De twee rode curven definiëren de randen van de wand van het vat. De verticale afstand tussen de twee rode bochten is de diameter van het vat en wordt weergegeven als functie van de tijd (onder). (E) genormaliseerde diameter veranderingen na verloop van tijd bij elke ROI in reactie op 1 mm ATP puffing. Metingen zijn gebaseerd op één experiment. F) het vasculaire skelet werd handmatig getraceerd door knooppunten langs de vaten te plaatsen. (G) amplitudes van verwijding of vernauwing werden gedefinieerd als respectievelijk maximale positieve of negatieve vasculaire respons tijdens de opnamesessie. De latentie van verwijderingen en vernauwingen werden gerapporteerd als tijd tot half positief of negatief maximum na puffing begin. (H-K) Grafieken tonen de latentie van verwijding (H), de latentie van vernauwing (I), de amplitude van de verwijding (J), en de amplitude van vernauwing (K) van alle Rois weergegeven in panel C versus de afstand van elke ROI van de penetreren Arteriole. De onderbroken lijnen vertegenwoordigen de lineaire aanpassing van upstream en downstream geleidende responsen. p.a.: penetreren van Arteriole. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : ATP-puffing met micro pipet induceert astrocytische calcium activiteiten. A) astrocytische virale vectoren die een fluorescerende calcium indicator dragen, werden drie weken voorafgaand aan de experimentele procedure geïnjecteerd in de muis Somatosensorische cortex. Afbeelding toont het vat Lumina gelabeld met TRITC-dextran (rood) en astrocytaire calcium in het groen. B) er worden meerdere ro's op astrocytische somata en processen geplaatst. Bij 1 mM ATP puffing, intracellulaire calcium verhoogd in astrocytische processen, maar niet in somata (gestippelde dozen), waarbij calcium niveaus groter dan de gemiddelde plus 1,5 x standaarddeviatie werden gedefinieerd als significant. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende video 1: Time Series-film afgevlakt van hyperstack-beeldvorming van vaten in reactie op puffing van 1 mm ATP. Groen: FITC-dextran, kleurings vaartuig lumen. Rood: NG2DsRed, kleuring pericytes. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende video 2: Time Series-film afgevlakt uit hyperstack-beeldvorming van astrocytisch calcium in reactie op puffing van 1 mm ATP. Groen: astrocytisch calcium. Rood: TRITC-dextran, kleurings vaartuig lumen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een uitdaging voor vasculaire studies is de precieze meting van de diameter van het vat. De methode die we hier beschrijven gebruikten een gemotoriseerde piëzo-doelstelling om snelle en repetitieve hyperstack-beeldvorming te maken met twee fotonmicroscopie. Ten eerste, deze methode maakt herhaalde onderzoeken van de penetrerende Arteriole, 1St orde en 2ND orde capillairen zonder verlies van focus en leidde tot de ontdekking van langzaam uitgevoerde vasculaire reacties in capillairen in vivo. Ten tweede, in combinatie met een virale vector injectietechniek, het stelt ons in staat om te onderzoeken van astrocytische calcium reacties in drie dimensies, die nodig is voor studies van de bloedstroom regulering.
Deze methode is niet zonder beperkingen. Ten eerste wordt voor de 3D-beeldvorming een smal rechthoekig gezichtsveld gedefinieerd om een hoge temporele resolutie te bereiken. Dit beperkt meestal de beeldvorming tot de eerste drie orden van capillairen. Ten tweede moeten lasers van twee-Fobe microscopen perfect op elkaar zijn afgestemd. Laser uitlijning zal de-centreren elk frame en verhoog de diameter van het vat meting. Ten derde is de bemonsteringssnelheid van 3D-beeldvorming in staat langzame Cvr's en langzame calcium veranderingen in astrocyten op te vangen. 1-2 Hz per stapel is nog steeds niet snel genoeg om snelle cvrs11 of snelle calcium signalen in astrocyten12,13te bestuderen.
Bovendien hebben we de procedure voor het nauwkeurig inbrengen van een glazen micro pipet in een specifieke locatie van de hersenschors van de muis geoptimaliseerd om de lokale belangen van de schepen te beïnvloeden. Er zijn verschillende kritieke stappen voor een geslaagde toepassing van deze methode. Ten eerste moet de hoek van de glazen micro pipet houder zorgvuldig worden aangepast. Het moet de micro-pipet in staat stellen vrij te manoeuvreren onder het objectief en de glazen afdekplaat boven de blootgestelde cortex. Ten tweede, tijdens het inbrengen van de glazen micro-pipet in de agarose-laag en de cortex, is een kleine houd druk nodig om de pipetpunt te ontzorgen. Echter, voorzichtigheid moet worden uitgeoefend niet te groot een druk op het bedrijf toe te passen, zodat de compound niet lekt voordat puffing. Ten derde moet de puffing van de pipet worden getest in de agarose-laag boven de hersenen om de optimale druk en duur te vinden die voldoende puffing compound op één bladerdeeg vrijgeeft, terwijl geen duidelijke verplaatsing van cellen en vaten wordt ingevoerd als gevolg van mechanische Druk.
Om de snelheid van CVR nauwkeuriger te meten, moet de volume scansnelheid worden verbeterd. Er zijn andere nieuw ontwikkelde volumescanmicroscopen, bijvoorbeeld een microscoop met twee fotoron met een akoestische optische deflector (AOD) scant zo snel als 5 volumes per seconde met dezelfde ruimtelijke resolutie en volumegrootte (e-mail communicatie). Light-Sheet microscopen scannen zelfs een grotere volumegrootte (350 μm x 800 μm x 100 μm) met 10 volumes per seconde14.
Onze muis voorbereiding heeft ook beperkingen. Acute muis chirurgie kan mogelijke complicaties hebben. Pijnbestrijding geneeskunde en anesthesie kunnen invloed hebben op de neurovasculaire reacties. Acute neuro ontsteking kan ook worden geactiveerd, resulterend in microglial activering en leukocytose in corticale weefsels en vaten. Hoewel de tipgrootte van glazen micropipetten meestal erg klein is (< 1 μm), kunnen de plaatsingsprocedure en de ATP-puffing ook leiden tot microglial migratie en omarming van insertie locaties binnen 0,5-1 uur na het inbrengen.
Kortom, combinatie van 3D-beeldvorming in twee-fotonmicroscopie en gelokaliseerde puffing Glass micro-pipetten is een geavanceerd hulpmiddel om neurovasculaire activiteiten en hun mechanisme te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door de Stichting Lundbeck, de Stichting NOVO-Nordisk, de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek | Medische wetenschappen, en de NORDEA Foundation verlenen aan het centrum voor gezonde veroudering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
