Summary
Vi presenterer en optimalisert lokal utstøting prosedyre ved hjelp av et glass mikro-pipette og en rask to-Foton hyperstack imaging metode, som tillater presis måling av kapillær diameter endringer og gransking av sin regulering i tre dimensjoner.
Abstract
Vedlikehold av normal hjernefunksjon krever en tilstrekkelig og effektiv tilførsel av oksygen og ernæring av et komplekst nettverk av fartøy. Imidlertid er regulering av cerebral blodstrøm (CBF) ufullstendig forstått, spesielt på kapillær nivå. To-Foton mikroskopi er et kraftig verktøy som er mye brukt til å studere CBF og dens regulering. Foreløpig er dette feltet begrenset av mangelen på in vivo to-Foton mikroskopi studier undersøke (1) CBF svar i tre dimensjoner, (2) gjennomført vaskulær svar, og (3) lokaliserte intervensjoner i det vaskulære nettverket. Her beskriver vi en 3D in vivo metode som bruker to-Foton mikroskopi å studere utført vaskulær svar elicited av lokale utstøting av ATP med et glass mikro-pipette. Vår metode bruker rask og repeterende hyperstack to-Foton Imaging gir presis diameter målinger av maksimal intensitet projeksjon av oppnådde bilder. Videre viser vi at denne metoden kan også brukes til å studere 3D astrocytic kalsium responser. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger av glass mikro-pipette innsetting og to-Foton hyperstack Imaging.
Introduction
Hjernen har en høy energiforbruk rate. Omtrent 20% av oksygen og 25% av glukose forbrukes av menneskekroppen er dedikert til hjernens funksjon, mens hjernen bare opptar 2% av den totale kroppsmassen. Vedlikehold av normal hjernefunksjon krever en tilstrekkelig og effektiv tilførsel av oksygen og ernæring ved blodstrøm i et komplekst nettverk av fartøy. Lokale hjerne aktivitet og cerebral blodstrøm (CBF) er robust kombinert, avhengig av funksjonelle egenskaper neurons, astrocytter, pericytes, glatte muskelceller (SMCs) og endothelial celler (ECs)1. Nylig har de første ordrene av blodkar forgrening fra gjennomtrengende arterioler dukket opp som en "hotspot"2, som viser aktiv regulering av kapillær blodstrøm. En langsom gjennomført vaskulær respons (CVR) ble oppdaget på denne "hotspot" i mus somatosensory cortex under både whisker stimulering og lokale utstøting (damper) av ATP med et glass mikro-pipette3.
Selv om in vivo Imaging av to-Foton laserskanning fluorescerende mikroskopi har vært mye brukt for å studere nevrovaskulære responser i hjernebarken, de fleste av studiene målte blod fartøy diametere og undersøkt deres regulering i en todimensjonal (2D) x-y-plan. Utfordringene er: for det første, cerebral blodkar og deres omfavne astrocytter, pericytes og SMCs konstruere grener i tre dimensjoner (3D). Det er derfor avgjørende å studere deres interaksjoner i 3D. For det andre vil selv en liten mengde drift i fokus påvirke nøyaktig måling av både fartøy diametere og cellulære fluorescerende signaler. Til slutt, CVRs er rask og vidtrekkende i tre dimensjoner. 3D volum skanning er optimal for å oppdage CVRs og avsløring sine mekanismer. Vi implementerte en piezo motor mål i en to-Foton mikroskop for å studere musen somatosensory cortex in vivo, slik presis diameter målinger av maksimal intensitet anslag over oppnådde bilder.
Glass mikro-Pipetter har ofte blitt brukt til in vivo Brain Studies, for eksempel til bulk-Load organiske fargestoffer4, posten EEGs5 og for patch klemme6. Likevel, begrensninger gjenstår. Vanligvis er tuppen av glasset mikro-pipette upresist plassert, eller mikro-pipette brukes ikke for lokale intervensjoner. Her har vi optimalisert prosedyren for mikro-pipette innsetting og lokale utstøting.
Videre, kombinasjonen av 3D to-Foton mikroskopi og genetisk-kodet fluorescerende indikatorer gir en enestående mulighet til å undersøke nevrovaskulære kopling i et 3D omfang. I denne studien, tok vi fordel av dette og injisert viral vektorer bærer astrocytt spesifikke genetisk-kodet kalsium indikatorer i musen somatosensory cortex. Astrocytter så vel som fartøy diametere ble avbildet samtidig ved å kombinere ulike fluorescerende markører.
Samlet presenterer vi en optimalisert metode for lokale utstøting (damper) av glass mikro-pipette og rask to-Foton hyperstack Imaging, som tillater presis måling av kapillær diameter endringer. I tillegg gir vår metode en ny verktøy for å samtidig studere 3D-profiler av ca2 + svar i astrocytter og vaskulær diameter svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av den danske nasjonale etikk komité i henhold til retningslinjene fastsatt i det europeiske Råds konvensjon om beskyttelse av virveldyr dyr som brukes til eksperimentell og andre vitenskapelige formål og samsvar med retningslinjene for ankomst. Dette er en Terminal prosedyre med musene blir euthanized før bedøvelse utvinning.
1. pre-kirurgisk forberedelse
- Rengjør operasjonsbordet og hele området rundt med 70% etanol. Rengjør og tørk de kirurgiske verktøyene grundig før operasjonen.
- Bedøve en NG2DsRed mus (TG (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; begge kjønn; 4-8 måneder gammel) ved en injeksjon av ketamin + xylazine (60 mg/kg + 10 mg/kg) oppløst i sterilisert vann, pH 7,4. Administrer supplerende doser av ketamin (30 mg/kg) hver 25 min til fullføring av den kirurgiske prosedyren. Sjekk hale og tå klype reflekser regelmessig for å verifisere dybden av anestesi.
- Injiser saltvann subkutant på fire forskjellige steder på baksiden av musen for et samlet volum på 1 mL for å forhindre dehydrering under eksperimentet. For å beskytte øynene mot uttørking, Påfør øye smøremiddel. Oppretthold kroppstemperaturen ved 37 ° c ved hjelp av en temperatur sonde for rektal og varmeteppe.
2. kirurgisk prosedyre
- Tracheotomy
- Plasser musen på baksiden. Injiser 0,04 mL 0,5% lidokain subkutant under den planlagte snittet og vent i 2 min. Lag et 10 mm langt snitt over brystbenet (manubrium). Skill submandibular kjertler og sternothyroideus muskler, og deretter utsette luftrøret.
- Lag trakeostomi mellom to tracheal ringer med saks. Sett inn et lite metallrør med en lengde på 16,2 mm og en diameter på 1 mm inn i luftrøret. Koble røret til en mekanisk Ventilator og capnograph for å overvåke ende ekspiratorisk CO2 (figur 1a).
- Innsetting av kateter
- Injiser 0,5% lidokain (0,04 mL) subkutant under den planlagte snittet og vent i 2 min.
- Ved hjelp av fine tips tang forsiktig skille arterien fra venen. Stopp blodstrømmen oppstrøms med en mikrovaskulær klemme. Constrict blodstrømmen nedstrøms med en 10-0 nylon Sutur ligating begge blodkarene.
- Bruk mikro-dissekere saks for å lage et lite snitt i både arterien og venen. Sett inn plast katetre i begge blodkarene. Fest katetre ved å stramme sting (8-0 eller 10-0 nylon sting avhengig av fartøyets størrelse) uten å svekke kateter lumen. Fjern mikrovaskulær klemme og Lukk huden.
- Overvåk blodtrykket via arterie kateteret. Måle nivåer av blodgasser i arteriell blodprøver (50 μL) før og etter hvert eksperiment (normale verdier: pO2, 90-120 MmHg; pCO2, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45) ved hjelp av en blod gass analysator. Bruk vene kateteret for infusjon av fluorescein og anestesi.
- Kraniotomi
- Barbere pelsen av hodet på musen mellom ørene. Injiser 0,04 mL 0,5% lidokain subkutant under den planlagte snittet og vent i 2 min.
- Tørk av skallen med en 10% jernklorid løsning for å fjerne periosteum. Skyll skallen grundig med saltvann. Lim et metall hode bar til skallen med Cyanoacrylate lim og aktivator (figur 1a).
Merk: metall hodet bar er 75 mm lang og 13,5 mm bred, med et rundt hull på 5 mm diameter i midten. - Bor en 4 mm-diameter kraniotomi, sentrert på 0,5 mm bak og 3 mm til høyre for bregma over høyre sensorisk tønne cortex. Fjern Dura med en fin-tip fartøy dilator.
- Dekk til eksponert cortex med 0,75% agarose gel, oppløst i kunstig spinalvæske (aCSF; pH = 7,4) og avkjølt til 35 ° c. Dekk 80-90% av kraniotomi med et glass dekkglass i en vinkel på 10-15 ° til metall hodet bar (figur 1B) som tillater innsetting og plassering av glasset mikro-pipette.
- For å minimere hjernen pulsering, lim de to hjørnene av glasset dekkglass på metall hodet bar med Cyanoacrylate lim og aktivator. Påfør aktivator nøye for å unngå å komme inn på eksponert hjerne. Skyll den limte glass dekkglass grundig med saltvann etterpå.
- Utfør innsetting av whisker. Sett inn et sett med skreddersydde bipolar elektroder (8 mm lengde og 0,25 mm tykkelse) perkutant inn i venstre side av ansiktet for å stimulere Ramus infraorbitalis av Trigeminal Nerve kontralateral til kraniotomi. Plasser bilderøret nær pause infraorbitalis, og sett anode inn i de tygge musklene7. Utfør stimulering med en elektrisk stimulator med en intensitet på 1,5 mA for 1 MS i togene på 20 s ved 2 Hz.
- Ved ferdigstillelse av kirurgi, administrere en bolus på 0,05 mL fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, molekylvekt [MW] 50 000) i lår Bens venen for å merke blodplasma. Avbryt ketamin og Bytt anestesi til kontinuerlig intravenøs infusjon av α-chloralose (17% w/v, endelig konsentrasjon) blandet med FITC-dextran (2% w/v, endelig konsentrasjon) ved 0,02 mL/10 g/h. vent i omtrent en halv time for stabilisering av den nye bedøvelse tilstand.
Merk: både FITC-dextran og α-chloralose er oppløst i 0,9% saltvann.
3. første to-Foton Imaging Session
- Overfør musen til det stadiet av et kommersielt to-Foton mikroskop (tabell av materialer). Under både rødt fluorescerende protein (RFP, figur 1c) og grønt fluorescerende protein (GFP, figur 1c) moduser av Epi-fluorescerende belysning, ta et bilde av eksponert cortex med en 5x objektiv. Bruk RFP-bildet som et "kart" for innsetting av glass mikro-pipette i neste økt.
Merk: GFP ' Map ' brukes for å skille vener/venules fra arterier/arterioler. - Utfør to-Foton Imaging ved hjelp av to-Foton mikroskop og en 25x 1,0 numerisk blenderåpning (NA) vann-nedsenking mål med piezo motor. Sett eksitasjon bølgelengde til 900 NM. Søk i cortex og følg hver gjennomtrengende arteriole og finne sine horisontale grener (1St. Bestill blodkar).
- Image gjennomtrengende arterioler og deres 1St bestille blodkar i ro og under whisker pad stimulering. Se de detaljerte bilde parametrene i avsnitt 5.
- Merk steder av 1St bestille blodkar med > 5% vasodilatasjon under whisker puten STIMULERING på RFP ' kart ' (figur 1C). Steder med < 5% vasodilatasjon anses som utenfor whisker fat cortex regionen.
Merk: Hvis du bruker vill-type mus i stedet for NG2DsRed mus i eksperimentet, brukes GFP-bildet som "kart" i stedet.
4. innsetting av glass mikro-pipette
- Forbered glass mikro-Pipetter for damper ved hjelp av en pipette avtrekker (tabell av materialer). Glasset mikro-Pipetter har en motstand på 3-3.5 MΩ og en taper lengde på 4,5-5 mm. Legg en pipette med en blanding av 1 mM ATP og 10 μM Alexa 594 for å visualisere pipette spissen under Epi-fluorescerende lampe og to-Foton mikroskop.
- Monter glasset mikro-pipette på en patch klemme holderen og koble den til en luft pumpe. Sett pumpen holder trykket til 0 PSI.
- Bruk røde Epi-fluorescerende lys, Fokuser på pipette spissen med 5x målet. Plasser glass mikro-pipette inn i aCSF over agarose. Juster holde trykket av luft pumpen til 0,2 PSI. En liten rød Sky kan observeres mate ut av pipette spissen i aCSF. Dette er for å hindre tilstopping under pipette innsetting.
- Velg en av de markerte stedene i RFP ' Map ' som destinasjon. Beveg pipette spissen til det horisontale planet på dekselet glass kanten med 30 μm avstand, omtrent peker mot målet i x-y flyet.
- Senk dråpe spissen forsiktig inn i z-aksen under dekkglass Seddelen. Deretter begynner du å fremme glass pipette mot destinasjonen til ~ 500 μm over hjerne overflaten. Bytt fokus ofte mellom dekkglass kanten, pipette spissen og hjernen overflaten, noe som gjør at det er nok ledig plass for å flytte pipette.
- Endre målsettingen til 25x. Midtstill pipette spissen på nytt og før pipette spissen videre mot destinasjonen på RFP ' kart '. Hold pipette spissen i det agarose laget.
- Når pipette spissen er ~ 100 μm over hjernen overflaten, bytte Imaging modus til to-Foton mikroskopi. Fokuser på et mål sted der å blåse. Skriv ned x-, y-koordinatene (x0, y0) og dybden under overflaten (z0). Beregn koordinatene til innsettingspunktet på hjerne overflaten (xi, yi) som følger:
xi = x0 + z0 /tan θ
yi = y0
der θ er vinkelen mellom pipette holderen og horisontalplanet. - Plasser pipette spissen på koordinatene (xi, yi) på hjerne overflaten. Sett inn pipette forsiktig og langsomt til den når (x0, y0, z0). Hvis et fartøy er i veien for en innsettings bane, trekker du ut pipette og beregner andre innsettings koordinater og bane på nytt. eller vri på scene platen litt (som indikert i figur 1A).
- Sett pumpen holder trykket på 0 PSI og utstøting Trykk på 10-15 PSI. Puff ATP for 200-400 MULTIPLE SCLEROSIS for målet plasseringen i løpet av to-Foton tenkelig. Juster trykket og varigheten av damper for hver pipette og over tid som forklart i diskusjons delen.
5. Hyperstack to-Foton tenkelig
- Utføre eksperimenter ved hjelp av to-Foton mikroskop og en 25 x 1,0 NA vann-nedsenking mål med piezo motor. Sett eksitasjon bølgelengde til 900 NM. Filtrer utsendt lys for å samle rødt lys fra DsRed (pericytes)/tetramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) farging blodplasma og grønt lys fra FITC-dextran (blodplasma)/GCaMP6 (GFP, astrocytic kalsium).
- Produser en høyoppløselig z-stabel på plasseringen av interesse som inneholder en gjennomtrengende arteriole, en 1St ordre kapillær, en 2nd ordre kapillær og muligens nabo fluorescerende celler (f. eks, pericytes, astrocytter). Bestem x * y * z volumet av hyperstack Imaging ved å inkludere 3D-strukturen i blodkarene så mye som mulig. Den totale høyden på hver stabel kan variere fra 30-50 μm, mens x-y flyet dekker omtrent et område på 60 μm x 40 μm.
- Sett bildet stabelen i tenkelig programvare som skal bestå av 8-10 fly med en Inter-Plane avstand på 4-5 μm. Piezo-målet stopper på hvert nivå på z-aksen for å få bildet av hvert plan. Samplingsfrekvensen er 1 s per stabel og piksel oppløsning i x-y-planet er 0,2-0,3 μm (figur 2A). En innspilling normalt inkluderer 10 pre-puff bilde stabler og 150 etter Puff bilde stabler.
6. data behandling
- Behandle data ved hjelp av skreddersydd analytisk programvare. Flat hvert bilde stabelen til ett bilde av maksimal intensitet projeksjon (figur 2B). Tegn et rektangulært område av interesse (ROI) med en bredde på 3 μm vinkelrett over fartøyet av interesse (figur 2C).
- For å minimere interferens fra skygger av røde blodlegemer og fra mindre vibrasjoner i cortex, gjennomsnittlig den rektangulære AVKASTNINGEN ved å projisere den til en linje, som deretter representerer den gjennomsnittlige profilen til fartøyet segmentet. Gjør dette for hvert bilde med maksimal intensitet.
- Plott profil linjene som et 2D-bilde med x-aksen som representerer bilder med maksimal intensitet i kronologisk rekkefølge (figur 2D, øvre panel). Bruk en aktiv kontur algoritme (Chan-vese segmentering) for å finne kantene på fartøyet8,9 (indikert med røde kurver; Figur 2 D, øvre panel).
- Beregn tiden løpet av diameteren endres som forskjellen mellom kantene av blodkaret (vertikal avstand mellom de øvre og nedre røde kurvene i figur 2D, nedre panel). Normalisere diameter endringer til pre-damper diameter Baseline og plot kurver av diameter endres over tid. Gjør dette for hver ROI (figur 2E).
- Amplituden til fartøyets respons er definert som høyeste/laveste topp amplitude etter damper. Responsen latency er definert som ventetid på halv-Max amplitude (figur 2G). Manuelt spore skeletonized Vaskulær struktur ved å plassere noder langs fartøyene (figur 2F) og måle geografisk avstand mellom hver avkastning og gjennomtrengende arteriole. Beregn CVR hastighet ved å dele avstandene med forsinkelse forskjeller.
7. viral vektor injeksjon
- For å samtidig studere astrocytic kalsium respons, injisere et volum på 0,6 μL viral vektor (pZac 2.1 gfaABC1D-LCK-GCaMP6f, Addgene) inn i somatosensory cortex av NG2DsRed mus, etter standard stereotactic viral vektor injeksjon prosedyre 10i.
- Etter tre uker, astrocytter i mus somatosensory cortex uttrykke genetisk kodet kalsium indikator, GCaMP6f. Følg den nevnte kirurgiske prosedyren og to-Foton Imaging for mus. For å skille mellom astrocytter og fartøy Lumina, TRITC-dextran stedet for FITC-dextran brukes til å beis fartøyet Lumina rødt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når operasjonen var ferdig, ble musene transportert til to-Foton mikroskop (figur 1A). Et glass mikro-pipette som inneholder 1 mM ATP ble satt inn i nærheten av destinasjonen blodkaret på målet sted (figur 1B).
Vi utførte hyperstack Imaging samtidig som det gir en puff av 1 mM ATP (figur 2a, supplerende video 1). Hvert bildes takken ble slått sammen til ett bilde av maksimal intensitet projeksjon (figur 2B). Rektangulære ROIs ble plassert vinkelrett over fartøyet for å måle fartøyet diameter endring på ATP damper (figur 2C). Fartøyets diametre ble målt ved hjelp av Chan-vese segmentering (figur 2D). I single puff innspillinger, normalisert diameter endringer på hver ROI ble kledde å sammenligne svarene av ulike fartøy segmenter (figur 2E). Avstanden fra hver ROI til gjennomtrengende arteriole ble beregnet for hånd-tegning det vaskulære skjelettet (figur 2F). Amplituder og latencies av utvidelse og innsnevring ved hver ROI i single puff innspillinger ble plottet over de beregnede avstander fra ROIs til den gjennomtrengende arteriole (figur 2H-K). Vasodilatasjon upon damper spredte lineært med en hastighet på 14,69 μm/s (oppstrøms) og 2,8 μm/s (nedstrøms), starter fra krysset av 1m og 2nd bestille blodkar (figur 2H). Vasokonstriksjon også overført lineært på 3,92 μm/s, fra den gjennomtrengende arteriole (figur 2I). Maksimal amplitude av både vasodilatasjon og vasokonstriksjon oppstod i 1St Order blodkar (figur 2J-K).
Videre kombinerer astrocytt-spesifikke viral vektor-bærer fluorescerende kalsium indikatorer og to-Foton hyperstack Imaging, astrocytic kalsium svar til ATP damper ble undersøkt (Figur 3A, utfyllende video 2 ). Rektangulære ROIs ble plassert på astrocytic somata og prosesser. ATP indusert en økning i intracellulære kalsium i astrocytic prosesser, men ikke i astrocytt somata (Figur 3B).
Figur 1 : Diagram av in vivo to-Foton 3D-avbildning og glass micropipette damper. (A) anesthetized musen er hode-festet til en metall bar og mekanisk ventilert. End-tidevanns CO2 overvåkes av en capnograph. Både whisker pad stimulering og mikro-pipette damper brukes til å indusere vaskulær diameter endringer. Glass mikro-pipette holderen er montert på scenen plate. Lårarterien og venen er kateteriseres for å overvåke blodtrykk og blodgasser, og for å sette mot henholdsvis anestesi-og fluorescein. (B) glass dekkglass dekker kraniotomi i vinkel, noe som gir fri bevegelighet av pipette. Den damper mikro-pipette er plassert i nærheten av en gjennomtrengende arteriole og blodkar og inneholder en blanding av 10 μM Alexa 594 (rød farge i glass mikro-pipette) og 1 mM ATP. Det to-Foton tenkelig er en rask og repeterende 3D kvantum skanning det inkluderer det gjennomtrengende arteriole og det for det første få ordre blod, likeledes idet nabo astrocytter og pericytes. (C) representative bilder av rødt fluorescerende PROTEIN (RFP) og grønt fluorescerende PROTEIN (GFP) ved hjelp av Epi-fluorescerende belysning vises. De brukes som "kart" under pipette innsetting. Røde sirkler markerer plassering av 1St Bestill blodkar med > 5% vasodilatasjon under whisker pad stimulering. Scale bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : ATP damper av mikro-pipette induserer fartøy utvidelse, etterfulgt av innsnevring. (A) Cascade av fly i en representativ bilde stabel inkludert gjennomtrengende arteriole og 1m og 2nd Bestill blodkar. Pericytes er merket med en rød fluoroforen (NG2-DsRed) og fartøyets lumen er merket med FITC-dextran (grønn). (B) maksimal intensitet projeksjon av bildet stabelen. (C) flere unikt fargede områder av interesse (ROIs) plasserte vinkelrett over blodkar for å måle fartøyets diameter. (D) topp, representative fluorescerende intensitet over tid ved den mørkeblå avkastningen fra panel C. De to røde kurvene definerer kantene på fartøy veggen. Den vertikale avstanden mellom de to røde kurvene er fartøyets diameter og vises som en funksjon av tid (nederst). (E) normalisert diameter endringer over tid på hver avkastning som svar på 1 mm ATP damper. Målingene baseres på ett enkelt eksperiment. (F) det vaskulære skjelettet ble manuelt sporet ved å plassere noder langs fartøyene. (G) amplituder av utvidelse eller innsnevring ble definert som maksimal positiv eller negativ vaskulær respons, henholdsvis under opptaks økten. Ventetiden for dilations og constrictions ble rapportert som tid til halv positiv eller negativ maksimal etter damper. (H-K) Grafer viser ventetiden for utvidelse (H), ventetiden for innsnevring (i), amplituden til utvidelse (J), og amplituden til innsnevring (K) av alle ROIs som vises i panel C versus avstanden til hver ROI fra gjennomtrengende arteriole. Den stiplede linjer representerer lineær montering av oppstrøms og nedstrøms ledende svar. pa: gjennomtrengende arteriole. Scale bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : ATP damper av mikro-pipette induserer astrocytic kalsium aktiviteter. (A) Astrocytic viral vektorer bærer en fluorescerende kalsium indikator ble injisert i mus somatosensory cortex tre uker før den eksperimentelle prosedyren. Bildet viser fartøyet Lumina merket med TRITC-dextran (rød) og astrocytic kalsium i grønt. (B) flere ROIs er plassert på astrocytic somata og prosesser. Ved 1 mM ATP damper, økt intracellulære kalsium i astrocytic prosesser, men ikke i somata (prikkete bokser), der kalsium nivåer større enn gjennomsnittet pluss 1,5 x standardavvik ble definert som signifikant. Scale bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Utfyllende video 1: time-Series-filmen flatet ut fra hyperstack avbildning av fartøy som svar på damper av 1 mm ATP. Grønn: FITC-dextran, farging fartøy lumen. Rød: NG2DsRed, farging pericytes. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende video 2: time-serie film flatet fra hyperstack Imaging av astrocytic kalsium som svar på damper av 1 mm ATP. Grønn: astrocytic kalsium. Rød: TRITC-dextran, farging fartøy lumen. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En utfordring for vaskulær studier er nøyaktig måling av fartøy diametere. Metoden vi beskriver her brukt en motorisert piezo mål å gjøre raske og repeterende hyperstack Imaging av to-Foton mikroskopi. For det første tillater denne metoden gjentatte undersøkelser av gjennomtrengende arteriole, 1St. orden og 2nd bestille blodkar uten tap av fokus og førte til oppdagelsen av langsomt utført vaskulær svar i blodkar in vivo. Dernest, i kombinasjon med en viral vektor injeksjon teknikk, gjør det oss til å undersøke astrocytic kalsium responser i tre dimensjoner, som er nødvendig for studier av blodstrøm regulering.
Denne metoden er ikke uten begrensninger. For det første er et smalt rektangulært synsfelt definert før 3D-Imaging for å oppnå høy Temporal oppløsning. Dette begrenser vanligvis Imaging til tre første ordre av blodkar. For det andre må lasere av to-Foton mikroskop være perfekt justert. Laser forskyvning vil feilaktig de-Center hver ramme og øke fartøy diameter måling. For det tredje, det prøving rate av 3D tenkelig er dugelig av fanger langsom CVRs og langsom kalsium endre inne astrocytter. 1-2 Hz per stabel er fortsatt ikke rask nok til å studere fast CVRs11 eller raske kalsium signaler i astrocytter12,13.
Videre, for å påvirke fartøy av interesse lokalt, har vi optimalisert prosedyren for presis innsetting av et glass mikro-pipette til en bestemt plassering av musen cerebral cortex. Det er flere kritiske trinn for vellykket bruk av denne metoden. For det første, vinkelen på glasset mikro-pipette holderen må være nøye justert. Det bør la mikro-pipette fritt manøvrere under målet og glasset dekkglass over eksponert cortex. For det andre, under innsetting av glasset mikro-pipette inn i agarose lag og cortex, et lite Holding press er nødvendig for å holde pipette spissen tilstoppet. Imidlertid må forsiktighet utøves ikke å bruke for stor et holde trykk slik at sammensatt ikke lekker før damper. For det tredje bør damper av pipette testes i agarose lag over hjernen for å finne den optimale trykk og varighet slippe nok damper sammensatte på en puff mens ikke innføre en åpenbar forskyvning av celler og fartøy på grunn av mekaniske Press.
For å gjøre mer presis måling av CVR hastighet, bør volum skanning hastighet forbedres. Det finnes andre nylig utviklede mikroskop for volum skanning, for eksempel et mikroskop med to foton og en akustisk optisk beskyttelsesdeksel (AOD) skanner så raskt som 5 volumer per sekund med samme romlig oppløsning og volum størrelse (e-postkommunikasjon). Lys-ark mikroskop skanne enda en større volum størrelse (350 μm x 800 μm x 100 μm) med 10 volumer per sekund14.
Vår mus forberedelse har også begrensninger. Akutt mus kirurgi kan ha potensielle komplikasjoner. Smertelindring medisin og anestesi kan påvirke nevrovaskulære responser. Akutte nevroinflammasjon kan også utløses, noe som resulterer i mikrogliaaggregater aktivering og leukocytose i kortikale vev og fartøy. Selv om størrelsen på glass mikro-Pipetter vanligvis er svært små (< 1 μm), kan innsetting prosedyren og ATP damper også potensielt utløse mikrogliaaggregater migrasjon og embracement av innsetting området innen 0,5-1 time etter innsetting.
I konklusjonen, kombinasjonen av 3D Imaging i to-Foton mikroskopi og lokaliserte damper glass mikro-pipette er et avansert verktøy for å studere nevrovaskulære aktiviteter og deres mekanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Lundbeck Foundation, NOVO-nordisk Foundation, det danske Rådet for uavhengig forskning | Medical Sciences, og NORDEA Foundation Grant til Center for sunn aldring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
