Summary
نقدم إجراء طرد محلي محسّن باستخدام ماصة زجاجية صغيرة وطريقة تصوير سريعة من اثنين من الفوتونات، والتي تسمح بقياس دقيق للتغيرات في القطر الشعري والتحقيق في تنظيمه في ثلاثة أبعاد.
Abstract
الحفاظ على وظيفة الدماغ العادية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية من قبل شبكة معقدة من السفن. ومع ذلك، فإن تنظيم تدفق الدم الدماغي (CBF) غير مفهوم بشكل كامل، وخاصة على المستوى الشعري. اثنين من الفوتون المجهري هو أداة قوية تستخدم على نطاق واسع لدراسة CBF وتنظيمها. حاليا، هذا المجال محدود بسبب عدم وجود دراسات في الجسم الحي باثنين من الفوتون المجهري دراسة (1) استجابات CBF في ثلاثة أبعاد، (2) الاستجابات الوعائية، (3) التدخلات المحلية داخل شبكة الأوعية الدموية. هنا، ونحن نصف 3D في طريقة الجسم الحي باستخدام مجهرية اثنين فوتون لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت الناجمة عن طرد المحلية من ATP مع الزجاج الماصة الدقيقة. تستخدم طريقتنا التصوير السريع والمتكرر باثنين من الفوتونات لتوفير قياسات دقيقة للقطر من خلال الإسقاط الكثافة القصوى للصور التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، فإننا نظهر أن هذه الطريقة يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة استجابات الكالسيوم الفلكية 3D. كما نناقش مزايا وقيود إدراج الماصة الصغيرة الزجاجية والتصوير باثنين من الفوتونات هايبرستاك.
Introduction
الدماغ لديه معدل استهلاك الطاقة عالية. حوالي 20٪ من الأكسجين و 25٪ من الجلوكوز المستهلكة من قبل جسم الإنسان مكرسة لوظيفة الدماغ، في حين أن الدماغ لا يحتل سوى 2٪ من كتلة الجسم الإجمالية. الحفاظ على وظيفة الدماغ الطبيعية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية عن طريق تدفق الدم في شبكة معقدة من الأوعية. يتم الجمع بين نشاط الدماغ المحلي وتدفق الدم الدماغي (CBF) بقوة، اعتمادا على الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية، الخلايا النجمية، pericytes، خلايا العضلات الملساء (SMCs) والخلايا البطانية (ECs)1. في الآونة الأخيرة، ظهرت أول عدد قليل من أوامر الشعيراتالدموية المتفرعة من الأرتيريولس اختراق ك 'نقطة ساخنة' 2، مما يدل على تنظيم نشط لتدفق الدم الشعرية. تم اكتشاف استجابة الأوعية الدموية بطيئة أجريت (CVR) في هذه 'نقطة ساخنة' في القشرة الحسية الجسدية الماوس خلال كل من تحفيز شعيرات وطرد المحلية (النفخ) من ATP مع الزجاج الماصة الدقيقة3.
على الرغم من أن التصوير في الجسم الحي بواسطة اثنين من الفوتون اتّشِر المجهري الفلورسنت على نطاق واسع لدراسة استجابات الأوعية الدموية العصبية في القشرة الدماغية، فإن معظم الدراسات قامت بقياس أقطار الأوعية الدموية وبحثت في تنظيمها في ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) × y مستوى. التحديات هي: أولا، والأوعية الدموية الدماغية واحتضانها الخلايا النجمية، pericytes والشركات الصغيرة والمتوسطة بناء فروع في ثلاثة أبعاد (3D). ولذلك فمن الأهمية بمكان دراسة تفاعلاتها في 3D. ثانيا، حتى كمية صغيرة من الانجراف في التركيز سوف تؤثر على القياس الدقيق لكل من أقطار السفن وإشارات الفلورسنت الخلوية. وأخيراً، فإن تقارير السير الذاتية سريعة وبعيدة المدى في ثلاثة أبعاد. المسح الضوئي للحجم ثلاثي الأبعاد هو الأمثل للكشف عن CVRs والكشف عن آلياتها. نفذنا هدف محرك بيزو في المجهر اثنين من الفوتون لدراسة الماوس القشرة الحسية الجسدية في الجسم الحي، مما يسمح قياسات قطر دقيق من قبل التوقعات كثافة قصوى من الصور التي تم الحصول عليها.
وقد استخدمت في كثير من الأحيان الزجاج الماصات الصغيرة لفي دراسات الدماغ فيالجسم الحي، على سبيل المثال، لتحميل الجزء الأكبر الأصباغ العضوية 4، سجل EEGs5 والتصحيح لقط6. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود. عادة، يتم وضع طرف الماصة الصغيرة الزجاج بشكل غير دقيق، أو لا يتم استخدام الماصة الصغيرة للتدخلات المحلية. هنا، قمنا بتحسين إجراء الإدراج الماصة الدقيقة والإخراج المحلي.
وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين الفحص المجهري ثلاثي الدناضوئي والمؤشرات الفلورية المشفرة وراثياً يوفر فرصة غير مسبوقة للتحقيق في اقتران الأوعية الدموية العصبية في نطاق ثلاثي الدمركبة. في هذه الدراسة، استفدنا من هذا وحقن ناقلات الفيروسية تحمل مؤشرات الكالسيوم محددة وراثيا ترميز وراثيا في القشرة الحسية الماوس. تم تصوير الخلايا النجمية وكذلك أقطار الأوعية في وقت واحد من خلال الجمع بين علامات الفلورسنت المختلفة.
بشكل عام، نقدم طريقة محسنة للطرد المحلي (النفخ) بواسطة الماصة الزجاجية الدقيقة والتصوير السريع ثنائي الفوتون hyperstack، والذي يسمح بقياس دقيق للتغيرات في القطر الشعري. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا طريقة توفر أداة جديدة لدراسة في وقت واحد ملامح 3D من الاستجابات Ca2 + في الخلايا النجمية والاستجابات قطر الأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت اللجنة الوطنية الدانمركية للأخلاقيات على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقاً للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في اتفاقية المجلس الأوروبي لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة في الأغراض التجريبية وغيرها من الأغراض العلمية. كانت متوافقة مع المبادئ التوجيهية للوصول. هذا هو إجراء المحطة الطرفية مع الفئران يجري القتل الرحيم قبل الانتعاش مخدر.
1. التحضير قبل الجراحة
- تنظيف الجدول الجراحي وجميع المناطق المحيطة بها مع الإيثانول 70٪. تنظيف وتجفيف الأدوات الجراحية قبل الجراحة.
- التخدير ماوس NG2DsRed (Tg (Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J؛ كلا الجنسين؛ 4-8 أشهر من العمر) عن طريق حقن الكيتامين الكليوم + xylazine (60 ملغ / كغ + 10 ملغ / كغ) المذابة في الماء المعقم، الرقم الهيدروجيني 7.4. إعطاء جرعات تكميلية من الكيتامين (30 ملغ / كغ) كل 25 دقيقة حتى الانتهاء من العملية الجراحية. تحقق من ردود الفعل التي للمُل وأصابع القدم بانتظام للتحقق من عمق التخدير.
- حقن ملحي تحت الجلد في أربعة مواقع مختلفة على الجزء الخلفي من الماوس لحجم إجمالي 1 مل لمنع الجفاف أثناء التجربة. لحماية العينين من الجفاف، وتطبيق زيوت التشحيم العين. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام مسبار درجة حرارة المستقيم وبطانية التدفئة.
2. العمليات الجراحية
- فغر الرغامى
- ضع الفأر على ظهره. حقن 0.04 مل من 0.5٪ ليدوكائين تحت الجلد تحت الجلد تحت الشق المخطط لها والانتظار لمدة 2 دقيقة. فصل الغدد تحت الفك السفلي وعضلات الغدة الدرقية، ومن ثم فضح القصبة الهوائية.
- جعل القصبة الهوائية بين اثنين من حلقات القصبة الهوائية مع مقص. أدخل أنبوبمعدني صغير بطول 16.2 مم وقطره 1 مم في القصبة الهوائية. ربط الأنبوب إلى جهاز التنفس الصناعي الميكانيكية وcapnograph لمراقبة CO2 نهاية منتهية الصلاحية (الشكل1A).
- إدخال القسطرة
- حقن 0.5٪ ليدوكائين (0.04 مل) تحت الجلد تحت الجلد تحت الشق المخطط لها والانتظار لمدة 2 دقيقة.
- باستخدام ملقط طرف غرامة بلطف فصل الشريان من الوريد. وقف تدفق الدم في المنبع مع المشبك الأوعية الدموية الدقيقة. تضيق تدفق الدم في المصب مع خياطة النايلون 10-0 ربط كلتا الأوعية الدموية.
- استخدم مقص تشريح دقيق لإجراء شق صغير في كل من الشريان والوريد. أدخل القسطرة البلاستيكية في كلتا الأوعية الدموية. تأمين القسطرة عن طريق تشديد الغرز (8-0 أو 10-0 الغرز النايلون تعتمد على حجم السفينة) دون المساس التجويف القسطرة. إزالة المشبك الأوعية الدموية الدقيقة وإغلاق الجلد.
- مراقبة ضغط الدم عن طريق القسطرة الشريانية. قياس مستويات غازات الدم في عينات الدم الشريانية (50 ميكرولتر) قبلوبعد كل تجربة (القيم العادية: pO 2، 90-120 مم زئبق؛ pCO2،35-40 mmHg؛ درجة الحموضة، 7.25-7.45) باستخدام محلل غاز الدم. استخدم قسطرة الوريد لضخ الفلورسين والتخدير.
- استئصال الجمجمة
- انزعي الفراء من رأس الفأر بين الأذنين. حقن 0.04 مل من 0.5٪ ليدوكائين تحت الجلد تحت الجلد تحت الشق المخطط لها والانتظار لمدة 2 دقيقة.
- مسح الجمجمة باستخدام محلول كلوريد الحديد 10٪ لإزالة periosteum. شطف الجمجمة جيدا مع المالحة. الغراء شريط الرأس المعدنية إلى الجمجمة مع الغراء cyanoacrylate والمنشط (الشكل1A).
ملاحظة: يبلغ طول شريط الرأس المعدني 75 مم وعرضه 13.5 مم، مع ثقب دائري قطره 5 مم في المركز. - حفر استئصال الجمجمة 4 مم قطرها، وتتركز في 0.5 ملم وراء و 3 ملم إلى يمين بريغما على القشرة برميل الحسية الحق. إزالة دورا مع متوسع السفينة غرامة غيض.
- تغطية القشرة المكشوفة مع هلام أغاروز 0.75٪، المذاب في السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (aCSF؛ درجة الحموضة = 7.4) وتبريدها إلى 35 درجة مئوية. تغطية 80-90٪ من استئصال الجمجمة مع غطاء زجاجي بزاوية 10-15 درجة إلى شريط الرأس المعدني (الشكل1ب)الذي يسمح بإدراج ووضع الزجاج الماصة الصغيرة.
- لتقليل نبض الدماغ، الغراء زوايا الزجاج coverslip على شريط الرأس المعدني مع الغراء cyanoacrylate والمنشط. تطبيق المنشط بعناية لمنع الحصول على الدماغ المعرضة. شطف غطاء الزجاج لصقها تماما مع المالحة بعد ذلك.
- قم بإجراء إدخال مسبار تحفيز لوحة الشعيرات. إدراج مجموعة من الأقطاب القطبية ثنائية القطب حسب الطلب (طول 8 ملم وسمك 0.25 ملم) بشكل كتابي في الجانب الأيسر من الوجه لتحفيز الأشعة تحت المدارية راموس العصب ثلاثي التوائم المضادة لاستئصال الجمجمة. وضع الكاثود على مقربة من توقف الأشعة تحت المدارية، وإدراج الأنود في العضلات الماستورية7. أداء التحفيز مع محفز كهربائي في كثافة 1.5 مللي ثانية ل1 مللي ثانية في القطارات من 20 ثانية في 2 هرتز.
- عند الانتهاء من الجراحة، وإدارة بولوس من 0.05 مل الفلوريسين إيزوثيوسيانات-dextran (FITC-dextran، 4٪ ث / الخامس، الوزن الجزيئي [MW] 50،000) في الوريد الفخذي لتسمية بلازما الدم. وقف الكيتامين وتبديل التخدير إلى التسريب الوريدي المستمر من α-كلورالوز (17٪ ث / الخامس، التركيز النهائي) مختلطة مع FITC-dextran (2٪ ث / الخامس، التركيز النهائي) في 0.02 مل / 10 غرام / ساعة. حالة التخدير.
ملاحظة: يتم حل كل من فيتك-دإكستران وα-كلورالوز في 0.9٪ محلول ملحي.
3. أول جلسة تصوير بفوتونين
- نقل الماوس إلى مرحلة مجهر تجاري اثنينفوتون (جدول المواد). تحت كل من البروتين الفلورسنت الأحمر (RFP، الشكل 1C) والبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP، الشكل 1C)وسائط الإضاءة epi-الفلورسنت، واتخاذ صورة للقشرة المكشوفة مع هدف 5X. استخدم صورة RFP كـ "خريطة" لإدخال الماصة الزجاجية الدقيقة في الجلسة التالية.
ملاحظة: يتم استخدام "خريطة" GFP للتمييز بين الأوردة / الوريد من الشرايين / arterioles. - قم بإجراء تصوير بفوتونين باستخدام المجهر ذي الفوتونات وهدف غمر المياه بالفتحة العددية 25x 1.0 مع محرك بيزو. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 900 نانومتر. البحث في القشرة واتبع كل الشريان اختراق والعثور على فروعها الأفقية (1st ترتيب الشعيرات الدموية).
- صورة اختراق arterioles و1st ترتيب الشعيرات الدموية في بقية وخلال تحفيز لوحة شعيرات. راجع معلمات التصوير التفصيلية في القسم 5.
- وضع علامة على مواقع الشعيرات الدموية من الدرجةالأولى مع > 5٪ توسع الأوعية أثناء تحفيز وسادة الشعيرات على 'خريطة' RFP (الشكل1C). تعتبر المواقع مع <5% توسع الأوعية خارج منطقة قشرة برميل الشعيرات.
ملاحظة: في حالة استخدام الفئران من النوع البري بدلاً من الفئران NG2DsRed في التجربة، يتم استخدام صورة GFP كـ 'خريطة' بدلاً من ذلك.
4. إدراج الزجاج الماصة الصغيرة
- إعداد الزجاج الماصات الصغيرة للنفخ باستخدام سحبماصة (جدول المواد). الزجاج الماصات الصغيرة لديها مقاومة من 3-3.5 MΩ وطول تفتق من 4.5-5 ملم.
- جبل الزجاج مايكرو ماصة على حامل المشبك التصحيح وتوصيله إلى مضخة الهواء. تعيين ضغط المضخة عقد إلى 0 رطل لكل بوصة مربعة.
- باستخدام الإضاءة الحمراء epi-الفلورسنت، والتركيز على طرف ماصة مع الهدف 5X. ضع الماصة الزجاجية الدقيقة في الـ aCSF فوق الأجاروز. ضبط ضغط عقد مضخة الهواء إلى 0.2 رطل لكل بوصة مربعة. يمكن ملاحظة سحابة حمراء صغيرة تخرج من طرف الماصة في aCSF. هذا هو لمنع انسداد أثناء الإدراج ماصة.
- اختر أحد المواقع التي تم وضع علامة عليها في "خريطة" RFP كوجهة. نقل طرف ماصة إلى المستوى الأفقي من حافة الزجاج غطاء مع مسافة 30 درجة مئوية، مشيرا تقريبا نحو الوجهة في مستوى س ص.
- خفض بعناية غيض ماصة في z-محور تحت غطاء الزجاج زلة. ثم البدء في التقدم في ماصة الزجاج نحو الوجهة حتى ~ 500 ميكرومتر فوق سطح الدماغ. تبديل التركيز في كثير من الأحيان بين حافة الزجاج الغطاء، وطرف ماصة وسطح الدماغ، والتأكد من أن هناك مساحة حرة كافية لنقل ماصة.
- تبديل الهدف إلى 25x. إعادة توسيط طرف الماصات وتقدمت طرف ماصة أبعد نحو الوجهة على "خريطة" RFP. احتفظ بطرف الماصة في طبقة الأجاروز.
- عندما يكون طرف الماصات حوالي 100 ميكرومتر فوق سطح الدماغ، قم بتبديل وضع التصوير إلى مجهرية بفوتونين. التركيز على الموقع المستهدف الذي لنفخة. اكتب إحداثيات x و y (x0، y0) وعمقها أسفل السطح (z0). حساب إحداثيات نقطة الإدراج على سطح الدماغ (xi, yi)على النحو التالي:
xi = x 0 + z0 / تان θ
yi = y0
حيث θ هو الزاوية بين حامل الماصة والمستوى الأفقي. - ضع طرف الماصة على الإحداثيات (xi, yi)على سطح الدماغ. بلطف وببطء إدراج ماصة حتىتصل (x 0، y0،z0). إذا كانت السفينة في طريق مسار الإدراج، سحب ماصة وإعادة حساب إحداثيات الإدراج الأخرى والمسار؛ أو تحويل لوحة المرحلة قليلا (كما هو مبين في الشكل 1A).
- تعيين ضغط المضخة عقد في 0 رطل لكل بوصة مربعة والضغط طرد في 10-15 رطل لكل بوصة مربعة. نفخة ATP ل200-400 مللي ثانية في الموقع المستهدف خلال التصوير باثنين من الفوتون. ضبط الضغط ومدة النفخ لكل ماصة ومع مرور الوقت كما هو موضح في قسم المناقشة.
5. هايبرستاك اثنين من الفوتون التصوير
- إجراء التجارب باستخدام المجهر اثنين فوتون و25 × 1.0 NA المياه الغمر الهدف مع محرك بيزو. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 900 نانومتر. تصفية الضوء المنبعث لجمع الضوء الأحمر من DsRed (pericytes)/tetramethylrhodamine إيزوثيوسيانات-ديإكسترون (TRITC-dextran) تلطيخ بلازما الدم والضوء الأخضر من FITC-dextran (بلازما الدم)/GCaMP6 (GFP، الكالسيوم الفلكي).
- إنتاج عالية الدقة z-المكدس في موقع الفائدة التي تحتوي على الشريان اختراق، 1st ترتيب الشعرية، و2nd ترتيب الخلايا الشعرية وربما المجاورة (على سبيل المثال، pericytes، الخلايا النجمية). حدد حجم x*y*z من التصوير الفائق المكدس من خلال تضمين الهيكل ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية قدر الإمكان. قد يختلف الارتفاع الإجمالي لكل كومة من 30-50 ميكرومتر، في حين أن الطائرة x-y تغطي تقريبا مساحة 60 ميكرومتر × 40 ميكرومتر.
- تعيين كومة الصورة في برنامج التصوير لتكون تتألف من 8-10 طائرات مع مسافة بين الطائرات من 4-5 ميكرومتر. يتوقف الهدف بيزو موتور في كل مستوى على محور z للحصول على صورة كل طائرة. معدل أخذ العينات هو 1 ثانية لكل كومة ودقة بكسل في مستوى x-y هو 0.2-0.3 ميكرومتر (الشكل2A). يتضمن تسجيل واحد عادة 10 مكدسات صور ما قبل النفخة و 150 مكدسات صور ما بعد النفخة.
6 - تجهيز البيانات
- معالجة البيانات باستخدام برامج تحليلية مخصصة. تسطيح كل كومة صورة في صورة واحدة عن طريق الإسقاط كثافة قصوى (الشكل2ب). رسم منطقة مستطيلة ذات أهمية (ROI) بعرض 3 ميكرومتر عمودياً عبر وعاء الفائدة (الشكل2C).
- لتقليل التداخل من ظلال خلايا الدم الحمراء ومن الاهتزازات الطفيفة للقشرة، متوسط عائد الاستثمار المستطيل عن طريق إسقاطه في سطر واحد، والذي يمثل بعد ذلك متوسط ملف تعريف الجزء من السفينة. القيام بذلك لكل صورة كثافة قصوى.
- رسم خطوط الملف الشخصي كصورة 2D مع محور س يمثل الصور كثافة قصوى في الترتيب الزمني (الشكل2D،اللوحة العليا). استخدام خوارزمية كفاف نشطة (تشان فيسي التقسيم) للعثور على حواف السفينة8،9 (المشار إليها من قبل منحنيات حمراء؛ الشكل 2 D،اللوحة العلوية).
- حساب مسار الوقت من قطر يتغير كما الفرق بين حواف الأوعية الدموية (المسافة الرأسية بين المنحنيات الحمراء العليا والسفلى في الشكل 2D،لوحة أقل). تطبيع التغيرات القطر إلى خط الأساس قبل النفخ قطر ومنحنى مؤامرة من قطر تغيير مع مرور الوقت. القيام بذلك لكل عائد الاستثمار (الشكل2E).
- يتم تعريف سعة استجابة السفينة على أنها أعلى / أدنى السعة الذروة بعد النفخ. يتم تعريف زمن الوصول استجابة كما الكمون من السعة نصف ماكس (الشكل2G). تتبع يدويا هيكل الأوعية الدموية الهيكل العظمي عن طريق وضع العقد على طول السفن (الشكل2F)وقياس المسافة الجغرافية بين كل عائد الاستثمار والشريان اختراق. حساب سرعة CVR عن طريق تقسيم المسافات حسب فروق زمن الوصول.
7. حقن ناقلات الفيروسية
- من أجل دراسة استجابات الكالسيوم الفلكية في وقت واحد، حقن حجم من متجه الفيروسية 0.6 ميكرولتر (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f، Addgene) في القشرة الحسية الجسدية للفئران NG2DsRed، بعد إجراء حقن ناقلات مجسمة مجسمة القياسية 10.
- بعد ثلاثة أسابيع، عبّرت الخلايا النجمية في قشرة السماتوالحسية الماوسة عن مؤشر الكالسيوم المرمز وراثياً، GCaMP6f. اتبع العملية الجراحية المذكورة أعلاه والتصوير بالفوتونللفئران. للتمييز بين الخلايا النجمية وlumina السفينة، يستخدم TRITC-dextran بدلا من FITC-dextran لوصمة عار السفينة لومينا الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وبمجرد الانتهاء من الجراحة، تم نقل الفئران إلى المجهر اثنين من الفوتون (الشكل1A). وأدخلت ماصة زجاجية صغيرة تحتوي على 1 mM ATP على مقربة من الأوعية الدموية الوجهة في الموقع المستهدف (الشكل1باء).
قمنا بإجراء التصوير hyperstack في حين إعطاء نفخة من ATP 1 mM (الشكل 2A، فيديو تكميلي 1). تم تسوية كل كومة صورة إلى صورة واحدة عن طريق الإسقاط كثافة قصوى (الشكل2B). تم وضع ROIs مستطيلة عموديا عبر السفينة لقياس تغير قطر السفينة على نفث ATP (الشكل2C). تم قياس أقطار السفن باستخدام تقسيم تشان فيسي (الشكل2D). في تسجيلات نفخة واحدة، تم تجاوز التغيرات في القطر الطبيعي في كل عائد استثمار لمقارنة استجابات أجزاء السفن المختلفة (الشكل2E). تم حساب المسافة من كل عائد استثمار إلى الشريان اختراق عن طريق رسم باليد الهيكل العظمي الأوعية الدموية (الشكل2F). تم رسم السعة وتأخر التوسع والانقباض في كل عائد استثمار في تسجيلات نفخة واحدة على مسافات محسوبة من ROIs إلى الشريان المخترق (الشكل2H-K). توسع الأوعية عند النفخ نشر خطياً بسرعة 14.69 درجة/ثانية (المنبع) و2.8 ميكرومتر/ثانية (المصب)، بدءاً من تقاطع الشعيرات الدموية 1st و2nd order (الشكل 2H). كما انتشر مضيق الأوعية خطياً عند 3.92 درجة/ثانية، بدءاً من الشريان المخترق (الشكل2I). السعة القصوى لكل من توسع الأوعية ومضيق الأوعية حدثت في الشعيرات الدموية من الدرجةالأولى (الشكل2J-K).
وعلاوة على ذلك، تم التحقيق في الجمع بين مؤشرات الكالسيوم الفلورية ذات النواقل الفيروسية الخاصة بالخلايا النجمية والتصوير باثنين من الفوتونات الفائقة، واستجابات الكالسيوم الفلكية لنفخ ATP (الشكل3A، الفيديو التكميلي 2 ). تم وضع ROIs مستطيلة في somata الفلكية والعمليات. ATP تسبب في ارتفاع في الكالسيوم داخل الخلايا في العمليات الفلكية ولكن ليس في somata الخلايا النجمية (الشكل3B).
الشكل 1 رسم تخطيطي في الجسم الحي اثنين من الفوتون 3D التصوير والزجاج micropipette النفخ. (أ) الماوس التخدير هو الرأس ثابتة إلى شريط معدني والتهوية ميكانيكيا. يتم رصد ثاني أكسيد الكربون في نهاية المد والجزر بواسطة كابنومافي. يتم استخدام كل من تحفيز لوحة الشعيرات والنفخ الماصة الدقيقة للحث على تغييرات قطر الأوعية الدموية. يتم تركيب الزجاج حامل الماصة الصغيرة على لوحة المرحلة. يتم قسطرة الشريان الفخذي والوريد لمراقبة ضغط الدم وغازات الدم، وضخ التخدير والفلورسين، على التوالي. (ب) غطاء الزجاج يغطي استئصال الجمجمة في زاوية، والذي يسمح بحرية حركة ماصة. يتم وضع الماصة الصغيرة النفخ على مقربة من الشريان اختراق وشعيراتها الشعرية ويحتوي على خليط من 10 μM اليكسا 594 (اللون الأحمر في الزجاج الماصة الصغيرة) و1 MM ATP. التصوير ثنائي الفوتون هو مسح حجم 3D سريع ومتكرر يتضمن الأرتيريول اختراق والشعيرات الدموية النظام القليلة الأولى، فضلا عن الخلايا النجمية المجاورة وpericytes. (C) تظهر الصور التمثيلية للبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) باستخدام إضاءة epi-الفلورسنت. يتم استخدامها كـ "خرائط" أثناء إدخال الماصات. الدوائر الحمراء علامة مواقع الشعيرات الدموية1 النظام مع > 5٪ توسع الأوعية أثناء تحفيز وسادة شعيرات. شريط مقياس: 50 درجة مئوية.
الشكل 2 PUFFing ATP بواسطة الماصة الصغيرة يحفز توسع السفينة، تليها انقباض. (أ) تتالي من الطائرات في كومة صورة تمثيلية واحدة بما في ذلك اختراق arteriole و 1st و 2nd ترتيب الشعيرات الدموية. وصفت البيريسيتات مع فلوروفور أحمر (NG2-DsRed) ووصفت لومن السفينة مع FITC-dextran (الأخضر). (B) الإسقاط كثافة قصوى من كومة الصورة. (C) مناطق متعددة ملونة بشكل فريد من الاهتمام (ROIs) وضعت عموديا عبر الأوعية الدموية لقياس قطر السفينة. (D) أعلى، كثافة الفلورسنت ممثل مع مرور الوقت في عائد الاستثمار الأزرق الداكن من لوحة C. يحدد المنحنىان الأحمران حواف جدار السفينة. المسافة الرأسية بين المنحنىين الأحمرين هي قطر السفينة وتظهر كدالة للوقت (أسفل). (E) تغير القطر الطبيعي مع مرور الوقت في كل عائد استثمار استجابة لنفخ ATP 1 mM. وتستند القياسات إلى تجربة واحدة. (F) تم تتبع الهيكل العظمي للأوعية الدموية يدويا عن طريق وضع العقد على طول الأوعية. (ز) تم تعريف السعة من التوسع أو الانقباض على أنها استجابة الأوعية الدموية الإيجابية أو السلبية القصوى، على التوالي، خلال جلسة التسجيل. تم الإبلاغ عن الكمون من التوسعات وتقلصات كوقت إلى نصف الحد الأقصى إيجابية أو سلبية بعد بداية النفخ. (H-K) الرسوم البيانية تظهر الكمون منالتوسع (H)، والكمون من انقباض (ط)، واتساع التوسع (J)،واتساع الانقباض (K)من جميع ROIs المبينة في لوحة C مقابل المسافة من كل عائد الاستثمار من اختراق arteriole. تمثل الخطوط المتقطعة التركيب الخطي للاستجابات الموصلة في المنبع والمصب. p.a.: اختراق arteriole. شريط مقياس: 10 درجة.
الشكل 3 ATP النفخ بواسطة الماصة الدقيقة يحفز أنشطة الكالسيوم الفلكية. (أ) تم حقن النواقل الفيروسية الفلكية التي تحمل مؤشر الكالسيوم الفلورسنت في قشرة الماوس الحسية الجسدية قبل ثلاثة أسابيع من الإجراء التجريبي. تظهر الصورة الإنارة السفينة المسمى مع TRITC-dextran (الأحمر) والكالسيوم الفلكية باللون الأخضر. (B) يتم وضع ROIs متعددة في somata الفلكية والعمليات. على 1 mM ATP النفخ، وزيادة الكالسيوم داخل الخلايا في العمليات الفلكية ولكن ليس في سوماتا (صناديق منقط)، حيث تم تعريف مستويات الكالسيوم أكبر من متوسط زائد 1.5 × الانحراف المعياري بأنها كبيرة. شريط مقياس: 10 درجة.
فيديو تكميلي 1: فيلم من سلسلة الوقت بالارض من التصوير hyperstack من السفن ردا على النفخ من ATP 1 MM. الأخضر: FITC-dextran، تلطيخ التجويف السفينة. الأحمر: NG2DsRed، تلطيخ pericytes. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو تكميلي 2: فيلم من سلسلة الوقت بالارض من التصوير hyperstack من الكالسيوم الفلكية ردا على النفخ من ATP 1 mM. الأخضر: الكالسيوم الفلكي. الأحمر: TRITC-dextran، تلطيخ التجويف السفينة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أحد التحديات التي يواجهها دراسات الأوعية الدموية هو القياس الدقيق لأقطار الأوعية الدموية. الطريقة التي نصفها هنا تستخدم هدف بيزو الآلية لجعل التصوير hyperstack سريعة ومتكررة عن طريق التصوير المجهري اثنين فوتون. أولا، يسمح هذا الأسلوب الفحوصات المتكررة للأرتيريول اختراق، 1st النظام و2 الشعيرات الدموية من أجلالثاني دون فقدان التركيز وأدى إلى اكتشاف استجابات الأوعية الدموية التي أجريت ببطء في الشعيرات الدموية في الجسم الحي. ثانيا، في تركيبة مع تقنية حقن ناقلات الفيروسية، فإنه يمكننا من التحقيق في استجابات الكالسيوم الفلكية في ثلاثة أبعاد، وهو أمر ضروري لدراسات تنظيم تدفق الدم.
لا تتوفر هذه الطريقة بدون قيود. أولاً، يتم تعريف حقل رؤية مستطيل ضيق قبل التصوير ثلاثي الأبعاد من أجل تحقيق دقة زمنية عالية. هذا عادة ما يحد من التصوير إلى أول ثلاثة أوامر من الشعيرات الدموية. ثانيا، يجب أن تكون محاذاة الليزر من المجاهر اثنين فوتون تماما. والليزر عدم المحاذاة كاذبة دي مركز كل إطار وزيادة قياس قطر السفينة. ثالثا، معدل أخذ العينات من التصوير ثلاثي الأبعاد قادر على التقاط CVRs بطيئة وتغيرات الكالسيوم بطيئة في الخلايا النجمية. 1-2 هرتز لكل كومة لا تزال ليست سريعة بما فيه الكفاية لدراسة CVRs سريع11 أو إشارات الكالسيوم السريع في الخلايا النجمية12،13.
وعلاوة على ذلك، من أجل التأثير على الأوعية ذات الأهمية محليا، قمنا بتحسين إجراء الإدراج الدقيق للماصة الدقيقة الزجاجية في موقع محدد من القشرة الدماغية للفأر. هناك العديد من الخطوات الهامة للتطبيق الناجح لهذا الأسلوب. أولا، يجب تعديل زاوية حامل الماصة الصغيرة الزجاج بعناية. وينبغي أن تسمح للماصة الصغيرة للمناورة بحرية تحت الهدف وغطاء الزجاج فوق القشرة المكشوفة. ثانيا، أثناء إدخال الزجاج الماصة الدقيقة في طبقة أجاروز والقشرة، ضغط عقد صغير ضروري للحفاظ على طرف ماصة غير مسدود. ومع ذلك، يجب توخي الحذر بعدم تطبيق ضغط عقد كبير جدا بحيث لا يتسرب المجمع قبل النفخ. ثالثا، ينبغي اختبار النفخ من الماصة في طبقة أجاروز فوق الدماغ للعثور على الضغط الأمثل والمدة الإفراج عن ما يكفي من مركب النفخ على نفخة واحدة في حين لا إدخال إزاحة واضحة من الخلايا والأوعية بسبب الميكانيكية الضغط.
من أجل إجراء قياس أكثر دقة لسرعة CVR، يجب تحسين سرعة المسح الضوئي للحجم. هناك مجاهر أخرى تم تطويرها حديثًا لمسح الحجم، على سبيل المثال، مجهر فوتون ثنائي مع منحرف بصري صوتي (AOD) يقوم بمسح بأسرع 5 مجلدات في الثانية بنفس الدقة المكانية وحجم الحجم (اتصال بالبريد الإلكتروني). تمسح المجاهر ذات الصفائح الخفيفة حجم حجم أكبر (350 ميكرومتر × 800 ميكرومتر × 100 ميكرومتر) مع 10 مجلدات في الثانية14.
لدينا إعداد الماوس أيضا قيود. قد تكون جراحة الماوس الحادة مضاعفات محتملة. قد يؤثر دواء تخفيف الألم والتخدير على استجابات الأوعية الدموية العصبية. ويمكن أيضا أن يؤدي التهاب الأعصاب الحاد، مما أدى إلى تنشيط microglial والكريات البيضاء في الأنسجة القشرية والأوعية الدموية. على الرغم من أن حجم طرف الماصات الصغيرة الزجاجية عادة ما يكون صغيراً جداً (<1 μm)، فإن إجراء الإدراج ونفخ ATP يمكن أن يؤديا أيضًا إلى الهجرة المجهرية واحتضان موقع الإدراج في غضون 0.5-1 ساعة بعد الإدراج.
في الختام، مزيج من التصوير ثلاثي الأبعاد في التصوير المجهري بفوتونين وزجاج النفخ الموضعي الصغير هو أداة متقدمة لدراسة الأنشطة العصبية الوعائية وآليتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم مؤسسة لوندبيك، ومؤسسة نوفو نورديسك، والمجلس الدانمركي للبحوث المستقلة | العلوم الطبية، ومنحة مؤسسة NORDEA لمركز الشيخوخة الصحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
