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Neuroscience

Vivo में तीन-आयाम दो-फोटो माइक्रोस्कोपी अध्ययन करने के लिए स्थानीय एटीपी इंजेक्शन द्वारा एक ग्लास माइक्रो-पिपेट का उपयोग करके संवहनी जवाब आयोजित

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59286
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience, Faculty of Medicine and Health Science, University of Copenhagen, 2Department of Clinical Neurophysiology, Rigshospitalet

Summary

हम एक अनुकूलित स्थानीय निष्कासन प्रक्रिया एक गिलास माइक्रो-पिपेट और एक तेजी से दो-फोटोन हाइपरस्टैक इमेजिंग विधि का उपयोग करके प्रस्तुत करते हैं, जो केशिका व्यास परिवर्तन और तीन आयामों में इसके विनियमन की जांच की सटीक माप की अनुमति देता है।

Abstract

सामान्य मस्तिष्क समारोह के रखरखाव जहाजों के एक जटिल नेटवर्क द्वारा ऑक्सीजन और पोषण की एक पर्याप्त और कुशल आपूर्ति की आवश्यकता है. हालांकि, मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) के विनियमन को अधूरा समझा जाता है, विशेष रूप से केशिका स्तर पर। दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग सीबीएफ और इसके विनियमन का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है। वर्तमान में, इस क्षेत्र में की कमी से सीमित है vivo दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी अध्ययन की जांच (1) तीन-आयामों में CBF प्रतिक्रियाओं, (2) संवहनी प्रतिक्रियाओं का आयोजन किया, और (3) संवहनी नेटवर्क के भीतर स्थानीयकृत हस्तक्षेप. यहाँ, हम एक गिलास माइक्रो-पिपेट के साथ एटीपी के स्थानीय निष्कासन द्वारा प्रकाश में लाया संवहनी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विवो विधि में एक 3 डी का वर्णन। हमारी विधि प्राप्त छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण द्वारा सटीक व्यास माप प्रदान तेजी से और दोहराव hyperstack दो-फोटोन इमेजिंग का उपयोग करता है. इसके अलावा, हम बताते हैं कि इस विधि भी 3 डी astrocytic कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम कांच के माइक्रो-पिपेट प्रविष्टि और दो-फोटोन हाइपरस्टैक इमेजिंग के फायदे और सीमाओं पर भी चर्चा करते हैं।

Introduction

मस्तिष्क एक उच्च ऊर्जा की खपत दर है. ऑक्सीजन के बारे में 20% और मानव शरीर द्वारा भस्म ग्लूकोज का 25% मस्तिष्क समारोह के लिए समर्पित कर रहे हैं, जबकि मस्तिष्क केवल कुल शरीर द्रव्यमान का 2% रह रहे हैं. सामान्य मस्तिष्क समारोह के रखरखाव के लिए जहाजों के एक जटिल नेटवर्क में रक्त प्रवाह द्वारा ऑक्सीजन और पोषण की पर्याप्त और कुशल आपूर्ति की आवश्यकता होती है। स्थानीय मस्तिष्क गतिविधि और मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) मजबूत युग्मित कर रहे हैं, न्यूरॉन्स के कार्यात्मक गुणों पर निर्भर करता है, astrocytes, pericytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (SMCs) और endothelial कोशिकाओं (ईसी)1. हाल ही में, मर्मज्ञ धमनी से शाखा के केशिकाओं के पहले कुछ आदेश एक 'हॉटस्पॉट'2के रूप में उभरा है, जो केशिका रक्त प्रवाह के सक्रिय विनियमन को दर्शाता है। एक धीमी गति से आयोजित संवहनी प्रतिक्रिया (सीवीआर) माउस somatosensory प्रांतस्था में इस 'हॉटस्पॉट' पर दोनों whisker उत्तेजना और एक गिलास माइक्रो-पिपेट3के साथ एटीपी के स्थानीय निष्कासन (puffing) के दौरान की खोज की थी.

हालांकि दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा विवो इमेजिंग में व्यापक रूप से सेरेब्रल कॉर्टेक्स में neurovascular प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अध्ययन के अधिकांश रक्त वाहिका व्यास मापा और एक में उनके विनियमन की जांच की द्वि-आयामी (2डी) x-y विमान. चुनौतियां हैं: सबसे पहले, सेरेब्रल रक्त वाहिकाओं और उनके गले लगाने एस्ट्रोसाइट्स, pericytes और SMCs तीन आयामों (3 डी) में शाखाओं का निर्माण. इसलिए यह 3 डी में उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. दूसरे, यहां तक कि ध्यान में बहाव की एक छोटी राशि दोनों पोत व्यास और सेलुलर फ्लोरोसेंट संकेतों का सटीक माप को प्रभावित करेगा. अंत में, CVRs तेजी से और तीन आयामों में दूरगामी हैं. 3 डी मात्रा स्कैनिंग CVRs का पता लगाने और उनके तंत्र का अनावरण करने के लिए इष्टतम है। हम एक दो-फोटोन माइक्रोस्कोप में एक piezo मोटर उद्देश्य लागू करने के लिए vivo में माउस somatosensory प्रांतस्था का अध्ययन, प्राप्त छवियों की अधिकतम तीव्रता अनुमानों द्वारा सटीक व्यास माप की अनुमति.

ग्लास माइक्रो-पिपेट्स का उपयोग विवो मस्तिष्क अध्ययन में अक्सर किया जाता है, उदाहरण के लिए, थोक-लोड कार्बनिक रंगोंकेलिए 4, रिकॉर्ड ईईजी5 और पैच क्लैम्पिंग6के लिए। फिर भी, सीमाएं बनी हुई हैं। आम तौर पर, कांच माइक्रो-पिपेट की नोक को imprecisely रखा जाता है, या स्थानीय हस्तक्षेप के लिए माइक्रो-पिपेट का उपयोग नहीं किया जाता है। यहाँ, हम माइक्रो-पिपेट प्रविष्टि और स्थानीय निष्कासन की प्रक्रिया को अनुकूलित किया है।

इसके अलावा, 3 डी दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक रूप से एनकोडेड फ्लोरोसेंट संकेतक ों का संयोजन 3 डी दायरे में न्यूरोवास्कुलर युग्मन की जांच करने का एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान करता है। इस अध्ययन में, हम इस का लाभ उठाया और वायरल वैक्टर इंजेक्शन astrocyte विशिष्ट आनुवंशिक रूप से encoded कैल्शियम संकेतक ों माउस somatosensory प्रांतस्था में ले. Astrocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पोत व्यास विभिन्न फ्लोरोसेंट मार्करों के संयोजन के द्वारा एक साथ छवि थे.

कुल मिलाकर, हम कांच माइक्रो-पिपेट और तेजी से दो-फोटोन हाइपरस्टैक इमेजिंग द्वारा स्थानीय निष्कासन (पफिंग) की एक अनुकूलित विधि पेश करते हैं, जो केशिका व्यास परिवर्तन के सटीक माप की अनुमति देता है। इसके अलावा, हमारी विधि एक साथ एस्ट्रोसाइट्स और संवहनी व्यास प्रतिक्रियाओं में Ca2 + प्रतिक्रियाओं के 3 डी प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान करता है।

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Protocol

जानवरों से संबंधित सभी प्रक्रियाओं को डेनिश राष्ट्रीय आचार समिति द्वारा प्रायोगिक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए प्रयुक्त Vertebrate पशुओं के संरक्षण के लिए यूरोपीय परिषद के कन्वेंशन में उल्निर्देशके दिशा निर्देशों के अनुसार अनुमोदित किया गया था और ARRIVE दिशानिर्देशों के अनुपालन में थे. यह चूहों संवेदनाहारी वसूली से पहले euthanized किया जा रहा है के साथ एक टर्मिनल प्रक्रिया है.

1. पूर्व शल्य चिकित्सा तैयारी

  1. 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल टेबल और आसपास के सभी क्षेत्र को साफ करें। सर्जरी से पहले सर्जिकल उपकरणों को अच्छी तरह से साफ और सूखा।
  2. एक NG2DsRed माउस (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; दोनों लिंग; 4-8 महीने पुराने) केटामाइन + जाइलज़ीन के एक peritoneal इंजेक्शन द्वारा (60 mg/kg + 10 mg/kg) बाँझ पानी में भंग, पीएच 7.4. शल्य प्रक्रिया के पूरा होने तक केटामाइन (30 मिलीग्राम/किग्रा) हर 25 मिनट की पूरक खुराक का प्रबंध करें। संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करने के लिए नियमित रूप से पूंछ और टो चुटकी सजगता की जाँच करें।
  3. प्रयोग के दौरान निर्जलीकरण को रोकने के लिए माउस के पीछे चार अलग-अलग स्थानों पर लवणीय रूप से इंजेक्शन लगाते हैं। आंखों को सुखाने से बचाने के लिए, आंख स्नेहक लागू करें। एक गुदा तापमान जांच और हीटिंग कंबल का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर के तापमान को बनाए रखें।

2. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. ट्रैकिओटोमी
    1. माउस को उसकी पीठ पर रखें। योजना बनाई चीरा के तहत 0.04 एमएल के 0.04 एमएल इंजेक्शन और 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। छाती की हड्डी (manubrium) के ऊपर एक 10 मिमी लंबे चीरा बनाओ. सबमैन्डीबुलर ग्रंथियों और स्टर्नोथाइरॉइड मांसपेशियों को अलग करें, और फिर श्वासनली को बेनकाब करें।
    2. कैंची के साथ दो श्वासनली के छल्ले के बीच श्वासनली विज्ञान बनाओ। 16.2 मिमी की लंबाई के साथ एक छोटी धातु ट्यूब डालें और श्वासनली में 1 मिमी का व्यास। अंत-समाप्तिकर्ता सीओ2 (चित्र 1ए) की निगरानी करने के लिए ट्यूब को यांत्रिक वेंटीलेटर और कैप्नोग्राफ से कनेक्ट करें।
  2. कैथेटर निवेशन
    1. योजना बनाई चीरा के तहत 0.5% lidocaine (0.04 एमएल) subcutaneously इंजेक्शन और 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. ठीक टिप बलप्स का उपयोग करके धीरे से नस से धमनी को अलग करें। एक microvascular दबाना के साथ ऊपर रक्त प्रवाह बंद करो. दोनों रक्त वाहिकाओं को लिगाइंग 10-0 नायलॉन सीवन के साथ रक्त प्रवाह को नीचे की ओर संकुचित करें।
    3. धमनी और नस दोनों में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए माइक्रो-डिसेक्टिंग कैंची का उपयोग करें। दोनों रक्त वाहिकाओं में प्लास्टिक कैथेटर डालें. कैथेटर को सीवनों को कसकर सुरक्षित करें (8-0 या 10-0 नायलॉन टांके पोत आकार पर निर्भर) कैथेटर लुमेन समझौता किए बिना। माइक्रोवास्कुलर क्लैम्प निकालें और त्वचा को बंद करें।
    4. धमनी कैथेटर के माध्यम से रक्तचाप की निगरानी करें। प्रत्येक प्रयोग (सामान्य मान: पो2, 90-120 mmHg; pCO2, 35-40 mmHg; पीएच, 7.25-7.45) रक्त गैस विश्लेषक का उपयोग करके धमनी रक्त नमूनों (50 डिग्री सेल्सियस) में रक्त गैसों के स्तर को मापें। फ्लोरेसेइन और संज्ञाहरण के अर्क के लिए नस कैथेटर का उपयोग करें।
  3. क्रैनिओटॉमी
    1. कान के बीच माउस के सिर से फर दाढ़ी. योजना बनाई चीरा के तहत 0.04 एमएल 0.5% lidocaine subcutaneously इंजेक्शन इंजेक्शन और 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. पेरिओस्टेम को हटाने के लिए 10% लौह-क्लोराइड समाधान का उपयोग करके खोपड़ी को साफ करें। नमकीन के साथ अच्छी तरह से खोपड़ी कुल्ला. सायनोऐक्रिलेट गोंद और उत्प्रेरक के साथ खोपड़ी के लिए धातु के सिर की छड़ को गोंद करें (चित्र 1ए)।
      नोट: धातु सिर बार 75 मिमी लंबी और 13.5 मिमी चौड़ा है, केंद्र में 5 मिमी व्यास के एक दौर छेद के साथ.
    3. ड्रिल एक 4 मिमी व्यास craniotomy, पर केंद्रित 0.5 मिमी पीछे और 3 मिमी सही संवेदी बैरल प्रांतस्था पर bregma के सही करने के लिए. एक ठीक टिप पोत विस्फारक के साथ ड्यूरा निकालें.
    4. 0.75% agarose जेल के साथ उजागर प्रांतस्था कवर, कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में भंग (aCSF; पीएच $ 7.4) और 35 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा. कपालके्म के 80-90% को कांच के आवरण के साथ 10-15 डिग्री के कोण पर धातु के शीर्ष छड़ (चित्र 1ठ) को कवर करें जो कांच माइक्रो-पिपेट की प्रविष्टि और स्थान को अनुमति देता है।
    5. मस्तिष्क स्पंदन को कम करने के लिए, कांच के दो कोनों को सिनोऐक्रिलेट गोंद और उत्प्रेरक के साथ धातु सिर पट्टी पर चिपकाएं। उजागर मस्तिष्क पर हो रही रोकने के लिए सक्रियक ध्यान से लागू करें. चिपका हुआ ग्लास कवर को बाद में नमकीन के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें।
  4. whisker पैड उत्तेजना जांच की प्रविष्टि प्रदर्शन. कस्टम बनाया द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड का एक सेट डालें (8 मिमी लंबाई और 0.25 मिमी मोटाई) चेहरे के बाईं ओर में percutaneously craniotomy के लिए trigeminal तंत्रिका contralateral के रैमस इन्फ्राऑर्बिटेलिस को प्रोत्साहित करने के लिए. कैथोड को अंतराल इन्फ्राऑर्बिटेलिस के पास रख दें, और एनोड को चर्वण ीय पेशियों में डालदें। 2 हर्ट्ज पर 2हर्ट्ज पर 20 s की गाड़ियों में 1 एमएस के लिए 1.5 लेकिन की तीव्रता पर एक विद्युत stimulator के साथ उत्तेजना प्रदर्शन.
  5. सर्जरी के पूरा होने पर, रक्त प्लाज्मा लेबल करने के लिए ऊरु शिरा में 0.05 एमएल फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइन-डेक्सट्रान (FITC-dextran, 4% w/v, आणविक वजन [MW] 50,000) के एक बोलस का प्रशासन। केटामाइन को बंद कर दें और एनेस्थेसिया को जेड-क्लोरालोस (17% w/v, अंतिम सांद्रता) के निरंतर अंतःशिरा जलसेक में बदल दें, FITC-dextran (2% w/v, अंतिम सांद्रता) के साथ मिश्रित 0.02 एमएल/10 ग्राम/h. नए के स्थिरीकरण के लिए लगभग आधे घंटे तक प्रतीक्षा करें संवेदनाहारी राज्य।
    नोट: FITC-dextran और जेड-क्लोरैलोज दोनों 0.9% लवण में भंग कर रहे हैं।

3. पहले दो फोटो न इमेजिंग सत्र

  1. माउस को वाणिज्यिक द्वि-फोटोन सूक्ष्मदर्शी (सामग्री सारणी)केचरण में स्थानांतरित करें। दोनों लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के तहत (RFP, चित्रा 1सी) और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, चित्रा 1सी) एपि-फ्लोरोसेंट रोशनी के तरीके, एक 5x उद्देश्य के साथ उजागर प्रांतस्था की एक तस्वीर ले लो. अगले सत्र में कांच माइक्रो-पिपेट को सम्मिलित करने के लिए एक 'मैप' के रूप में RFP चित्र का उपयोग करें।
    नोट: GFP 'मैप' धमनियों /arterioles से नसों /
  2. दो फोटोन माइक्रोस्कोप और piezo मोटर के साथ एक 25x 1.0 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर दो फोटोन इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं। उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 900 एनएम करने के लिए सेट करें। प्रांतस्था खोज और प्रत्येक मर्मज्ञ धमनी का पालन करें और इसकी क्षैतिज शाखाओं (1सेंट आदेश केशिकाओं) पाते हैं।
  3. छवि मर्मज्ञ arterioles और आराम पर और whisker पैड उत्तेजना के दौरान उनके 1सेंट आदेश केशिकाओं. अनुभाग 5 में विस्तृत इमेजिंग पैरामीटर देखें.
  4. RFP 'मैप' पर whisker पैड उत्तेजना के दौरान के साथ 1st आदेश केशिकाओं के स्थानों को चिह्नित करें (चित्र 1ग)। के साथ स्थानों ;lt;5% vasodilation whisker बैरल प्रांतस्था क्षेत्र के बाहर होने के रूप में माना जाता है.
    नोट: प्रयोग में NG2DsRed चूहों के बजाय जंगली प्रकार चूहों का उपयोग करते हैं, तो GFP छवि 'मैप' के बजाय के रूप में उपयोग किया जाता है।

4. कांच माइक्रो-पिपेट की प्रविष्टि

  1. पिपेट खींचने वाले (सामग्री की सारणी) का उपयोग करके पफिंग के लिए कांचकेसूक्ष्म पिपेट तैयार करें। कांच के सूक्ष्म-पिपेट्स में 3-3.5 एम जेड और 4.5-5 मिमी की टेपर लंबाई का प्रतिरोध होता है, जिसमें 1 एम एम एटीपी और 10 डिग्री एम एलेक्सा 594 के मिश्रण के साथ एक पिपेट लोड होता है ताकि एपी-फ्लोरसेंट लैंप और दो-फोटोन माइक्रोस्कोप के तहत पिपेट टिप को विज़ुअल किया जा सके।
  2. एक पैच क्लैम्प धारक पर कांच माइक्रो-पिपेट माउंट और यह एक हवा पंप करने के लिए कनेक्ट। 0 साई के लिए दबाव पकड़े पंप सेट करें।
  3. लाल एपि-फ्लोरोसेंट रोशनी का उपयोग करना, 5x उद्देश्य के साथ पिपेट टिप पर ध्यान केंद्रित करें। काँच के सूक्ष्म-पिपेट को एजेरो सज के ऊपर एसीएसएफ में रखें। वायु पंप के होल्डिंग दबाव को 0.2 साई में समायोजित करें। एक छोटे से लाल बादल aCSF में पिपेट टिप से बाहर निकलने देखा जा सकता है. यह पिपेट प्रविष्टि के दौरान clogging को रोकने के लिए है.
  4. गंतव्य के रूप में RFP 'मानचित्र' में चिह्नित स्थानों में से एक चुनें. 30 डिग्री मीटर दूरी के साथ कवर ग्लास किनारे के क्षैतिज तल पर पिपेट टिप ले जाएँ, मोटे तौर पर x-y विमान में गंतव्य की ओर इशारा करते हुए।
  5. ध्यान से कवर ग्लास पर्ची के तहत z-अक्ष में पिपेट टिप कम करें। फिर मस्तिष्क की सतह से ऊपर $ 500 डिग्री मीटर तक गंतव्य की ओर कांच पाइपेट को आगे बढ़ाना शुरू करें। स्विच फोकस अक्सर कवर ग्लास किनारे, पिपेट टिप और मस्तिष्क की सतह के बीच, सुनिश्चित करें कि पिपेट ले जाने के लिए पर्याप्त मुक्त स्थान है।
  6. 25x करने के लिए उद्देश्य स्विच. पिपेट टिप को फिर से केंद्र में करें और पाइपेट टिप को आगे आरएफपी 'मैप' पर गंतव्य की ओर आगे बढ़ाएं। अगारोस परत में पिपेट टिप रखें।
  7. जब पिपेट टिप मस्तिष्क की सतह से 100 डिग्री सेल्सियस ऊपर है, तो इमेजिंग मोड को दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी पर स्विच करें। एक लक्ष्य स्थान जिस पर पफ करने के लिए पर ध्यान केंद्रित करें। इसके ग, ल् निर्देशांक (ग0, ल्0) तथा इसकी गहराई पृष्ठ के नीचे (ज0) लिखिए। मस्तिष्क की सतह पर सम्मिलन बिंदु के निर्देशांकों की गणना करें (गप ,लi) निम्नानुसार:
    xi ] x0 + z0 /
    yi ] y0
    जहाँ पिपेट धारक और क्षैतिज तल के बीच का कोण है।
  8. मस्तिष्क की सतह पर निर्देशांकों (गi, ल्i) को पिपेट टिप की स्थिति। धीरे-धीरे और धीरे धीरे pippette डालने जब तक यह तक पहुँचता है (x0, y0, z0). यदि कोई पोत सम्मिलन पथ के रास्ते में है, तो पिपेट को वापस लें और अन्य प्रविष्टि निर्देशांकों और पथ की पुनः गणना करें; या अवस्था प्लेट को थोड़ा सा मोड़ें (जैसा कि चित्र 1क में दर्शाया गया है)।
  9. 10-15 साई पर 0 साई और इजेक्शन दबाव पर पंप होल्डिंग दबाव सेट करें। दो-फोटोन इमेजिंग के दौरान लक्ष्य स्थान पर 200-400 एमएस के लिए पफ एटीपी। प्रत्येक पिपेट के लिए और समय के साथ फूलने के दबाव और अवधि को समायोजित करें जैसा कि चर्चा अनुभाग में समझाया गया है।

5. हाइपरस्टैक दो-फोटोन इमेजिंग

  1. दो-फोटोन माइक्रोस्कोप और piezo मोटर के साथ एक 25 x 1.0 NA पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं। उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 900 एनएम करने के लिए सेट करें। DsRed (pericytes) से लाल बत्ती इकट्ठा करने के लिए उत्सर्जित प्रकाश फ़िल्टर / tetramethylrhodamine आइसोथियोसाइनेट-डेक्सट्रान (TRITC-dextran) फिटसी-डेक्सट्रान (रक्त प्लाज्मा) से रक्त प्लाज्मा और हरे रंग की रोशनी धुंधला /
  2. एक मर्मज्ञ धमनी, एक 1st आदेश केशिका, एक 2एन डी आदेश केशिका और संभवतः पड़ोसी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (उदा., pericytes, astrocytes) युक्त ब्याज के स्थान पर एक उच्च संकल्प z-स्टैक का उत्पादन. जितना संभव हो रक्त वाहिकाओं की 3 डी संरचना को शामिल करके हाइपरस्टैक इमेजिंग की x*y*z मात्रा निर्धारित करें। प्रत्येक स्टैक की कुल ऊँचाई 30-50 उ उ हो सकती है, जबकि x-y समतल मोटे तौर पर 60 डिग्री उx x 40 m के क्षेत्र को कवर करता है।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में छवि स्टैक सेट 4-5 डिग्री m के एक अंतर विमान दूरी के साथ 8-10 विमानों के शामिल किया जा करने के लिए। पाइजो-मोटर उद्देश्य प्रत्येक तल की छवि प्राप्त करने के लिए ज़-अक्ष पर प्रत्येक स्तर पर रुक जाता है। नमूना दर प्रति स्टैक 1 s है और x-y तल में पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन 0ण्2-0ण्3 उ है (चित्र 2क)। एक रिकॉर्डिंग सामान्य रूप से 10 पूर्व पफ छवि ढेर और 150 के बाद पफ छवि ढेर भी शामिल है.

6. डेटा प्रसंस्करण

  1. कस्टम-निर्मित विश्लेषणात्मक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा संसाधित करें. प्रत्येक छवि स्टैक को अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण द्वारा एक प्रतिबिंब में समतल करें (चित्र 2ठ)। ब्याज के पात्र में 3 डिग्री उ की चौड़ाई के साथ ब्याज का आयताकार क्षेत्र (आरओआई) बनाएँ (चित्र 2ब्)।
  2. लाल रक्त कोशिकाओं की छाया से और कॉर्टेक्स के छोटे कंपन से हस्तक्षेप को कम करने के लिए, इसे एक पंक्ति में पेश करके आयताकार ROI औसत, जो तब पोत खंड के औसत प्रोफ़ाइल का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक अधिकतम तीव्रता छवि के लिए यह मत करो.
  3. प्रोफ़ाइल रेखाओं को एक 2D छवि के रूप में प्लॉट करें जिसमें x-अक्ष के साथ अधिकतम तीव्रता छवियों का प्रतिनिधित्व कालानुक्रमिक क्रम में (चित्र2D,ऊपरी फलक) में. पोत8,9 (लाल घटता द्वारा इंगित) के किनारों को खोजने के लिए एक सक्रिय समोच्च एल्गोरिथ्म (चान-वेस विभाजन) का उपयोग करें; चित्र 2 डी,ऊपरी पैनल).
  4. व्यास परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम की गणना रक्त वाहिका के किनारों के बीच अंतर के रूप में (चित्र 2Dमें ऊपरी और निचले लाल वक्रों के बीच की विपरीत दूरी , निचले फलक)। समय के साथ व्यास परिवर्तन के पूर्व पफिंग व्यास आधार रेखा और साजिश घटता करने के लिए व्यास परिवर्तन सामान्य। प्रत्येक ROI के लिए ऐसा करें (चित्र 2E)
  5. पोत अनुक्रिया आयाम को पफिंग के बाद उच्चतम/सबसे कम शिखर आयाम के रूप में परिभाषित किया जाता है। अनुक्रिया विलंबता को अर्ध-अधिकतम आयाम की विलंबता के रूप में परिभाषित किया गया है (चित्र 2ग)। जहाजों के साथ नोड्स रखकर कंकालित संवहनी संरचना का मैन्युअल रूप से पता लगाएं (चित्र 2एफ) और प्रत्येक ROI और मर्मज्ञ धमनी के बीच भौगोलिक दूरी को मापते हैं। विलंबता अंतर से दूरी विभाजित करके सीवीआर गति की गणना।

7. वायरल वेक्टर इंजेक्शन

  1. एक साथ एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, मानक स्टीरियोट्रेटिक वायरल इंजेक्शन वेक्टर के बाद, 0.6 डिग्री सेल्सियस वायरल वेक्टर (pac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) की एक मात्रा को NG2DsRed चूहों के सोमेटोसेंसरी प्रांतस्था में इंजेक्ट करें। 10|
  2. तीन सप्ताह के बाद, माउस somatosensory प्रांतस्था में astrocytes आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक व्यक्त, GCaMP6f. ऊपर उल्लिखित शल्य चिकित्सा प्रक्रिया और चूहों के लिए दो-फोटोन इमेजिंग का पालन करें। एस्ट्रोसाइट्स और पोत ल्यूमिना के बीच अंतर करने के लिए, FITC-dextran के बजाय TRITC-dextran पोत lumina लाल दाग करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

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Representative Results

एक बार सर्जरी पूरी हो जाने के बाद चूहों को दो-फोटोन माइक्रोस्कोप में ले जाया गया (चित्र1ए)। लक्ष्य स्थान पर गंतव्य रक्त वाहिका के निकट 1 एम एम एटीपी युक्त एक ग्लास माइक्रो-पिपेट डाला गया था (चित्र 1बी)।

हमने 1 एमएम एटीपी का पफ देते समय हाइपरस्टैक इमेजिंग का प्रदर्शन किया (चित्र 2ए, अनुपूरक वीडियो 1) . प्रत्येक छवि स्टैक को अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण द्वारा एक प्रतिबिंब में चपटा किया गया था (चित्र 2ठ)। एटीपी पफिंग पर पोत व्यास परिवर्तन को मापने के लिए पोत के पार लम्बवत आरओआई को रखा गया था (चित्र 2ग) पोत व्यास को चान-वेस विभाजन (चित्र2डी) का उपयोग करके मापा गया था। एकल पफ रिकॉर्डिंग में, प्रत्येक ROI में सामान्यीकृत व्यास परिवर्तन विभिन्न पोत खंडों की अनुक्रियाओं की तुलना करने के लिए मढ़ा गया था (चित्र2म्)। प्रत्येक ROI से मर्मज्ञ धमनी के लिए दूरी संवहनी कंकाल हाथ से खींच द्वारा गणना की गई थी (चित्र 2F). एकल पफ रिकॉर्डिंग में प्रत्येक ROI पर फैलाव और संकुचन की गति और गति को आरओआई से मर्मज्ञ धमनी के लिए परिकलित दूरी पर प्लॉट किया गया था (चित्र 2H-K)। 1st और 2 nd आदेश केशिकाओं के संधि से प्रारंभ होने पर 1st और2nd आदेश केशिकाओं के संधि से प्रारंभ होकर 14.69 उध (उधारा) और 2.8 उउध (उधारा) की चाल के साथ पफिंग पर वसुधैव का प्रचार किया गया . वासोकोन्सिक्शन ने मर्मज्ञ धमनी से प्रारंभ करते हुए 3ण्92 उध/ दोनों वासोडिलेशन और वाहिकासंकीर्णन का अधिकतम आयाम 1st क्रम केशिकाओं में हुआ (चित्र 2J-K)।

इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट-विशिष्ट वायरल वेक्टर-वाहक फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक और दो-फोटोन हाइपरस्टैक इमेजिंग, एटीपी पफिंग के एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की जांच की गई (चित्र3ए, अनुपूरक वीडियो 2 ). आयताकार आरओआई एस्ट्रोसाइटिक सोमाटा और प्रक्रियाओं पर रखा गया था। एटीपी ने एस्ट्रोसाइटिक प्रक्रियाओं में इंट्रासेल्यूलर कैल्शियम में वृद्धि को प्रेरित किया लेकिन एस्ट्रोसाइट सोमाटा में नहीं (चित्र 3बी) ।

Figure 1
चित्र 1 : विवो में का आरेख दो-फोटोन 3 डी इमेजिंग और ग्लास माइक्रोपिपेट पफिंग। (ए) एनेस्थेटाइज्ड माउस को धातु की छड़ में सिर पर रखा जाता है और यंत्रवत् हवादार किया जाता है। अंत-ज्वारीय ब्व्2 2 की निगरानी कैप्नोग्राफ द्वारा की जाती है। दोनों whisker पैड उत्तेजना और माइक्रो-पिपेट puffing संवहनी व्यास परिवर्तन प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। कांच माइक्रो-पिपेट धारक को स्टेज प्लेट पर रखा गया है। ऊरु धमनी और नस रक्तचाप और रक्त गैसों की निगरानी करने के लिए कैथेटरीकृत कर रहे हैं, और संज्ञाहरण और fluorescein, क्रमशः शामिल करने के लिए। (बी) कांच की कवरस्लिप एक कोण पर क्रैनियोटोमी को कवर करता है, जो पिपेट की मुक्त आवाजाही की अनुमति देता है। पफिंग माइक्रो-पिपेट को मर्मज्ञ धमनी और इसके केशिकाओं की निकटता में रखा गया है और इसमें 10 डिग्री एम एलेक्सा 594 (कांच माइक्रो-पिपेट में लाल रंग) और 1 एमएम एटीपी का मिश्रण होता है। दो-फोटोइमेजिंग एक तेज और दोहराव 3 डी मात्रा स्कैनिंग है कि मर्मज्ञ arteriole और पहले कुछ आदेश केशिकाओं, साथ ही पड़ोसी astrocytes और pericytes भी शामिल है. (ग) एपि-फ्लोरोसेंट रोशनी का उपयोग करते हुए लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। वे पिपेट प्रविष्टि के दौरान 'मानचित्र' के रूप में उपयोग किया जाता है। लाल घेरे में 1st order केशिकाओं के स्थानों को चिह्नित करें, साथ में 5% vasodilation whisker पैड उत्तेजना के दौरान. स्केल बार: 50 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : सूक्ष्म-पिपेट द्वारा एटीपी पफिंग पोत फैलाव को प्रेरित करता है, इसके बाद कंस्ट्रक्शन होता है। (क) एक प्रतिनिधि छवि स्टैक में विमानों का कास्केड जिसमें मर्मज्ञ धमनी और 1st और 2nd आदेश केशिकाएं शामिल हैं। पेरिसाइट्स को एक लाल फ्लोरोफोर (NG2-DsRed) के साथ लेबल किया गया है और पोत लुमेन को FITC-dextran (हरा) के साथ लेबल किया गया है। (बी) छवि ढेर की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण. (ग) पोत व्यास को मापने के लिए ब्याज के अनेक विशिष्ट रंगीन क्षेत्र (आरओआई) को वाहिकाविन्यास के पार लंबवत रखा गया है। (डी) शीर्ष, प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट तीव्रता समय के साथ पैनल सी से गहरे नीले रॉय पर. दो लाल वक्र पोत की दीवार के किनारों को परिभाषित करते हैं। दो लाल वक्रों के बीच ऊर्ध्वाधर दूरी पोत व्यास है और समय (नीचे) के एक समारोह के रूप में दिखाया गया है। (ई) 1 एमएम एटीपी पफिंग के जवाब में प्रत्येक आरओआई पर समय के साथ सामान्य व्यास बदलता है। माप एक प्रयोग पर आधारित होते हैं. (च) वाहिका कंकाल को जहाजों के साथ नोड्स रखकर मैन्युअल रूप से पता लगाया गया था। (छ) रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान, फैलाव या संकुचन के आयाम को क्रमशः अधिकतम सकारात्मक या नकारात्मक संवहनी प्रतिक्रिया के रूप में परिभाषित किया गया था। फैलाव और constricts की विलंबता शुरुआत puffing के बाद आधा सकारात्मक या नकारात्मक अधिकतम करने के लिए समय के रूप में सूचित किया गया. (एच-के) रेखांकन फैलाव की विलंबता को दर्शाते हैं (एच), कंस्ट्रक्शन की विलंबता (मैं), फैलाव (जे) का आयाम और पैनल सी में दिखाए गए सभी आरओआई के संकुचन (कश्मीर) का आयाम बनाम पैनल सी में प्रत्येक ROI की दूरी से मर्मज्ञ धमनी। डैश्ड रेखाएँ अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्रवाहकीय अनुक्रियात्मक अनुक्रियाओं की रैखिक फिटिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं। पी.ए.: मर्मज्ञ धमनी। स्केल बार: 10 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : सूक्ष्म-पिपेट द्वारा एटीपी पफिंग एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम गतिविधियों को प्रेरित करता है। (क) प्रगतालीक विषाक् त कक रोगवाहक प्रर्दानी प्रर्दानी संसूचक को प्रर्दानी प्रक्रिया से तीन सप् ताह पहले माउस सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स में इंजेक्ट किया गया था। छवि TRITC-dextran (लाल) और हरे रंग में एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम के साथ लेबल पोत lumina से पता चलता है. (बी) एकाधिक ROIs एस्ट्रोसाइटिक सोमाटा और प्रक्रियाओं में रखा जाता है। 1 एमएम एटीपी पफिंग पर, इंट्रासेल्यूलर कैल्शियम एस्ट्रोसाइटिक प्रक्रियाओं में वृद्धि हुई, लेकिन सोमाटा (डॉटेड बक्से) में नहीं, जहां कैल्शियम का स्तर मतलब से बड़ा 1.5 एक्स मानक विचलन महत्वपूर्ण के रूप में परिभाषित किया गया था। स्केल बार: 10 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Video 1
अनुपूरक वीडियो 1: समय श्रृंखला फिल्म 1 एम एम एटीपी के puffing के जवाब में जहाजों के hyperstack इमेजिंग से चपटा. हरा: FITC-dextran, धुंधला पोत लुमेन. लाल: NG2DsRed, धुंधला pericytes. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Supplementary Video 2
अनुपूरक वीडियो 2: टाइम सीरीज फिल्म 1 एम एम एटीपी के पफिंग के जवाब में एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम के हाइपरस्टैक इमेजिंग से चपटा। हरा: एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम। लाल: TRITC-dextran, धुंधला पोत लुमेन. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

संवहनी अध्ययन के लिए एक चुनौती पोत व्यास का सटीक माप है. विधि हम यहाँ का वर्णन एक motorized piezo उद्देश्य दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी द्वारा तेजी से और दोहराव hyperstack इमेजिंग बनाने के लिए इस्तेमाल किया. सबसे पहले, इस विधि ध्यान के नुकसान के बिना मर्मज्ञ arteriole, 1st आदेश और 2एन डी आदेश केशिकाओं की दोहराया परीक्षा की अनुमति देता है और धीरे धीरे vivo में केशिकाओं में संवहनी प्रतिक्रियाओं का आयोजन की खोज करने के लिए नेतृत्व किया. दूसरे, एक वायरल वेक्टर इंजेक्शन तकनीक के साथ संयोजन में, यह हमें तीन आयामों में एस्ट्रोसाइटिक कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की जांच करने में सक्षम बनाता है, जो रक्त प्रवाह विनियमन के अध्ययन के लिए आवश्यक है।

इस विधि सीमाओं के बिना नहीं है. सबसे पहले, देखने की एक संकीर्ण आयताकार क्षेत्र उच्च लौकिक संकल्प को प्राप्त करने के क्रम में 3 डी इमेजिंग से पहले परिभाषित किया गया है। यह आमतौर पर केशिकाओं के पहले तीन आदेश करने के लिए इमेजिंग सीमा. दूसरे, दो-फोटोन माइक्रोस्कोप के लेज़रों पूरी तरह से गठबंधन किया जाना चाहिए। लेजर misalignment झूठा प्रत्येक फ्रेम de-केंद्र और पोत व्यास माप में वृद्धि होगी. तीसरे, 3 डी इमेजिंग की नमूना दर धीमी सीवीआर पर कब्जा करने में सक्षम है और एस्ट्रोसाइट्स में कैल्शियम में धीमी गति से परिवर्तन कर सकता है। 1-2 हर्ट्ज प्रति स्टैक अभी भी तेजी से CVRs11 याएस्ट्रोसाइट्स 12,13में तेजी से कैल्शियम संकेतों का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त नहीं है .

इसके अलावा, स्थानीय स्तर पर ब्याज के जहाजों को प्रभावित करने के लिए, हमने माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स के एक विशिष्ट स्थान में एक ग्लास माइक्रो-पिपेट की सटीक प्रविष्टि की प्रक्रिया को अनुकूलित किया है। इस विधि के सफल अनुप्रयोग के लिए कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, कांच माइक्रो-पिपेट धारक के कोण को सावधानी से समायोजित किया जाना चाहिए। यह सूक्ष्म-पिपेट को स्वतंत्र रूप से उद्देश्य के नीचे पैंतरेबाज़ी करने की अनुमति देनी चाहिए और उजागर कॉर्टेक्स के ऊपर कांच कवरस्लिप। दूसरे, अगारोस परत और कॉर्टेक्स में कांच माइक्रो-पिपेट की प्रविष्टि के दौरान, पिपेट टिप को बिना लॉग ्ड रखने के लिए एक छोटा सा होल्डिंग दबाव आवश्यक है। हालांकि, सावधानी बहुत अधिक एक होल्डिंग दबाव लागू नहीं करने के लिए लागू किया जाना चाहिए ताकि यौगिक पफिंग से पहले लीक न हो। तीसरे, पिपेट के पफिंग का परीक्षण मस्तिष्क के ऊपर एग्रोस परत में किया जाना चाहिए ताकि इष्टतम दबाव और अवधि को एक पफ पर पर्याप्त पफिंग यौगिक को रिहा किया जा सके, जबकि यांत्रिक के कारण कोशिकाओं और जहाजों का स्पष्ट विस्थापन शुरू नहीं किया जा सकता है दबाव.

आदेश में CVR गति का अधिक सटीक माप बनाने के लिए, मात्रा स्कैनिंग गति में सुधार किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, अन्य नव विकसित मात्रा स्कैनिंग माइक्रोस्कोप हैं, उदाहरण के लिए, एक ध्वनिक ऑप्टिकल विक्षेपक (एओडी) के साथ एक दो-फोटोन माइक्रोस्कोप एक ही स्थानिक संकल्प और मात्रा आकार (ईमेल संचार) के साथ प्रति सेकंड 5 मात्रा के रूप में तेजी से स्कैन करता है। प्रकाश-पत्रक सूक्ष्मदर्शी प्रति सेकंड 14 10 खंडों के साथ एक बड़ा खंड आकार (350डिग्री मी x 800 $m x 100 $m) को स्कैन करते हैं।

हमारे माउस की तैयारी भी सीमाएं हैं. तीव्र माउस सर्जरी संभावित जटिलताओं हो सकता है. दर्द से राहत दवा और संज्ञाहरण न्यूरोवास्कुलर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं। तीव्र न्यूरोइंइंइंइंबिनूम को भी ट्रिगर किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कॉर्टिकल ऊतकों और वाहिकाओं में माइक्रोग्लियल सक्रियण और ल्यूकोसाइटोसिस होता है। हालांकि कांच माइक्रो-पिपेट का टिप आकार आमतौर पर बहुत छोटा होता है (और 1 डिग्री सेल्सियस), सम्मिलन प्रक्रिया और एटीपी पफिंग भी संभावित रूप से 0.5-1 घंटे के बाद निवेश न करने के भीतर माइक्रोग्लियल माइग्रेशन और प्रविष्टि साइट को ट्रिगर कर सकता है।

अंत में, दो-फोटोमाइक्रोकी और स्थानीयकृत पफिंग ग्लास माइक्रो-पिपेट में 3 डी इमेजिंग का संयोजन न्यूरोवास्कुलर गतिविधियों और उनके तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उन्नत उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन Lundbeck फाउंडेशन, नोवो-नॉरडिस्क फाउंडेशन, स्वतंत्र अनुसंधान के लिए डेनिश परिषद द्वारा समर्थित किया गया था | चिकित्सा विज्ञान, और NORDEA फाउंडेशन अनुदान स्वस्थ उम्र बढ़ने के लिए केंद्र के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma–Aldrich A6138 Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594 Life Technologies A-10438 Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP Sigma-Aldrich A9187 Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator Loctite Adhesives and SF7452 Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD500S Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice Jackson Laboratory 8241 These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f Addgene 52924-AAV5 Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran Sigma-Aldrich 52194 Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump WPI PV830 Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer Radiometer ABL 700 Measure levels of blood gases 
Blood pressure monitor World Precision Instruments BP-1 Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller CWE Model TC-1000 Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph Harvard Apparatus Type 340 Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator A.M.P.I. ISO-flex Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator Harvard Apparatus D-79232 Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Two-photon microscope Femtonics Ltd Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer  Lawton 09-0007
Angled and balanced tweezer S&T AG 00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor Lawton 05-1450
Micro vascular clamp S&T AG 462
Mouse vascular catheters Verutech 100828

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 148 विवो में दो-फोटोन माइक्रोस्कोपी सेरेब्रल रक्त प्रवाह (सीबीएफ) एस्ट्रोसाइट्स तीन आयाम (3 डी) न्यूरोवास्कुलर युग्मन कैल्शियम इमेजिंग वायरल वेक्टर इंजेक्शन
Vivo में तीन-आयाम दो-फोटो माइक्रोस्कोपी अध्ययन करने के लिए स्थानीय एटीपी इंजेक्शन द्वारा एक ग्लास माइक्रो-पिपेट का उपयोग करके संवहनी जवाब आयोजित
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Cai, C., Zambach, S. A., Fordsmann,… More

Cai, C., Zambach, S. A., Fordsmann, J. C., Lønstrup, M., Thomsen, K. J., Jensen, A. G. K., Lauritzen, M. In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette. J. Vis. Exp. (148), e59286, doi:10.3791/59286 (2019).

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