Summary
Nous présentons une procédure d'éjection locale optimisée utilisant une micropipette en verre et une méthode rapide d'imagerie d'hyperpile de deux photons, qui permet la mesure précise des changements de diamètre capillaire et l'étude de sa régulation en trois dimensions.
Abstract
Le maintien de la fonction cérébrale normale nécessite un approvisionnement suffisant et efficace en oxygène et en nutrition par un réseau complexe de vaisseaux. Cependant, la régulation du flux sanguin cérébral (CBF) est incomplètement comprise, particulièrement au niveau capillaire. La microscopie à deux photons est un outil puissant largement utilisé pour étudier la CBF et sa régulation. À l'heure actuelle, ce domaine est limité par l'absence d'études in vivo de microscopie à deux photons examinant (1) les réponses CBF en trois dimensions, (2) les réponses vasculaires menées et (3) les interventions localisées au sein du réseau vasculaire. Ici, nous décrivons une méthode in vivo 3D utilisant la microscopie de deux photons pour étudier les réponses vasculaires menées obtenues par l'éjection locale de l'ATP avec une micro-pipette en verre. Notre méthode utilise l'imagerie rapide et répétitive de deux photons d'hyperpile fournissant des mesures précises de diamètre par projection d'intensité maximale des images obtenues. En outre, nous montrons que cette méthode peut également être utilisée pour étudier les réponses 3D de calcium astrocytique. Nous discutons également des avantages et des limites de l'insertion de micropipette en verre et de l'imagerie d'hyperpile à deux photons.
Introduction
Le cerveau a un taux de consommation d'énergie élevé. Environ 20% de l'oxygène et 25% du glucose consommé par le corps humain sont dédiés à la fonction cérébrale, tandis que le cerveau occupe seulement 2% de la masse corporelle totale. Le maintien de la fonction cérébrale normale nécessite un approvisionnement suffisant et efficace en oxygène et en nutrition par le flux sanguin dans un réseau complexe de vaisseaux. L'activité cérébrale locale et le flux sanguin cérébral (CBF) sont solidement couplés, selon les propriétés fonctionnelles des neurones, des astrocytes, des péricytes, des cellules musculaires lisses (SMC) et des cellules endothéliales (EC)1. Récemment, les premiers ordres de capillaires ramifiant des artérioles pénétrantes ont émergé comme un «hotspot»2, montrant une régulation active de la circulation sanguine capillaire. Une réponse vasculaire menée lentement (CVR) a été découverte à ce « point chaud » dans le cortex somatosensoriel de souris pendant la stimulation de moustaches et l'éjection locale (puffing) de l'ATP avec une micro-pipetteenverre 3.
Bien que l'imagerie in vivo par microscopie fluorescente à balayage laser à deux photons ait été largement utilisée pour étudier les réponses neurovasculaires dans le cortex cérébral, la plupart des études ont mesuré le diamètre des vaisseaux sanguins et étudié leur régulation dans un plan x-y en deux dimensions (2D). Les défis sont les : Tout d'abord, les vaisseaux sanguins cérébraux et leurs astrocytes, péricytes et SMC construisent des branches en trois dimensions (3D). Il est donc crucial d'étudier leurs interactions en 3D. Deuxièmement, même une petite quantité de dérive dans la mise au point affectera la mesure précise des diamètres des navires et des signaux fluorescents cellulaires. Enfin, les CVR sont rapides et de grande portée en trois dimensions. La numérisation du volume 3D est optimale pour détecter les CVR et dévoiler leurs mécanismes. Nous avons mis en œuvre un objectif de moteur piezo dans un microscope à deux photons pour étudier le cortex somatosensoriel de souris in vivo, permettant des mesures précises de diamètre par des projections d'intensité maximale des images obtenues.
Les micro-pipettes en verre ont souvent été utilisées pour des études in vivo sur le cerveau, par exemple pour charger en vrac des colorants organiques4, enregistrer les EEG5 et pour le clampage des timbres6. Néanmoins, des limites subsistent. Généralement, la pointe de la micro-pipette en verre est imprécise, ou la micro-pipette n'est pas utilisée pour les interventions locales. Ici, nous avons optimisé la procédure d'insertion de micro-pipettes et d'éjection locale.
En outre, la combinaison de la microscopie 3D à deux photons et d'indicateurs fluorescents génétiquement codés offre une occasion sans précédent d'étudier le couplage neurovasculaire dans une portée 3D. Dans cette étude, nous avons profité de ceci et avons injecté des vecteurs viraux portant des indicateurs de calcium génétiquement-encodés spécifiques d'astrocyte dans le cortex somatosensory de souris. Les astrocytes ainsi que les diamètres des vaisseaux ont été photographiés simultanément en combinant différents marqueurs fluorescents.
Dans l'ensemble, nous présentons une méthode optimisée d'éjection locale (puffing) par micro-pipette en verre et l'imagerie rapide de l'hyperpile à deux photons, qui permet de mesurer avec précision les changements de diamètre capillaire. En outre, notre méthode fournit un nouvel outil pour étudier simultanément les profils 3D des réponses Ca2 dans les astrocytes et les réponses de diamètre vasculaire.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité national danois d'éthique conformément aux lignes directrices énoncées dans la Convention du Conseil européen pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et scientifiques et respectaient les lignes directrices de l'ARRIVE. Il s'agit d'une procédure terminale avec les souris étant euthanasiées avant la récupération anesthésique.
1. Préparation préchirurgicale
- Nettoyer la table chirurgicale et toute la zone environnante avec 70% d'éthanol. Nettoyez et séchez soigneusement les outils chirurgicaux avant la chirurgie.
- Anesthésiez une souris NG2DsRed (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; les deux sexes; 4-8 mois) par une injection péritonéale de kétamine et xylazine (60 mg/kg et 10 mg/kg) dissoute dans de l'eau stérilisée, pH 7,4. Administrer des doses supplémentaires de kétamine (30 mg/kg) toutes les 25 min jusqu'à l'achèvement de l'intervention chirurgicale. Vérifiez régulièrement les réflexes de pincement de la queue et des orteils pour vérifier la profondeur de l'anesthésie.
- Injecter saline sous-cutanée à quatre endroits différents sur le dos de la souris pour un volume total de 1 ml pour prévenir la déshydratation pendant l'expérience. Pour protéger les yeux du dessèchement, appliquez du lubrifiant pour les yeux. Maintenir la température corporelle à 37 oC à l'aide d'une sonde à température rectale et d'une couverture chauffante.
2. Procédure chirurgicale
- Trachéotomie
- Placez la souris sur le dos. Injecter 0,04 ml de lidocaïne de 0,5 % sous-cutané sous l'incision prévue et attendre 2 min. Faire une incision de 10 mm de long au-dessus de l'os thoracique (manubrium). Séparez les glandes submandibulaires et les muscles stériliques, puis exposez la trachée.
- Faire la trachéotomie entre deux anneaux trachéaux avec des ciseaux. Insérer un petit tube métallique d'une longueur de 16,2 mm et d'un diamètre de 1 mm dans la trachée. Connectez le tube à un ventilateur mécanique et à un capnographe pour surveiller le CO2 (figure1A).
- Insertion de cathéter
- Injecter 0,5 % de lidocaïne (0,04 ml) sous-cutané sous l'incision prévue et attendre 2 min.
- À l'aide de fines pointes, séparer délicatement l'artère de la veine. Arrêtez le flux sanguin en amont avec une pince microvasculaire. Limitez le flux sanguin en aval avec une suture en nylon 10-0 ligant les deux vaisseaux sanguins.
- Utilisez des ciseaux micro-disséquants pour faire une petite incision dans l'artère et la veine. Insérer des cathéters en plastique dans les deux vaisseaux sanguins. Sécuriser les cathéters en resserrant les sutures (8-0 ou 10-0 sutures en nylon dépendant de la taille du navire) sans compromettre les lumens cathéter. Retirez la pince microvasculaire et fermez la peau.
- Surveillez la pression artérielle par le cathéter artériel. Mesurer les niveaux de gaz sanguins dans les échantillons de sang artériel (50 l) avant et après chaque expérience (valeurs normales: pO2, 90-120 mmHg; pCO2, 35-40 mmHg; pH, 7,25-7,45) à l'aide d'un analyseur de gaz sanguin. Utilisez le cathéter veineux pour l'infusion de fluorescéine et d'anesthésie.
- Craniotomie
- Raser la fourrure de la tête de la souris entre les oreilles. Injecter 0,04 ml de 0,5 % de lidocaïne sous-cutané sous l'incision prévue et attendre 2 min.
- Essuyez le crâne à l'aide d'une solution de 10 % de fer-chlorure pour enlever le périoste. Rincer le crâne à fond avec salin. Collez une barre de tête en métal au crâne avec de la colle et un activateur de cyanoacrylate (Figure 1A).
REMARQUE : La barre de tête en métal est de 75 mm de long et 13,5 mm de large, avec un trou rond de 5 mm de diamètre au centre. - Percer une craniotomie de 4 mm de diamètre, centrée à 0,5 mm derrière et 3 mm à droite du bregma au-dessus du cortex du canon sensoriel droit. Retirer la dura à l'aide d'un dilatateur de navire à pointe fine.
- Couvrir le cortex exposé de gel agarose de 0,75 %, dissous dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF; pH à 7,4) et refroidi à 35 oC. Couvrez 80-90% de la craniotomie avec un couvercle en verre à un angle de 10-15 degrés à la barre de tête en métal (figure 1B) qui permet l'insertion et le placement de la micro-pipette en verre.
- Pour minimiser la pulsation cérébrale, collez les deux coins de la couverture en verre sur la barre de tête en métal avec de la colle cyanoacrylate et l'activateur. Appliquer l'activateur avec soin pour éviter d'entrer dans le cerveau exposé. Rincer le couvercle en verre collé à fond avec salin par la suite.
- Effectuer l'insertion de la sonde de stimulation du tampon de moustachu. Insérez un ensemble d'électrodes bipolaires sur mesure (8 mm de longueur et 0,25 mm d'épaisseur) percutanément dans le côté gauche de la face pour stimuler les infraorbitalis ramus du nerf trigeminal contralatéral à la craniotomie. Placez la cathode près de l'infraorbitalis hiatus, et insérez l'anode dans les muscles masticatoires7. Effectuer la stimulation avec un stimulateur électrique à une intensité de 1,5 mA pour 1 ms dans les trains de 20 s à 2 Hz.
- À la fin de la chirurgie, administrer un bolus de 0,05 mL de fluorescéine isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, poids moléculaire [MW] 50.000) dans la veine fémorale pour étiqueter le plasma sanguin. Interrompre la kétamine et passer à l'infusion intraveineuse continue de chloralose (17 % w/v, concentration finale) mélangée à du FITC-dextran (2 % w/v, concentration finale) à 0,02 mL/10 g/h. Attendez environ une demi-heure pour stabiliser le nouveau l'état anesthésique.
REMARQUE : Le FITC-dextran et le chloralose sont dissous en salin de 0,9 %.
3. Première séance d'imagerie à deux photons
- Transférer la souris au stade d'un microscope commercial à deux photons (Table of Materials). Sous les deux modes de protéines fluorescentes rouges (DP, figure 1C) et de protéines fluorescentes vertes (GFP, figure 1C)d'éclairage épifluorescent, prenez une photo du cortex exposé avec un objectif 5x. Utilisez l'image de la DP comme « carte » pour l'insertion de la micro-pipette en verre lors de la session suivante.
REMARQUE : La « carte » de GFP est utilisée pour distinguer les veines/les œilles des artères/artérioles. - Effectuez l'imagerie à deux photons à l'aide du microscope à deux photons et d'un objectif d'immersion de l'eau de 25 x 1,0 (NA) avec le moteur piezo. Définir la longueur d'onde de l'excitation à 900 nm. Rechercher le cortex et suivre chaque artériole pénétrante et trouver ses branches horizontales (1 capillairesde l'ordre).
- Image arterioles pénétrantes et leurs capillaires 1er ordre au repos et pendant la stimulation de tampon de moustaches. Voir les paramètres d'imagerie détaillés de la section 5.
- Marquez les emplacements des capillaires de 1ère de commande avec une vasodilatation de 5 % pendant la stimulation des moustachus sur la « carte » de la DP (Figure 1C). Les emplacements avec la vasodilatation de 5 % sont considérés comme étant en dehors de la région du cortex du baril de moustaches.
REMARQUE : Si vous utilisez des souris de type sauvage au lieu de souris NG2DsRed dans l'expérience, l'image GFP est utilisée comme « carte » à la place.
4. Insertion de la micro-pipette en verre
- Préparer des micro-pipettes en verre pour la bouffée à l'aide d'une pipette (Tableaudes matériaux). Les micro-pipettes en verre ont une résistance de 3-3.5 M et une longueur de cône de 4.5-5 mm. Chargez une pipette avec un mélange de 1 mM ATP et 10 'M Alexa 594 afin de visualiser la pointe de pipette sous la lampe épi-fluorescente et le microscope à deux photons.
- Montez la micro-pipette en verre sur un porte-étanchéité et connectez-la à une pompe à air. Définir la pompe en maintenant la pression à 0 psi.
- À l'aide de l'éclairage épifluorescent rouge, concentrez-vous sur la pointe de la pipette avec l'objectif 5x. Placez la micro-pipette en verre dans l'aCSF au-dessus de l'agarose. Ajuster la pression de fixation de la pompe à air à 0,2 psi. Un petit nuage rouge peut être observé éjectant de la pointe de pipette dans l'aCSF. Il s'agit d'éviter l'engorgement pendant l'insertion de pipette.
- Choisissez l'un des emplacements marqués dans la « carte » de la DP comme destination. Déplacez l'extrémité de la pipette vers le plan horizontal du bord de verre de couverture avec une distance de 30 m, pointant grossièrement vers la destination dans le plan x-y.
- Abaissez soigneusement la pointe de pipette dans l'axe z sous le bordereau de verre de couverture. Ensuite, commencez à avancer la pipette en verre vers la destination jusqu'à 500 m au-dessus de la surface du cerveau. Basculez fréquemment entre le bord de verre de couverture, l'extrémité de pipette et la surface de cerveau, s'assurant qu'il y a assez d'espace libre pour déplacer la pipette.
- Passez l'objectif à 25x. Recentrez la pointe de la pipette et avancez la pointe de la pipette plus loin vers la destination sur la « carte » de la DP. Gardez la pointe de pipette dans la couche d'agarose.
- Lorsque l'extrémité de la pipette est à 100 m au-dessus de la surface du cerveau, passez le mode d'imagerie à la microscopie à deux photons. Concentrez-vous sur un endroit cible où souffler. Notez ses coordonnées x, y (x0, y0) et sa profondeur sous la surface (z0). Calculer les coordonnées du point d'insertion sur la surface du cerveau (xi, yi) comme suit:
xi x 0 z0 / tan
yi y0
où est l'angle entre le porte-pipette et le plan horizontal. - Placez la pointe de pipette aux coordonnées (xi, yi) sur la surface du cerveau. Insérez doucement et lentement la pipette jusqu'à ce qu'elle atteigne (x0, y0, z0). Si un navire est en voie de trajectoire d'insertion, retirez la pipette et recalculez d'autres coordonnées et trajectoires d'insertion; ou tourner légèrement la plaque d'étape (comme indiqué à la figure 1A).
- Fixer la pression de maintien de la pompe à 0 psi et la pression d'éjection à 10-15 psi. Puff ATP pour 200-400 ms à l'emplacement cible pendant l'imagerie à deux photons. Ajuster la pression et la durée de la bouffée pour chaque pipette et au fil du temps comme expliqué dans la section de discussion.
5. Imagerie à deux photons Hyperstack
- Effectuez des expériences à l'aide du microscope à deux photons et d'un objectif d'immersion d'eau 25 x 1,0 NA avec moteur piezo. Définir la longueur d'onde de l'excitation à 900 nm. Filtrer la lumière émise pour recueillir la lumière rouge de DsRed (péricytes)/téramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) colorant le plasma sanguin et la lumière verte de FITC-dextran (plasma sanguin)/GCaMP6 (GFP, calcium astrocytique).
- Produire une z-pile haute résolution à l'endroit d'intérêt contenant une artériole pénétrante, un capillaire de 1er ordre, un 2nd cellules capillaires d'ordre et peut-être voisines (par exemple, péricytes, astrocytes). Déterminez le volume d'imagerie par hyperpile en incluant autant que possible la structure 3D des vaisseaux sanguins. La hauteur totale de chaque pile peut varier de 30 à 50 m, tandis que l'avion x-y couvre à peu près une superficie de 60 m x 40 m.
- Définir la pile d'images dans le logiciel d'imagerie pour être composé de 8-10 avions avec une distance inter-plan de 4-5 m. L'objectif piezo-moteur s'arrête à chaque niveau sur l'axe z pour acquérir l'image de chaque plan. Le taux d'échantillonnage est de 1 s par pile et la résolution des pixels dans le plan x-y est de 0,2 à 0,3 m (Figure 2A). Un enregistrement comprend normalement 10 piles d'images pré-puff et 150 piles d'images post-puff.
6. Traitement des données
- Traiter les données à l'aide d'un logiciel d'analyse sur mesure. Aplatir chaque pile d'images en une seule image par projection d'intensité maximale (Figure 2B). Dessiner une région rectangulaire d'intérêt (ROI) d'une largeur de 3 m impédiculairement à travers le navire d'intérêt (figure 2C).
- Pour minimiser les interférences des ombres des globules rouges et des vibrations mineures du cortex, faites la moyenne du retour sur investissement rectangulaire en le projetant en une seule ligne, ce qui représente ensuite le profil moyen du segment du vaisseau. Faites ceci pour chaque image d'intensité maximale.
- Tracer les lignes de profil comme une image 2D avec l'axe X représentant des images d'intensité maximale dans l'ordre chronologique (Figure 2D, panneau supérieur). Utilisez un algorithme de contour actif (segmentation Chan-Vese) pour trouver les bords du navire8,9 (indiqué par des courbes rouges; Figure 2 D, panneau supérieur).
- Calculer le cours temporel du diamètre change à mesure que la différence entre les bords du vaisseau sanguin (distance verticale entre les courbes rouges supérieures et inférieures de la figure 2D, panneau inférieur). Normaliser les changements de diamètre à la ligne de base de diamètre pré-puffing et les courbes de parcelle de changement de diamètre au fil du temps. Faites-le pour chaque retour sur investissement (Figure 2E).
- L'amplitude de réponse du navire est définie comme l'amplitude de pointe la plus élevée/la plus basse après avoir soufflé. La latence de réponse est définie comme la latence de l'amplitude demi-max (figure 2G). Tracer manuellement la structure vasculaire squelettée en plaçant des nœuds le long des vaisseaux (figure 2F) et en mesurant la distance géographique entre chaque retour sur investissement et l'artériole pénétrante. Calculez la vitesse du CVR en divisant les distances par des différences de latence.
7. Injection vectorielle virale
- Afin d'étudier simultanément les réponses astrocytiques du calcium, injectez un volume de vecteur viral de 0,6 L (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) dans le cortex somatosensoriel des souris NG2DsRed, suivant la procédure standard d'injection vectorielle virale stéréotaxique 10.
- Après trois semaines, les astrocytes dans le cortex somatosensory de souris expriment l'indicateur génétiquement codé de calcium, GCaMP6f. Suivez l'intervention chirurgicale susmentionnée et l'imagerie à deux photons pour les souris. Pour faire la distinction entre les astrocytes et la sommité des vaisseaux, TRITC-dextran au lieu de FITC-dextran est utilisé pour tacher la lumina rouge vaisseaux.
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Representative Results
Une fois la chirurgie terminée, les souris ont été transportées au microscope à deux photons (figure1A). Une micropipette en verre contenant 1 mM d'ATP a été insérée à proximité du vaisseau sanguin de destination à l'endroit cible (figure 1B).
Nous avons effectué l'imagerie hyperpile tout en donnant une bouffée de 1 mM ATP (Figure 2A, Vidéo supplémentaire 1). Chaque pile d'images a été aplatie à une image par projection d'intensité maximale (Figure 2B). Les ROI rectangulaires ont été placés perpendiculairement à travers le navire pour mesurer le changement de diamètre du navire lors de la bouffée ATP (figure 2C). Les diamètres des navires ont été mesurés à l'aide de la segmentation Chan-Vese (Figure 2D). Dans les enregistrements à bouffée unique, les changements de diamètre normalisés à chaque retour sur investissement ont été superposés pour comparer les réponses de différents segments de navires (figure2E). La distance entre chaque retour sur investissement et l'artériole pénétrante a été calculée en dessinant à la main le squelette vasculaire (Figure 2F). Les amplitudes et les latences de la dilatation et de la constriction à chaque retour sur investissement dans les enregistrements de bouffées simples ont été tracées sur les distances calculées entre les ROI et l'artériole pénétrante (figure2H-K). Vasodilatation sur le soufflement s'est propagé linéairement avec une vitesse de 14,69 m/s (en amont) et de 2,8 m/s (en aval), à partir de la jonction des capillaires de 1er et 2nd d'ordre (figure2H). Vasoconstriction s'est également propagée linéairement à 3,92 m/s, à partir de l'arteriole pénétrante (figure2I). L'amplitude maximale de la vasodilatation et de la vasoconstriction s'est produite dans les capillaires du 1er ordre (Figure 2J-K).
De plus, on a étudié la combinaison d'indicateurs de calcium fluorescent svectorires spécifiques à l'astrocyte et d'une imagerie à hyperpile à deux photons, des réponses astrocytiques au calcium à l'ATP (figure3A, Vidéo supplémentaire 2 ). Les ROI rectangulaires ont été placés à des somatas et des processus astrocytiques. L'ATP a provoqué une augmentation du calcium intracellulaire dans les processus astrocytiques, mais pas dans les somata astrocytes (Figure 3B).
Figure 1 : Diagramme d'imagerie 3D in vivo à deux photons et de micropipette en verre. (A) La souris anesthésiée est fixée à la tête à une barre métallique et ventilation mécanique. Le CO2 de la marée de fin est surveillé par un capnographe. La stimulation de tampon de moustaches et la bouffée de micropipette sont employées pour induire des changements vasculaires de diamètre. Le porte-micropipette en verre est monté sur la plaque de scène. L'artère fémorale et la veine sont cathéterized pour surveiller la tension artérielle et les gaz sanguins, et pour infuser l'anesthésie et la fluorescéine, respectivement. (B) La glissière en verre recouvre la craniotomie à un angle qui permet la libre circulation de la pipette. La micro-pipette soufflante est placée à proximité d'une artériole pénétrante et de ses capillaires et contient un mélange de 10 M Alexa 594 (couleur rouge en micro-pipette en verre) et de 1 mM ATP. L'imagerie à deux photons est une analyse rapide et répétitive du volume 3D qui comprend l'artériole pénétrante et les premiers capillaires d'ordre, ainsi que les astrocytes et les péricytes voisins. (C) Des images représentatives de la protéine fluorescente rouge (DP) et de la protéine fluorescente verte (GFP) utilisant l'éclairage épifluorescent sont montrées. Ils sont utilisés comme «cartes» lors de l'insertion de pipettes. Les cercles rouges marquent les emplacements des capillaires de 1ère d'ordre avec une vasodilatation de 5 % pendant la stimulation des moussières. Barre d'échelle : 50 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : l'ATP soufflant par micropipette induit la dilatation du navire, suivie de la constriction. (A) Cascade d'avions dans une pile d'images représentatives comprenant l'artériole pénétrante et les capillaires de 1st et 2nd d'ordre. Les péricartes sont étiquetés avec un fluorophore rouge (NG2-DsRed) et le lumen du navire est étiqueté avec FITC-dextran (vert). (B) Projection d'intensité maximale de la pile d'images. (C) Plusieurs régions d'intérêt de couleur unique (ROI) placées perpendiculairement à travers la vascularisation pour mesurer le diamètre du navire. (D) Haut, intensité fluorescente représentative au fil du temps au retour sur investissement bleu foncé du panneau C. Les deux courbes rouges définissent les bords du mur du navire. La distance verticale entre les deux courbes rouges est le diamètre du navire et est indiquée en fonction du temps (en bas). (E) Changements de diamètre normalisés au fil du temps à chaque retour sur investissement en réponse à 1 mM ATP soufflant. Les mesures sont basées sur une seule expérience. (F) Le squelette vasculaire a été tracé manuellement en plaçant des noeuds le long des vaisseaux. (G) Les amplitudes de dilatation ou de constriction ont été définies comme réponse vasculaire positive ou négative maximale, respectivement, pendant la session d'enregistrement. La latence des dilatations et des constrictions ont été rapportées comme temps à la moitié positif ou maximum négatif après le début de soufflage. (H-K) Les graphiques montrent la latence de la dilatation (H), la latence de la constriction (I), l'amplitude de la dilatation (J), et l'amplitude de la constriction (K) de tous les ROI montrés dans le panneau C par rapport à la distance de chaque roi-roi de la artériole pénétrante. Les lignes pointillées représentent l'ajustement linéaire des réponses conductrices en amont et en aval. p.a.: arteriole pénétrante. Barre d'échelle : 10 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : L'ATP soufflant par micropipette induit des activités astrocytiques de calcium. (A) Des vecteurs viraux astrocytiques porteurs d'un indicateur de calcium fluorescent ont été injectés dans le cortex somatosensoriel de souris trois semaines avant la procédure expérimentale. L'image montre la lumina de vaisseau étiquetée avec TRITC-dextran (rouge) et calcium astrocytic dans le vert. (B) Les ROI multiples sont placés à des somatas et des processus astrocytiques. Sur 1 mM ATP soufflant, le calcium intracellulaire a augmenté dans les processus astrocytiques mais pas dans les somata (boîtes pointillées), où les niveaux de calcium plus grands que la moyenne plus 1,5 x écart standard ont été définis comme significatifs. Barre d'échelle : 10 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo supplémentaire 1 : Film de la série chronologique aplati à partir de l'imagerie hyperpile des navires en réponse à la bouffée de 1 mM ATP. Vert: FITC-dextran, vaisseau de coloration lumen. Rouge: NG2DsRed, coloration périytes. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo supplémentaire 2 : Film de la série chronologique aplati à partir de l'imagerie hyperpile de calcium astrocytique en réponse à la bouffée de 1 mM ATP. Vert : calcium astrocytique. Rouge: TRITC-dextran, vaisseau de coloration lumen. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Un défi pour les études vasculaires est la mesure précise du diamètre des vaisseaux. La méthode que nous décrivons ici a employé un objectif motorisé de piezo pour faire l'imagerie rapide et répétitive d'hyperpile par microscopie de deux photons. Tout d'abord, cette méthode permet des examens répétés de l'artériole pénétrante, 1er ordre et 2 capillaires d'ordre sans perte de concentration et a conduit à la découverte de réponses vasculaires lentement menées dans les capillaires in vivo. Deuxièmement, en combinaison avec une technique d'injection vectorielle virale, il nous permet d'étudier les réponses astrocytiques de calcium en trois dimensions, ce qui est nécessaire pour les études de régulation du flux sanguin.
Cette méthode n'est pas sans limites. Tout d'abord, un champ de vision rectangulaire étroit est défini avant l'imagerie 3D afin d'atteindre une résolution temporelle élevée. Cela limite généralement l'imagerie aux trois premiers ordres de capillaires. Deuxièmement, les lasers des microscopes à deux photons doivent être parfaitement alignés. Le mauvais alignement laser décentralisera faussement chaque cadre et augmentera la mesure du diamètre du navire. Troisièmement, le taux d'échantillonnage de l'imagerie 3D est capable de capter les RCR lents et les changements lents de calcium dans les astrocytes. 1-2 Hz par pile n'est toujours pas assez rapide pour étudier les RVR rapides11 ou les signaux de calcium rapide dans les astrocytes12,13.
En outre, afin d'affecter les vaisseaux d'intérêt localement, nous avons optimisé la procédure d'insertion précise d'une micro-pipette en verre dans un endroit spécifique du cortex cérébral de la souris. Il y a plusieurs étapes critiques pour l'application réussie de cette méthode. Tout d'abord, l'angle du support de micro-pipette en verre doit être soigneusement ajusté. Il devrait permettre à la micro-pipette de manœuvrer librement sous l'objectif et le couvercle en verre au-dessus du cortex exposé. Deuxièmement, lors de l'insertion de la micro-pipette en verre dans la couche d'agarose et le cortex, une petite pression de fixation est nécessaire pour garder la pointe de pipette non obstruée. Cependant, la prudence doit être exercée de ne pas appliquer une pression de maintien trop grande de sorte que le composé ne fuit pas avant de souffler. Troisièmement, le soufflage de la pipette doit être testé en couche d'agarose au-dessus du cerveau pour trouver la pression optimale et la durée libérant suffisamment de composé soufflant sur une bouffée tout en n'introduisant pas un déplacement évident des cellules et des vaisseaux en raison de la mécanique pression.
Afin de mesurer plus précisément la vitesse du CVR, la vitesse de balayage du volume devrait être améliorée. Il existe d'autres microscopes à balayage de volume nouvellement mis au point, par exemple, un microscope à deux photons avec déflecteur optique acoustique (AOD) scanne aussi vite que 5 volumes par seconde avec la même résolution spatiale et la même taille de volume (communication par courriel). Les microscopes à feuilles de lumière scannent même une plus grande taille de volume (350 m x 800 m x 100 m) avec 10 volumes par seconde14.
Notre préparation de souris a également des limites. La chirurgie aigue de souris peut avoir des complications potentielles. La médecine de soulagement de la douleur et l'anesthésie peuvent affecter les réponses neurovasculaires. La neuroinflammation aigue peut également être déclenchée, ayant pour résultat l'activation microgliale et la leucocytose dans les tissus et les vaisseaux corticaux. Bien que la taille de la pointe des micropipettes en verre soit généralement très petite (1 m), la procédure d'insertion et la bouffée d'ATP pourraient également déclencher la migration microgliale et l'adoption du site d'insertion dans les 0,5-1 heure après l'insertion.
En conclusion, la combinaison de la formation image 3D dans la microscopie à deux photons et de la micropipette en verre soufflé localisé est un outil avancé pour étudier les activités neurovasculaires et leur mécanisme.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la Fondation Lundbeck, la Fondation NOVO-Nordisk, le Conseil danois pour la recherche indépendante . Medical Sciences, et la subvention de la Fondation NORDEA au Center for Healthy Aging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
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