Summary
Vi præsenterer en optimeret lokal udslyngning procedure ved hjælp af en glas mikro-pipette og en hurtig to-photon hyperstack Imaging metode, som tillader præcis måling af kapillar diameterændringer og undersøgelse af dens regulering i tre dimensioner.
Abstract
Vedligeholdelse af normal hjernefunktion kræver en tilstrækkelig og effektiv forsyning af ilt og ernæring af et komplekst netværk af fartøjer. Men reguleringen af cerebral blodgennemstrømning (CBF) er ufuldstændigt forstået, især på kapillar niveau. To-foton mikroskopi er et kraftfuldt værktøj, der anvendes i vid udstrækning til at studere CBF og dens regulering. I øjeblikket er dette felt begrænset af manglen på in vivo to-photon mikroskopi undersøgelser, der undersøger (1) CBF svar i tre dimensioner, (2) udført vaskulære reaktioner, og (3) lokaliserede interventioner i det vaskulære netværk. Her beskriver vi en 3D in vivo metode ved hjælp af to-foton mikroskopi at studere udført vaskulære reaktioner fremkaldt af lokale udslyngning af ATP med en glas mikro-pipette. Vores metode bruger hurtig og gentagen hyperstack to-photon Imaging giver præcise diameter målinger ved maksimal intensitet projektion af de opnåede billeder. Desuden viser vi, at denne metode også kan bruges til at studere 3D astrocytiske calcium svar. Vi diskuterer også fordele og begrænsninger af glas mikro-pipette indsættelse og to-photon hyperstack Imaging.
Introduction
Hjernen har en høj energiforbrug sats. Omkring 20% af ilt og 25% af glukose forbruges af den menneskelige krop er dedikeret til hjernens funktion, mens hjernen kun fylder 2% af den samlede kropsmasse. Vedligeholdelse af normal hjernefunktion kræver en tilstrækkelig og effektiv forsyning af ilt og ernæring ved blodgennemstrømning i et komplekst netværk af fartøjer. Lokal hjerneaktivitet og cerebral blodgennemstrømning (CBF) er robust koblet, afhængigt af de funktionelle egenskaber af neuroner, astrocytter, pericytes, glatte muskelceller (SMCs) og endotelceller (ECs)1. For nylig, de første par ordrer af kapillærer forgrening fra penetratering arterioler er dukket op som en ' hotspot '2, der viser aktiv regulering af kapillar blodgennemstrømning. En langsom gennemført vaskulær respons (CVR) blev opdaget på dette ' hotspot ' i mus somatosensorisk cortex under både hale-stimulation og lokal udslyngning (puffing) af ATP med en glas mikro-pipette3.
Selv om in vivo Imaging af to-photon Laserscanning fluorescerende mikroskopi har været meget anvendt til at studere neurovaskulære reaktioner i hjernebarken, de fleste af undersøgelserne målte blodkar diametre og undersøgte deres regulering i en to-dimensionelle (2D) x-y-plan. Udfordringerne er: for det første, cerebrale blodkar og deres omfavnende astrocytter, pericytes og Smc'er konstruere grene i tre dimensioner (3D). Det er derfor afgørende at studere deres interaktioner i 3D. For det andet vil selv en lille mængde afdrift i fokus påvirke den præcise måling af både fartøjs diametre og cellulære fluorescerende signaler. Endelig er CVRs hurtige og vidtrækkende i tre dimensioner. 3D-volumen scanning er optimal til påvisning af Cvr'er og afsløring af deres mekanismer. Vi implementeret en piezo motor mål i en to-foton mikroskop til at studere mus somatosensorisk cortex in vivo, tillader præcise diameter målinger af maksimal intensitet fremskrivninger af de opnåede billeder.
Glas Mikropipetter er ofte blevet anvendt til in vivo hjernestudier, fx til bulk-Load organiske farvestoffer4, Optag EEGs5 og til patch fastspænding6. Ikke desto mindre er begrænsningerne tilbage. Almindeligvis er spidsen af glas mikropipetten upræcist placeret, eller mikropipetten bruges ikke til lokale indgreb. Her har vi optimeret proceduren for indsættelse af mikro-pipette og lokal udslyngning.
Desuden, kombinationen af 3D to-photon mikroskopi og genetisk kodede fluorescerende indikatorer giver en hidtil uset mulighed for at undersøge Neuro vaskulær kobling i en 3D-rækkevidde. I denne undersøgelse, vi tog fordel af dette og injiceres virale vektorer transporterer astrocyt specifikke genetisk kodede calcium indikatorer i musen somatosensorisk cortex. Astrocytter samt fartøjs diametre blev afbildet samtidig ved at kombinere forskellige fluorescerende markører.
Samlet set præsenterer vi en optimeret metode til lokal udslyngning (puffing) af glas mikro-pipette og hurtig to-photon hyperstack Imaging, som giver mulighed for præcis måling af kapillær diameterændringer. Desuden, vores metode giver et nyt værktøj til samtidig studere 3D-profiler af ca2 + svar i astrocytter og vaskulære diameter svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr, er godkendt af den danske nationale etiske komité i henhold til retningslinjerne i det Europæiske Råds konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål, og overensstemmelse med retningslinjerne for ankomst. Dette er en Terminal procedure med mus, der er aflives forud for bedøvelsesmiddel opsving.
1. forberedelse før operationen
- Rengør operationsbordet og hele det omgivende område med 70% ethanol. Rengør og tør de kirurgiske værktøjer grundigt før operationen.
- Anesthetize en NG2DsRed mus (TG (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; begge køn; 4-8 måneder gammel) ved en peritonealdialyse injektion af ketamin + xylazin (60 mg/kg + 10 mg/kg) opløst i steriliseret vand, pH 7,4. Administrere supplerende doser af ketamin (30 mg/kg) hver 25 min indtil afslutningen af den kirurgiske procedure. Check hale og tå knibe reflekser regelmæssigt for at kontrollere dybden af anæstesi.
- Indsprøjt saltvand subkutant på fire forskellige steder på bagsiden af musen for et samlet volumen på 1 mL for at forhindre dehydrering under forsøget. For at beskytte øjnene fra udtørring, anvende øjen smøremiddel. Vedligehold kropstemperatur ved 37 °C ved hjælp af en rektal temperatursonde og varmetæppe.
2. kirurgisk indgreb
- Tracheotomi
- Placer musen på ryggen. Injicer 0,04 ml 0,5% lidocain subkutant under det planlagte snit og vent i 2 min. Lav en 10 mm lang indsnit over brystet knogle (manubrium). Adskil de submandibulære kirtler og sternothyroidemusklerne, og Udsæt derefter luftrør.
- Gør trakeostomi mellem to trakeal ringe med en saks. Isæt et lille metalrør med en længde på 16,2 mm og en diameter på 1 mm ind i luftrøret. Tilslut røret til en mekanisk ventilator og capnograph for at overvåge ekspiratorisk CO2 (figur 1a).
- Kateter indsættelse
- Injicer 0,5% lidocain (0,04 ml) subkutant under det planlagte indsnit og vent i 2 min.
- Ved hjælp af fine tip pincet forsigtigt adskille arterien fra venen. Stop blodgennemstrømningen opstrøms med en microvaskulær klemme. Snøre blodgennemstrømningen nedstrøms med en 10-0 nylon sutur ligating begge blodkar.
- Brug mikro-dissecting saks til at lave et lille snit i både arterien og venen. Sæt plastik katetre i begge blodkar. Fastgør katetre ved at stramme suturerne (8-0 eller 10-0 nylon suturer afhængig af fartøjets størrelse) uden at kompromittere kateter lumen. Fjern den microvaskulære klemme og luk huden.
- Overvåg blodtrykket via det arterielle kateter. Måle niveauer af blodgasser i arterielle blodprøver (50 μL) før og efter hvert forsøg (normale værdier: pO2, 90-120 mmHg; PCO2, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45) ved hjælp af en blodgasanalysator. Brug venekateter til infusion af fluorescein og anæstesi.
- Kraniotomi
- Barberer pels fra hovedet af musen mellem ørerne. Injicer 0,04 ml 0,5% lidocain subkutant under den planlagte indsnit og vent i 2 min.
- Tør kraniet med en 10% jern klorid opløsning for at fjerne periosteum. Skyl kraniet grundigt med saltvand. Lim en metal hoved stang til kraniet med cyanoacrylat lim og aktivator (figur 1a).
Bemærk: metal hoved stangen er 75 mm lang og 13,5 mm bred, med et rundt hul på 5 mm diameter i midten. - Bore en craniotomi med 4 mm diameter, centreret ved 0,5 mm bagved og 3 mm til højre for bregma over den rigtige sensoriske tønde cortex. Fjern Dura med en fin-tip beholder dilator.
- Dække den udsatte cortex med 0,75% agopstået gel, opløst i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF; pH = 7,4) og afkølet til 35 °C. Dæk 80-90% af kraniotomi med en glas dækseddel i en vinkel på 10-15 ° til metal hoved stangen (figur 1B), der tillader indsættelse og placering af glas mikropipetten.
- For at minimere hjernens pulseringen, lim de to hjørner af glas coveret på metal hoved stangen med cyanoacrylat lim og aktivator. Påfør Aktivatoren omhyggeligt for at undgå at komme ind i den udsatte hjerne. Skyl den limede glas dækseddel grundigt med saltvand bagefter.
- Udfør indsættelse af hale-pad stimulation Probe. Indsæt et sæt specialfremstillede bipolar elektroder (8 mm længde og 0,25 mm tykkelse) perkutant i venstre side af ansigtet for at stimulere Ramus infraorbitalis af trigeminus nerve kontralateral til kraniotomi. Placer katoden tæt på pause infraorbitalis, og Indsæt anoden i de masticatoriske muskler7. Udfør stimulation med en elektrisk stimulator med en intensitet på 1,5 mA for 1 MS i tog på 20 s ved 2 Hz.
- Ved afslutning af operationen skal der administreres en bolt på 0,05 mL fluorescein isothiocyanat-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, molekylvægt [MW] 50.000) ind i femoral vene for at mærke blodplasmaet. Afbryd ketamin og Skift anæstesi til kontinuerlig intravenøs infusion af α-chloralose (17% w/v, slutkoncentration) blandet med FITC-dextran (2% w/v, slutkoncentration) ved 0,02 mL/10 g/h. Vent ca. en halv time til stabilisering af den nye bedøvelses tilstand.
Bemærk: både FITC-dextran og α-chloralose opløses i 0,9% saltvand.
3. første to-photon Imaging session
- Overfør musen til scenen af en kommerciel to-foton mikroskop (tabel over materialer). Under både rødt fluorescerende protein (RFP, figur 1c) og grønt fluorescerende protein (gfp, figur 1c) tilstande af EPI-fluorescerende belysning, tage et billede af den udsatte cortex med en 5x mål. Brug RFP-billedet som et "kort" til indsættelse af glas-mikro-pipetten i næste session.
Bemærk: GFP ' Map ' bruges til at skelne vener/venules fra arterier/arterioler. - Udfør to-photon Imaging ved hjælp af to-foton mikroskop og en 25x 1,0 numerisk blænde (NA) vand-nedsænkning mål med piezo motor. Indstil excitation bølgelængde til 900 nm. Søg i cortex og følg hver gennemtrængende arteriole og finde dens horisontale grene (1St Order kapillærer).
- Billede penetratering arterioler og deres 1St Bestil kapillærer i hvile og under hale-pad stimulation. Se de detaljerede billeddannelses parametre i afsnit 5.
- Mark placeringer af 1St Bestil kapillærer med > 5% vasodilatation under hale-pad stimulation på RFP ' Map ' (figur 1C). Steder med < 5% vasodilatation anses for at være uden for hale-tønde cortex region.
Bemærk: Hvis du bruger Wild-type mus i stedet for NG2DsRed mus i eksperimentet, bruges GFP-billedet som "map" i stedet.
4. isætning af glas mikro-pipette
- Forbered glas mikro-pipetter til puffing ved hjælp af en pipette aftrækker (tabel over materialer). Glas mikro-pipetterne har en modstand på 3-3.5 MΩ og en tilspidst længde på 4,5-5 mm. Læg en pipette med en blanding af 1 mM ATP og 10 μM Alexa 594 for at visualisere pipettespidsen under EPI-fluorescerende lampe og to-foton mikroskop.
- Monter glas mikro-pipetten på en patch clamp holder og Tilslut den til en luftpumpe. Indstil pumpens holde tryk til 0 PSI.
- Brug rød EPI-fluorescerende belysning, Fokuser på pipettespidsen med 5x-målet. Placer glas mikro-pipetten i aCSF over den agopstået. Juster holde trykket af luftpumpen til 0,2 PSI. En lille rød Sky kan observeres udslyndelse ud af pipettespids i aCSF. Dette er for at forhindre tilstopning under pipette indsættelse.
- Vælg en af de markerede placeringer i RFP ' Map ' som destination. Flyt pipettespidsen til det vandrette plan på dækglas kanten med en afstand på 30 μm, som omtrent peger mod destinationen i x-y-planet.
- Sænk forsigtigt pipettespidsen i z-aksen under dækslet glas sedlen. Begynd derefter at fremskynde glas pipetten mod destinationen indtil ~ 500 μm over hjerne overfladen. Skift fokus hyppigt mellem dækglas kanten, pipettespidsen og hjerne overfladen, og sørg for, at der er tilstrækkelig ledig plads til at flytte pipetten.
- Skift målsætningen til 25x. Re-centrer pipettespidsen og fremad pipettespidsen længere mod destinationen på RFP ' Map '. Opbevar pipettespidsen i det agrose lag.
- Når pipettespidsen er ~ 100 μm over hjernens overflade, skal du skifte billedtilstand til to-foton-mikroskopi. Fokuser på en målplacering, hvor der skal puffe. Notér dens x-, y-koordinater (x0, y0) og dens dybde under overfladen (z0). Beregn koordinaterne for indsætningspunktet på hjernens overflade (xi, yi) som følger:
xi = x0 + z0 /Tan ©
yi = y0
hvor ε er vinklen mellem pipette holderen og det vandrette plan. - Anbring pipettespidsen på koordinaterne (xi, yi) på hjernens overflade. Forsigtigt og langsomt indsætte pipetten, indtil den når (x0, y0, z0). Hvis et fartøj er i vejen for en indsættelses kurve, trækkes pipetten ud og genberegnes andre indsætnings koordinater og-kurve. eller drej scene pladen en anelse (som angivet i figur 1A).
- Indstil pumpens holde tryk ved 0 PSI og udslyngning tryk ved 10-15 PSI. Puff ATP til 200-400 MS på målet placering under to-photon Imaging. Juster trykket og varigheden af puffing for hver pipette og over tid som forklaret i diskussionsafsnittet.
5. hyperstack to-photon Imaging
- Udfør eksperimenter ved hjælp af to-foton mikroskop og en 25 x 1,0 NA vand-nedsænkning mål med piezo motor. Indstil excitation bølgelængde til 900 nm. Filtrer det udsendte lys for at indsamle rødt lys fra DsRed (pericytes)/tetramethylrhodamin isothiocyanat-dextran (TRITC-dextran) farvning blodplasma og grønt lys fra FITC-dextran (blodplasma)/GCaMP6 (GFP, astrocytisk calcium).
- Producere en høj opløsning z-stak på placeringen af interesse, der indeholder en penetratering arteriole, en 1St Order kapillar, en 2nd for kapillær og muligvis tilstødende fluorescerende celler (f. eks, pericytes, astrocytter). Bestem x * y * z volumen af hyperstack Imaging ved at medtage 3D struktur af blodkarrene så meget som muligt. Den totale højde af hver stak kan variere fra 30-50 μm, mens x-y-planet groft dækker et areal på 60 μm x 40 μm.
- Indstil billed stakken i billedbehandlings softwaren til at bestå af 8-10-fly med en Inter-plane afstand på 4-5 μm. Den piezo-motoriske mål stopper på hvert niveau på z-aksen for at erhverve billedet af hvert fly. Samplingfrekvensen er 1 s pr. stak, og pixel opløsningen i x-y-planet er 0,2-0,3 μm (figur 2A). En optagelse indeholder normalt 10 præ-puff billede stakke og 150 post-puff billede stakke.
6. data behandling
- Behandle data ved hjælp af skræddersyet analytisk software. Samkopier hver billedstak til ét billede med maksimal intensitet projektion (figur 2B). Tegn et rektangulært område af interesse (ROI) med en bredde på 3 μm vinkelret på tværs af beholderen af interesse (figur 2C).
- For at minimere interferens fra skygger af røde blodlegemer og fra mindre vibrationer i cortex, gennemsnit den rektangulære ROI ved at projicere det i en linje, som derefter repræsenterer den gennemsnitlige profil af fartøjet segment. Gør dette for hver maksimal intensitet billede.
- Afbild profil linjerne som et 2D-billede med x-aksen, der repræsenterer maksimal intensitets billeder i kronologisk rækkefølge (figur 2D, øverste panel). Brug en aktiv kontur algoritme (Chan-Vese segmentering) til at finde kanterne af fart øjet 8,9 (indikeret med røde kurver; Figur 2 D, øvre panel).
- Beregn tidsforløbet for diameteren ændringer som forskellen mellem kanterne af blodkar (lodret afstand mellem de øvre og nedre røde kurver i figur 2D, lavere panel). Normalisere diameterændringer til præ-puffing diameter baseline og plot kurver af diameter ændre over tid. Gør dette for hvert ROI (figur 2E).
- Fartøjets respons amplitude er defineret som den højeste/laveste spids amplitude efter puffing. Respons forsinkelsen defineres som latenstid for halv-Max amplitude (figur 2G). Spor manuelt den skeleterede vaskulære struktur ved at placere knudepunkter langs skibene (figur 2F) og måle den geografiske afstand mellem hvert ROI og den gennemtrængende arteriole. Beregn CVR-hastighed ved at dividere distancerne med forskelle i ventetid.
7. viral vektor injektion
- For samtidig at studere astrocytiske calcium respons, injicere et volumen på 0,6 μL viral vektor (pZac 2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) i den somatosensoriske cortex af NG2DsRed mus, efter den standard Stereotaktisk viral vektor injektion procedure 10.
- Efter tre uger udtrykker astrocytter i mus somatosensorisk cortex den genetisk kodede calcium indikator, GCaMP6f. Følg den førnævnte kirurgiske procedure og to-foton Imaging til mus. For at skelne mellem astrocytter og fartøj Lumina anvendes TRITC-dextran i stedet for FITC-dextran til at plette skibet Lumina Red.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når operationen var færdig, blev mus transporteret til to-foton mikroskop (figur 1A). En mikropipette af glas indeholdende 1 mM ATP blev indsat i nærheden af bestemmelses beholderen på målstedet (figur 1B).
Vi udførte hyperstack Imaging, mens vi gav et pust på 1 mM ATP (figur 2a, supplerende video 1). Hver billedstak blev fladt til ét billede ved maksimal intensitet projektion (figur 2B). Rektangulære ROIs blev anbragt vinkelret overfart øjet for at måle skibets diameter ændring ved ATP puffing (figur 2C). Fartøjs diametre blev målt ved hjælp af Chan-Vese segmentering (figur 2D). I enkelt pust optagelser blev normaliserede diameterændringer ved hvert ROI overlagt for at sammenligne svarene fra forskellige fartøjs segmenter (figur 2E). Afstanden fra hvert ROI til gennemtrængende arteriole blev beregnet ved hånd tegning af det vaskulære skelet (figur 2F). Amplituder og latorer af didilation og konstriktion ved hver ROI i enkelt pust optagelser blev afbildet over de beregnede afstande fra ROIs til penetrateret arteriole (figur 2H-K). Vasodilatation ved puffing formeret lineært med en hastighed på 14,69 μm/s (upstream) og af 2,8 μm/s (nedstrøms), begyndende fra krydset af 1St og 2nd Bestil kapillærer (figur 2H). Vasokonstriktion opformeret også lineært ved 3,92 μm/s, startende fra den penetraterede arteriol (figur 2I). Maksimal amplitude af både vasodilatation og vasokonstriktion forekom i 1St for kapillærer (figur 2J-K).
Desuden, kombinere astrocyt-specifikke viral vektor-transporterer fluorescerende calcium indikatorer og to-photon hyperstack Imaging, astrocytiske calcium svar til ATP puffing blev undersøgt (figur 3A, supplerende video 2 ). Rektangulære ROIs blev placeret på astrocytiske somata og processer. ATP induceret en stigning i intracellulære calcium i astrocytiske processer, men ikke i astrocyt somata (figur 3B).
Figur 1 : Diagram af in vivo to-foton 3D Imaging og glas mikropipette puffing. (A) den anæstetiserede mus er hoved-fastgjort til en metalstang og mekanisk ventileret. End-Tidal CO2 overvåges af en capnograph. Både hale-pad stimulation og mikro-pipette puffing bruges til at fremkalde vaskulære diameterændringer. Glas mikro-pipette holderen er monteret på Stage pladen. Den femorale arterie og vene er kateteriseret til at overvåge blodtrykket og blodgasser, og til at indgyde anæstesi og fluorescein, hhv. B) glas dæksedlen dækker kraniotomi i en vinkel, som giver mulighed for fri bevægelighed for pipetten. Den puffing mikro-pipette er placeret i nærheden af en penetrateret arteriole og dens kapillærer og indeholder en blanding af 10 μM Alexa 594 (rød farve i glas mikro-pipette) og 1 mM ATP. De to-photon Imaging er en hurtig og gentagen 3D volumen scanning, der omfatter penetratering arteriole og de første par ordre kapillærer, samt tilstødende astrocytter og pericytes. C) der vises repræsentative billeder af rødt fluorescerende protein (RFP) og grønt fluorescerende protein (gfp) ved hjælp af EPI-fluorescerende belysning. De bruges som "kort" under pipette indsættelse. Røde cirkler markerer placeringer af 1St Bestil kapillærer med > 5% vasodilatation under hale-pad stimulation. Skala bjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : ATP puffing ved mikro-pipette inducerer fartøjs dilatation, efterfulgt af konstriktion. A) kaskade af fly i en repræsentativ billedstak, herunder gennemtrængende arteriol og 1St og 2nd Bestil kapillærer. Pericytes er mærket med en rød fluoroforet (NG2-dsred) og skibet lumen er mærket med FITC-dextran (grøn). (B) maksimal intensitet projektion af billed stakken. (C) flere unikt farvede områder af interesse (Rois) placeret vinkelret på tværs af Vaskulaturen at måle skibets diameter. (D) top, repræsentativ fluorescerende intensitet over tid ved den mørke blå ROI fra panel C. De to røde kurver definerer kanterne af fartøjs væggen. Den lodrette afstand mellem de to røde kurver er fartøjets diameter og vises som en funktion af tiden (nederst). (E) normaliseret diameter ændrer sig over tid ved hvert ROI som reaktion på 1 mm ATP puffing. Målingerne er baseret på et enkelt eksperiment. F) det vaskulære skelet blev manuelt sporet ved at anbringe knuder langs beholderne. (G) amplituder ved dilatation eller konstriktion blev defineret som henholdsvis maksimalt positivt eller negativt vaskulær respons under optagelses sessionen. Latensen af dilatationer og konstriktioner blev rapporteret som tid til halvt positivt eller negativt maksimum efter puffing debut. (H-K) Grafer viser latenstid af dilatation (H), latenstid af konstriktion (i), amplituden af dilatation (J), og amplituden af konstriktion (K) af alle Rois vist i panel C versus afstanden af hver ROI fra gennemtrængende arteriole. De stiplede linjer repræsenterer den lineære tilpasning af upstream-og downstream-ledende responser. p.a.: penetratering af arteriole. Skala bjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : ATP puffing ved mikro-pipette inducerer astrocytiske calcium aktiviteter. (A) astrocytiske virale vektorer bærer en fluorescerende calcium indikator blev injiceret i mus somatosensorisk cortex tre uger før den eksperimentelle procedure. Billede viser fartøj Lumina mærket med TRITC-dextran (rød) og astrocytisk calcium i grøn. (B) flere Rois er placeret på astrocytiske somata og processer. Ved 1 mM ATP puffing steg intracellulær calcium i astrocytiske processer, men ikke i somata (punkterede kasser), hvor calcium niveauer større end middelværdien plus 1,5 x standardafvigelse blev defineret som signifikant. Skala bjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: Time-Series film fladtrykt fra hyperstack Imaging af fartøjer som reaktion på puffing af 1 mm ATP. Grøn: FITC-dextran, farvnings beholderen lumen. Rød: NG2DsRed, farvning pericytes. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Supplerende video 2: Time-Series film fladtrykt fra hyperstack Imaging af astrocytisk calcium som reaktion på puffing af 1 mm ATP. Grøn: astrocytisk calcium. Rød: TRITC-dextran, farvnings beholderen lumen. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En udfordring for vaskulære undersøgelser er den præcise måling af fartøjs diametre. Den metode, vi beskriver her brugt en motoriseret piezo mål at gøre hurtig og gentagen hyperstack Imaging af to-photon mikroskopi. For det første, denne metode giver mulighed for gentagne undersøgelser af penetrateret arteriole, 1St orden og 2nd Bestil kapillærer uden tab af fokus og førte til opdagelsen af langsomt gennemført vaskulære reaktioner i kapillærer in vivo. For det andet, i kombination med en viral vektor injektion teknik, det giver os mulighed for at undersøge astrocytiske calcium svar i tre dimensioner, som er nødvendig for undersøgelser af blodgennemstrømning regulering.
Denne metode er ikke uden begrænsninger. For det første er et snævert rektangulært synsfelt defineret før 3D-billeddannelse for at opnå høj tidsmæssig opløsning. Dette begrænser normalt billeddannelse til første tre ordrer af kapillærer. For det andet, lasere af to-foton mikroskoper skal være perfekt afstemt. Laser forskydning vil fejlagtigt de-centrere hver ramme og øge skibets diameter måling. For det tredje er stikprøve frekvensen for 3D-billeddannelse i stand til at opfange langsomme Cvr'er og langsomme calcium ændringer i astrocytter. 1-2 Hz pr. stak er stadig ikke hurtigt nok til at studere hurtige cvrs11 eller hurtige calcium signaler i astrocytter12,13.
Desuden, for at påvirke fartøjer af interesse lokalt, vi har optimeret proceduren for præcis indsættelse af en glas mikro-pipette til en bestemt placering af mus hjernebarken. Der er flere kritiske trin for en vellykket anvendelse af denne metode. For det første skal vinklen på glas mikro-pipette holderen justeres omhyggeligt. Det bør gøre det muligt for mikro-pipetten at manøvrere frit under målet og glasset dækslip over den udsatte cortex. For det andet, under indsættelse af glasset mikro-pipette ind i agopstået lag og cortex, et lille holde tryk er nødvendig for at holde pipetten spids onlogget. Der skal dog udvises forsigtighed for ikke at anvende for stort et holde tryk, således at forbindelsen ikke lække før puffing. For det tredje skal den puffing af pipetten testes i agopstået lag over hjernen for at finde det optimale tryk og varighed frigive nok puffing sammensatte på et pust, mens ikke indføre en indlysende forskydning af celler og fartøjer på grund af mekanisk Pres.
For at kunne foretage en mere præcis måling af CVR-hastigheden bør volumen scanningshastigheden forbedres. Der er andre nyudviklede volumen-scanning mikroskoper, for eksempel, en to-foton mikroskop med en akustisk optisk deflektor (AOD) scanner så hurtigt som 5 volumener per sekund med den samme rumlig opløsning og volumen størrelse (e-mail kommunikation). Lysplade mikroskoper scanner selv en større volumen størrelse (350 μm x 800 μm x 100 μm) med 10 volumener pr. sekund14.
Vores mus forberedelse har også begrænsninger. Akut mus kirurgi kan have potentielle komplikationer. Smertelindring medicin og anæstesi kan påvirke Neuro vaskulære reaktioner. Akut neuroinflammation kan også udløses, resulterer i microglial aktivering og leukocytose i kortikale væv og fartøjer. Selv om spidsen størrelse af glas mikro-pipetter er normalt meget lille (< 1 μm), indsættelsesproceduren og ATP puffing kunne også potentielt udløse mikroglial migration og suboptimale af indsættelse site inden 0.5-1 time efter indsættelse.
Afslutningsvis, kombination af 3D-billeddannelse i to-foton mikroskopi og lokaliseret puffing glas mikro-pipette er et avanceret værktøj til at studere neurovaskulære aktiviteter og deres mekanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Lundbeck fonden, NOVO Nordisk Fonden, det danske råd for uafhængig forskning | Lægevidenskab, og NORDEA Foundation Grant til Center for sund aldring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
