Summary
אנו מציגים הליך הוצאה מקומית אופטימיזציה באמצעות זכוכית מיקרו-פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack שיטה הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויים בקוטר נימי וחקירה של התקנה שלה בשלושה ממדים.
Abstract
אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי רשת מורכבת של כלי קיבול. עם זאת, התקנה של זרימת דם מוחית (CBF) הוא מובן לחלוטין, במיוחד ברמת נימי. מיקרוסקופ שני פוטון הוא כלי רב עוצמה הנפוץ לחקר CBF והרגולציה שלה. כיום, שדה זה מוגבל על ידי העדר vivo שני פוטון במחקרים מיקרוסקופ בדיקה (1) התגובות CBF בשלושה מימדים, (2) ביצע תגובות כלי דם, ו (3) התערבויות מקומיות בתוך הרשת כלי הדם. כאן, אנו מתארים 3D בשיטה vivo באמצעות שני-פוטון מיקרוסקופ למחקר שנערכו תגובות כלי דם הרוויח על ידי הוצאה מקומית של ATP עם מיקרו פיפטה זכוכית. השיטה שלנו משתמשת hyperstack מהיר וחוזר הדמיה שני-פוטון מתן מדידות בקוטר מדויק על ידי הקרנת עוצמה מקסימלית של התמונות שהתקבלו. יתר על כן, אנו מראים כי שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור תגובות astrocytic סידן 3D. אנו דנים גם את היתרונות והמגבלות של החדרת מיקרו-פיפטה זכוכית, שני פוטון hyperstack הדמיה.
Introduction
למוח יש שיעור צריכת אנרגיה גבוהה. כ-20% מהחמצן ו -25% מהגלוקוז הנצרך על ידי גוף האדם מוקדשים לתפקוד מוחי, בעוד המוח תופס רק 2% ממסת הגוף הכוללת. אחזקה של תפקוד המוח הרגיל דורש אספקה מספקת ויעילה של חמצן ותזונה על ידי זרימת הדם ברשת מורכבת של כלי קיבול. פעילות מוחית מקומית וזרימת דם מוחית (cbf) הם מכבש בהתאם למאפיינים הפונקציונליים של נוירונים, אסטרוציטים, קרום הלב, תאים שריר חלק (smcs) ותאי האנדותל (ecs)1. לאחרונה, ההוראות הראשונות של נימים מסתעפת מפני חדירה בתוך העורקים הופיעו כ-"נקודה חמה"2, מראה התקנה פעילה של זרימת דם נימי. תגובה איטית של כלי הדם (CVR) התגלתה ב נקודה חמה זו בקליפת המגע של העכבר במהלך גירוי הויקר והפליטה המקומית (לעשן) של ATP עם מיקרו פיפטה מזכוכית3.
למרות בvivo הדמיה של שני פוטון לייזר סריקה מיקרוסקופ פלורסנט כבר בשימוש נרחב ללמוד תגובות נוירונימי בקליפת מוחין, רוב המחקרים שנמדדו בכלי הדם קטרים וחקר הרגולציה שלהם ב מישור x-y דו-ממדי (2D). האתגרים הם: ראשית, כלי דם מוחין והאסטרוציטים החובק שלהם, קרום הלב ו SMCs לבנות ענפים בשלושה ממדים (3D). לכן חשוב ללמוד את האינטראקציות שלהם ב-3D. שנית, אפילו כמות קטנה של סחיפה בפוקוס ישפיע על המדידה המדויקת של שני קטרים ואותות פלורסנט סלולריים. לבסוף, CVRs הם מהירים ומרחיקי לכת בשלושה מימדים. סריקת נפח תלת-ממד היא אופטימלית לזיהוי CVRs וחשיפת המנגנונים שלהם. אנו הטמיעה מטרה piezo מנוע במיקרוסקופ שני פוטון ללמוד קליפת המגע של העכבר בvivo, המאפשר מדידות קוטר מדויק על ידי התחזיות אינטנסיביות מקסימלית של התמונות שהתקבלו.
זכוכית מיקרו-פיפטות לעתים קרובות נעשה שימוש במחקרים במוח vivo, למשל, כדי לטעון בצובר צבעים אורגניים4, שיא eegs5 ועבור תיקון לסדר6. עם זאת, נותרו מגבלות. בדרך כלל, הקצה של מיקרו פיפטה זכוכית הוא imprecisely ממוקם, או מיקרו פיפטה לא משמש התערבויות מקומיות. כאן, יש לנו אופטימיזציה ההליך של החדרת מיקרו פיפטה והוצאה מקומית.
יתר על כן, השילוב של 3D two-פוטון מיקרוסקופ ו מקודד גנטית מחוונים פלורסנט מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור צימוד וסקולרית בטווח תלת-ממד. במחקר זה, ניצלנו את זה והזריקו וקטורים ויראליות נושאת מחווני סידן מהונדסים גנטית מסוימת לתוך קליפת המגע של העכבר. האסטרוציטים כמו גם קטרים של כלי היו התמונה בו על ידי שילוב סמנים פלורסנט שונים.
באופן כללי, אנו מציגים שיטה ממוטבת של הוצאה מקומית (לעשן) על ידי זכוכית מיקרו פיפטה ומהיר שני פוטון hyperstack הדמיה, אשר מאפשר מדידה מדויקת של שינויי קוטר נימי. בנוסף, השיטה שלנו מספקת כלי הרומן ובמקביל לחקור פרופילי 3d של Ca2 + תגובות אסטרוציטים ו בקוטר כלי דם תגובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הלאומית הדנית לפי ההנחיות שנקבעו באמנת המועצה האירופית להגנת בעלי חיים בעלי חוליות המשמשים למטרות נסיוניות ומדעיות אחרות. היו בהתאם להנחיות הגעה. זהו נוהל מסוף עם העכברים להיות מורדמים לפני התאוששות הרדמה.
1. הכנה טרום כירורגי
- נקו את שולחן הניתוחים ואת כל האזור שמסביב עם 70% אתנול. לנקות ולייבש ביסודיות את כלי הניתוח לפני הניתוח.
- הNG2DsRed עכבר (Tg (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; שניהם מינים; 4-8 חודשים בן) על ידי הזרקת הצפק של קטמין + xylazine (60 mg/ק"ג + 10 מ"ג/ק"ג) הומס מים מעוקר, pH 7.4. ניהול מינונים משלימים של קטמין (30 מ"ג/ק"ג) כל 25 דקות עד השלמת ההליך הכירורגי. בדוק הזנב ואת הרפלקסים צביטה באופן קבוע כדי לוודא את עומק ההרדמה.
- הכנס מלוחים תת-עורי בארבעה מיקומים שונים בגב העכבר עבור נפח כולל של 1 mL כדי למנוע התייבשות במהלך הניסוי. כדי להגן על העיניים מפני ייבוש, להחיל סיכה העין. לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ° צ' באמצעות בדיקה טמפרטורה רקטלית ושמיכה חימום.
2. הליך כירורגי
- פיום קנה
- הניחו את העכבר על גבו. הכנס 0.04 mL של 0.5% לידוקאין תת-עורי תחת החתך המתוכנן ולחכות 2 דקות. לעשות חתך 10 מ"מ ארוך מעל עצם החזה (נובריום). הפרד את בלוטות הלסת התחתונה ואת השרירים הסטרתירואיד, ואז לחשוף את קנה הנשימה.
- מבצע הקנה הנשימה בין שתי טבעות קנה הנשימה עם מספריים. הכנס צינור מתכת קטן עם אורך של 16.2 מ"מ קוטר של 1 מ"מ לתוך קנה הנשימה. חבר את הצינור למכונת ההנשמה והקפינוגרף כדי לפקח על הקצההשני (איור 1א).
- צנתר החדרת
- הכנס 0.5% לידוקאין (0.04 mL) תת-עורי תחת החתך המתוכנן ולחכות 2 דקות.
- שימוש בעזרת מלקחיים דקים. מפריד בעדינות את העורק מהווריד הפסיקו את זרימת הדם במעלה הזרם בעזרת מהדק מיקרוכלי-דם. מחבר את זרימת הדם במורד הזרם עם תפר ניילון 10-0 ליגגאת שני כלי הדם.
- השתמש במספריים לניתוח מיקרו כדי ליצור חתך קטן בעורק ובווריד. הכנס קטטרים פלסטיק לתוך כלי הדם. לאבטח את הקטטרים על ידי הידוק התפרים (8-0 או 10-0 התפרים ניילון תלויים בגודל הכלי) מבלי להתפשר על קטטר לומן. הסר את המלחציים מיקרוכלי דם וסגור את העור.
- מוניטור לחץ דם דרך קטטר העורקים. רמות מדידה של גזים בדם בדגימות דם עורקי (50 μL) לפני ואחרי כל ניסוי (ערכים נורמליים: pO2, 90-120 Mmhg; pco2, 35-40 mmhg; pH, 7.25-7.45) באמצעות מנתח גז דם. השתמש בצנתר הווריד לעירוי. של פלואורואסעין והרדמה
- פתיחת גולגולת
- לגלח את הפרווה מהראש של העכבר בין האוזניים. הכנס 0.04 mL של 0.5% לידוקאין תת-עורי תחת החתך המתוכנן ולחכות 2 דקות.
- לנגב את הגולגולת באמצעות 10% ברזל כלוריד פתרון כדי להסיר את קרום המוח. לשטוף את הגולגולת ביסודיות עם תמיסת מלח. הדבק בר מתכת ראש לגולגולת עם דבק ציאנואקרילי וactivator (איור 1א).
הערה: בר המתכת בראש הוא 75 מ"מ ורוחבו 13.5 מ"מ, עם חור עגול בקוטר 5 מ"מ במרכז. - קדוח בפתיחת גולגולת בקוטר 4 מ"מ, ממורכזת ב-0.5 מ"מ ושלושה מ"מ מימין לברגמה מעל קליפת החבית החושית הנכונה. הסירו את השכבה. בעזרת כלי קיבול משובח
- כסו את קליפת המוח החשופה עם 0.75% agarose ג'ל, מומס בנוזל מלאכותי שדרתי (aCSF; pH = 7.4) ומקורר ל 35 ° c. כיסוי 80-90% של פתיחת הגולגולת עם שמיכות זכוכית בזווית של 10-15 ° לראש מתכת בר (איור 1B) המאפשר החדרת ומיקום של זכוכית מיקרו-פיפטה.
- כדי למזער את המוח, הדבק את שתי הפינות של שמיכות הזכוכית על הראש מתכת בר עם דבק ציאנואקרילט ו activator. החילו את הactivator בקפידה כדי למנוע ממנו לעלות על המוח החשוף. לשטוף את שמיכות זכוכית מודבק ביסודיות עם תמיסת מלח לאחר מכן.
- לבצע הוספה של הבדיקה גירוי משטח הקצקר. הוספת קבוצה של אלקטרודות דו קוטבית מותאמות אישית (8 מ"מ אורך ועובי 0.25 מ"מ) percutaneously לתוך הצד השמאלי של הפנים כדי לעורר את התשתיות הרמוס של הממברנה העצבית הפרעה לפתיחת הגולגולת. הציבו את הקתודה בקרבת המלון, והכניסו את האנדה לשרירי המסטיקטרי7. בצע את הגירוי עם מחזק חשמלי בעוצמה של 1.5 mA עבור 1 ms ברכבות של 20 ב 2 Hz.
- עם השלמת הניתוח, לנהל את המנת של 0.05 mL fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, משקל מולקולרי [MW] 50,000) לתוך וריד הירך כדי לתייג את פלזמה בדם. הפסק את הקטמין והעבר את ההרדמה לעירוי מתמשך של α-כלוראלז (17% w/v, ריכוז סופי) מעורבב עם FITC-dextran (2% w/v, ריכוז סופי) ב 0.02 mL/10 g/h. המתן כחצי שעה לייצוב החדש מצב הרדמה.
הערה: הן FITC-dextran ו-α-כchloralose מומס 0.9% תמיסת מלח.
3. הפעלת שני הפוטונים הראשונה
- העבר את העכבר לשלב של מיקרוסקופ דו-פוטון מסחרי (טבלת חומרים). תחת שני חלבון פלורסנט אדום (rfp, איור 1ג) וחלבון פלורסנט ירוק (gfp, איור 1ג) מצבי התאורה של אפינפרין-פלורסנט, צלם תמונה של קליפת המוח החשופה במטרה 5x. השתמש בתמונה RFP כ-' map ' להוספת מיקרו-פיפטה מזכוכית בהפעלה הבאה.
הערה: מפת ה-GFP משמשת להבחנה בין הורידים/העורקים מעורקי העורקים/העורק. - לבצע הדמיה שני-פוטון באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטון ו 25x 1.0 מספריים הצמצם (NA) מטרה טבילה המים עם מנוע piezo. הגדר את אורך הגל ל900 ננומטר. חפשו בקליפת המוח ועקבו אחר כל arteriole חודר ומצאו את הענפים האופקיים (1 מסדר נימים).
- התמונה חודר העורקי העורקיםהראשון שלהם הסדר בתוך מנוחה ובמהלך גירוי משטח החליבה. ראה את הפרמטרים המפורטים להדמיה בסעיף 5.
- סמן מיקומים בסדר 1 נימים הזמנה עם > 5% בין במהלך גירוי משטחהחלקה על rfp ' מפת ' (איור 1ג). מיקומים עם < 5% והסנה נחשבים להיות מחוץ לאזור קליפת החבית הויקר.
הערה: אם נעשה שימוש בעכברים מסוג פראי במקום בעכברים NG2DsRed בניסוי, תמונת ה-GFP משמשת כ-' map ' במקום זאת.
4. החדרת זכוכית מיקרו-פיפטה
- להכין זכוכית מיקרו-פיפטות לעשן בעזרת מיכל פולר (שולחן חומרים). מיקרו-פיפטות זכוכית יש התנגדות של 3-3.5 MΩ ואורך להתחדד של 4.5-5 מ"מ. טען פיפטה עם תערובת של ATP 1 מ"מ ו 10 μM אלקסה 594 על מנת להמחיש את טיפ הפיפטה תחת המנורה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ שני הפוטונים.
- הר זכוכית מיקרו-פיפטה על מחזיק מהדק טלאי ולחבר אותו משאבת האוויר. הפעילו את המשאבה. שמחזיקה לחץ על 0 psi
- בעזרת התאורה הפלואורסצנטית האדום, התמקד בעצת הפיפטה עם המטרה 5x. מניחים את הזכוכית מיקרו פיפטה לתוך aCSF מעל הצמח. להתאים את הלחץ החזקת של משאבת האוויר כדי 0.2 psi. ענן אדום קטן ניתן לצפות הוצאת מתוך הטיפ של פיפטה ב aCSF. זה כדי למנוע סתימת. בזמן החדרת הצנרת
- בחר באחד מהמיקומים המסומנים ב-RFP ' map ' כיעד. הזז את קצה הפיפטה אל המישור האופקי של קצה הזכוכית המכסה עם מרחק של 30 מטרים, בערך מצביע לעבר היעד במישור x-y.
- הורידו בזהירות את קצה הפיפטה בציר z מתחת למכסה הזכוכית. ואז להתחיל לקדם את הצנרת זכוכית לכיוון היעד עד ~ 500 יקרומטר מעל פני השטח המוח. מעבר מיקוד לעתים קרובות בין הקצה זכוכית המכסה, את קצה הפיפטה ואת משטח המוח, וודא שיש מספיק שטח פנוי להזזת הפיפטה.
- . העבר את המטרה ל -25 x הסנטר מחדש את קצה הפיפטה והעבר את קצה הפיפטה לכיוון היעד במפת ה-RFP. השאר את קצה הפיפטה בשכבה האגפית.
- כאשר טיפ הפיפטה הוא ~ 100 יקרומטר מעל פני המוח, החלף את מצב ההדמיה במיקרוסקופ שני-פוטון. . תתמקד במיקום מטרה לנשיפה רשום את הקואורדינטות x, y (x0, y0) והעומק שלה מתחת למשטח (z0). חשב את הקואורדינטות של נקודת ההכנסה על פני המוח (xi, yi) כדלקמן:
xi = x0 + z0 /tan θ
yi = y0
כאשר θ היא הזווית בין מחזיק הפיפטה לבין המישור האופקי. - הצב את קצה הצינורות לנקודות הציון (xi, yi) על פני המוח. הכנס את הפיפטה בעדינות ובאיטיות עד שיגיע (x0, y0, z0). אם כלי קיבול נמצא בדרכו של נתיב הכנסה, משיכת הפיפטה וחישוב מחדש של קואורדינטות הכנסה ונתיב אחרים; או הפוך את לוחית הבמה במקצת (כפי שמצוין באיור 1א).
- להגדיר את המשאבה החזקת לחץ 0 psi ולחץ הפליטה ב 10-15 psi. פאף ATP עבור 200-400 ms במיקום היעד במהלך הדמיה של שני פוטונים. כוונן את הלחץ והמשך של העשן עבור כל פיפטה ולאורך זמן כפי שהוסבר בסעיף הדיונים.
5. היפרסטאק two-פוטון הדמיה
- לבצע ניסויים באמצעות שני פוטון מיקרוסקופ ו 25 x 1.0 NA מטרה טבילה מים עם מנוע piezo. הגדר את אורך הגל ל900 ננומטר. לסנן את האור הנפלט כדי לאסוף אור אדום מ DsRed (טריולוציטים)/טטרמתיד isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) מכתים דם פלזמה ואור ירוק מ FITC-dextran (דם פלזמה)/gcamp6 (GFP, סידן אסטרוציטוטי).
- הפקת מחסנית z ברזולוציה גבוהה במיקום הריבית המכילה arteriole חודר, 1 מסדר קפילר, הזמנה 2 קפילר ואולי תאי פלורסנט השכנה (למשל, קרום הלב, אסטרוציטים). קבע את נפח x * y * z של הדמיה hyperstack על ידי כלילת מבנה תלת-ממד של כלי הדם ככל האפשר. הגובה הכולל של כל מחסנית עשוי להשתנות מ30-50 יקרומטר, בעוד המטוס x-y בערך מכסה שטח של 60 יקרומטר x 40 יקרומטר.
- הגדר את מחסנית התמונה בתוכנת הדימות כדי להיות מורכבת 8-10 מטוסים עם מרחק בין המישור של 4-5 μm. המטרה piezo-מנוע עוצרת בכל רמה על ציר z כדי לרכוש את התמונה של כל מטוס. קצב הדגימה הוא 1 למחסנית ורזולוציית פיקסל במישור x-y הוא 0.2-0.3 מטרים (איור 2א). הקלטה אחת כוללת בדרך כלל 10 ערימות תמונה טרום העלים ו 150 לאחר התמונה ערימות.
6. עיבוד נתונים
- עבד נתונים באמצעות תוכנה אנליטית שנעשתה בהתאמה אישית. משטח כל מחסנית תמונה לתמונה אחת באמצעות הקרנת עוצמה מירבית (איור 2ב'). צייר אזור מלבני של עניין (ROI) עם רוחב של 3 יקרומטר ניצב על פני כלי העניין (איור 2ג).
- כדי למזער הפרעות מפני צללים של כדוריות הדם האדומות ומתנודות קלות של קליפת המוח, הממוצע ROI מלבני על ידי הקרנת אותו לשורה אחת, אשר לאחר מכן מייצג את הפרופיל הממוצע של מקטע הספינה. עשה זאת עבור כל תמונה בעלת עוצמה מירבית.
- התווה את קווי הפרופיל כתמונה דו-ממדית עם ציר ה-x המייצג תמונות בעוצמה מירבית בסדר כרונולוגי (איור 2D, הלוח העליון). השתמש באלגוריתם מתאר פעיל (פילוח Chan-vese) כדי למצוא את הקצוות של כלי הקיבול8,9 (המצוין באמצעות עקומות אדומות). איור 2 D, הלוח העליון).
- חישוב מסלול הזמן של שינויי הקוטר כהפרש בין קצות כלי הדם (מרחק אנכי בין העקומות האדומות העליונות והתחתונות באיור 2D, הפאנל התחתון). לנרמל שינויים בקוטר בסיסית מראש קוטר ועקומות העלילה של שינוי קוטר לאורך זמן. עשה זאת עבור כל ROI (איור 2E).
- משרעת תגובת הכלי מוגדרת כשרעת השיא הגבוהה/הנמוכה ביותר לאחר הנושפת. השהיית התגובה מוגדרת כהשהיה של משרעת חצי מקסימום (איור 2G). באופן ידני לעקוב אחר מבנה כלי הדם השלד על ידי הצבת צמתים לאורך כלי (איור 2F) ומדידת המרחק הגיאוגרפי בין כל ROI לבין arteriole חודר. חישוב מהירות CVR על-ידי חלוקת המרחקים באמצעות הפרשי השהיה.
7. ויראלי הזרקה
- על מנת לחקור במקביל תגובות astrocytic סידן, להזריק נפח של 0.6 μL ויראלי וקטורי (pZac 2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) לתוך הקליפה הסוחושית של NG2DsRed עכברים, בעקבות ההליך הרגיל של הזרקה סטריאוטקטיקה ויראלית . בסדר, עשר
- לאחר שלושה שבועות, אסטרוציטים בקליפת המגע של העכבר לבטא את אינדיקטור סידן מקודד גנטית, GCaMP6f. בצע את ההליך הכירורגי הנ ל 2-פוטון הדמיה עבור עכברים. כדי להבדיל בין אסטרוציטים לבין כלי לומינה, tritc-dextran במקום fitc-dextran משמש כדי להכתים את הספינה ומינה אדום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר הניתוח הושלם, עכברים הועברו למיקרוסקופ שני פוטון (איור 1א). מיקרו פיפטה זכוכית המכילה 1 מ"מ ATP הוכנס בסמיכות לכלי הדם של היעד במיקום היעד (איור 1B).
ביצעו היפרסטאק הדמיה תוך מתן מציצה של 1 מ ל ATP (איור 2a, וידאו משלים 1). כל מחסנית תמונה ששוטחו לתמונה אחת באמצעות הקרנת עוצמה מירבית (איור 2ב). ROIs מלבני הונחו ניצב על פני כלי למדוד שינוי קוטר הספינה על ATP לעשן (איור 2ג). קטרים של כלי הדם נמדדו באמצעות פילוח של צ'אן-וייז (איור 2ד). בהקלטות של העלים בודדים, שינויים בקוטר מנורמל בכל ROI היו מצופים כדי להשוות את התגובות של מקטעי כלי שונים (איור 2E). המרחק מכל ROI לarteriole החודר היה מחושב בידי ציור השלד של כלי הדם (איור 2F). המוני והשהיות של התרחבות ומכווץ בכל ROI בהקלטות יחיד הותוו על המרחקים המחושבים מ-ROIs לarteriole החודר (איור 2H-K). שיער על העשן בצורה לינארית עם מהירות של 14.69 μm/s (במעלה) ו-2.8 μm/s (במורד הזרם), החל מהצומת של 1 ו 2 נימים הסדר (איור 2H). בנוסף, הופץ בצורה קווית ב-3.92 μm/s, החל מarteriole החודר (איור 2I). משרעת המקסימלית של שתי הואסינה והכיוון הראשון התרחשו בנימים בסדר 1 (איור 2J-K).
יתר על כן, שילוב של אסטרוציט ויראלי ספציפי וקטורי הנושאת מחווני סידן פלורסנט ו two-פוטון hyperstack הדמיה, התגובה סידן astrocyte ל-ATP לעשן נחקרו (איור 3A, וידאו משלים 2 ). ROIs מלבני הונחו ב astrocytic האסטרואטה ותהליכים. ATP המושרה עלייה בסידן תאיים בתהליכים astrocytic אבל לא ב astrocytic somata (איור 3ב).
איור 1 : תרשים של vivo שני פוטון הדמיה תלת-ממד ומיקרופיפטה זכוכית לעשן. (א) העכבר המורדם הוא קבוע בראש למוט מתכת ומאוורר מכנית. מתחת לקצה -הגאות משגיחים על ידי הקפנוגרף. שניהם גירוי משני הויקר ומיקרו-פיפטה משמשים לזירוז שינויים בקוטר כלי הדם. המחזיק זכוכית מיקרו פיפטה הוא רכוב על לוחית הבמה. עורק הירך והווריד הם צנתור לניטור לחץ דם וגזים בדם, וכלה להחדיר הרדמה ופלואורואסעין, בהתאמה. (ב) כיסוי הזכוכית מכסה את פתיחת הגולגולת בזווית, המאפשרת תנועה חופשית של הפיפטה. מיקרו פיפטה ממוקם בסמיכות של חודר arteriole ונימים שלה מכיל תערובת של 10 μM אלקסה 594 (צבע אדום במיקרו-פיפטה זכוכית) ו 1 מ"מ ATP. הדמיה דו-פוטון הוא סריקה מהירה וחוזרת של אמצעי אחסון תלת-ממדי הכוללת את arteriole חדירה ואת המספר הראשון נימים הסדר, כמו גם אסטרוציטים השכנות, קרום הגוף. (ג) תמונות מייצגות של חלבון פלורסנט אדום (rfp) וחלבון פלורסנט ירוק (gfp) באמצעות התאורה אפינפרין-פלורסנט מוצגים. הם משמשים ' מפות ' במהלך החדרת פיפטה. עיגולים אדומים מציינים מיקומים של נימים בסדר 1 עם > 5% במהלך גירוי משטח הקצרח. סרגל קנה מידה: 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : ATP מעשן על ידי מיקרו פיפטה גורם התרחבות הספינה, ואחריו מכווץ. (א) מפל של מטוסים בערימת תמונה מייצגת אחת, כולל חדירת arteriole ו -1 ו-2 נימי הסדר השני. קרום הלב מתויג עם fluorophore אדום (NG2-DsRed) ולומן כלי מתויג עם FITC-dextran (ירוק). (ב) הקרנת העוצמה המקסימלית של מחסנית התמונה. (ג) אזורים מרובים בצבע ייחודי (rois) הונחו ניצב על פני היום כדי למדוד את קוטר הספינה. (ד) למעלה, עוצמת פלורסנט מייצגת לאורך זמן ב ROI כחול כהה מ פאנל C. שתי העקומות האדומות מגדירות את קצות הקיר של כלי הקיבול. המרחק האנכי בין שתי העקומות האדומות הוא קוטר הכלי ומוצג כפונקציה של זמן (למטה). (ה) בקוטר מנורמל משתנה במשך הזמן בכל ROI בתגובה ל-1 מ"מ לעשן ATP. . מדידות מבוססות על ניסוי אחד (ו) השלד כלי הדם היה מאותר באופן ידני על ידי הצבת צמתים לאורך כלי הדם. (G) הגברה של התרחבות או מכווץ הוגדרו כמענה כלי דם חיובי או שלילי מקסימלי, בהתאמה, במהלך ההקלטה. ההשהיה של הפסקות והכסות דווחו כזמן למחצית מקסימום חיובי או שלילי לאחר הופעת התפרצות. (H-K) גרפים מראים את ההשהיה של התרחבות (H), ההשהיה של מכווץ (I), השרעת של התרחבות (J), ומשרעת המכווץ (K) של כל rois מוצג בלוח C לעומת המרחק של כל ROI מ חדירה לarteriole. הקווים המקווקו מייצגים את ההתאמה הליניארית של המעלה ותגובות מוליכי הזרם. . חדירה לarteriole סרגל קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : ATP מעשן על ידי מיקרו פיפטה שגורם לפעילויות סידן אסטרוציטיות. (א) אסטרוציטוטי וקטורים ויראליים מחוון סידן פלורסנט הוזרקו בקליפת המגע של העכבר שלושה שבועות לפני ההליך הניסיוני. התמונה מציגה את הספינה ומינה התווית עם tritc-dextran (אדום) סידן astrocytic בירוק. (ב) rois מרובים ממוקמים בתהליך astrocytic ותהליכים. על 1 מילימטר ATP לעשן, סידן תאיים גדל בתהליכים astrocytic אבל לא somata (קופסאות מנוקד), איפה רמות הסידן גדול יותר מאשר ממוצע בתוספת 1.5 x סטיית התקן הוגדרו כמשמעותיים. סרגל קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו משלים 1: סדרת זמן הסרט שיטוח מ hyperstack הדמיה של ספינות בתגובה לעשן של ATP 1 מ"מ. ירוק: FITC-dextran, צביעת כלי לומן. אדום: NG2DsRed, מכתים. כתמים בקרום הלב אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו משלים 2: סדרת זמן הסרט משוטחים מ hyperstack הדמיה של סידן astrocytic בתגובה לעשן של ATP 1 מ"מ. ירוק: סידן אסטרוציטוטי. אדום: TRITC-dextran, צביעת כלי לומן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אתגר אחד עבור לימודי כלי דם הוא המדידה המדויקת של קטרים הספינה. השיטה שאנו מתארים כאן השתמשו מטרה piezo ממונע להפוך מהיר וחוזר הדמיה היפרסטאק על ידי שני פוטון מיקרוסקופ. ראשית, שיטה זו מאפשרת בדיקות חוזרות של הarteriole חודר, 1 לסדר ו-2 נימים הזמנה ללא אובדן של מיקוד והובילו לגילוי של לאט ביצע תגובות כלי הדם נימים ב vivo. שנית, בשילוב עם טכניקת הזרקה וקטורית ויראלי, היא מאפשרת לנו לחקור תגובות הסידן astrocytic בשלושה ממדים, אשר הכרחי למחקרים של בקרת זרימת הדם.
שיטה זו אינה ללא הגבלות. ראשית, שדה תצוגה מלבני צר מוגדר לפני הדמיה תלת-ממדית כדי להשיג רזולוציה גבוהה בזמן. זה בדרך כלל מגביל את ההדמיה לשלוש הפקודות הראשונות של נימים. שנית, לייזרים של שני פוטון מיקרוסקופים חייב להיות מיושר לחלוטין. התאמת לייזר לא ממרכז כל מסגרת ולהגדיל את המדידה קוטר הספינה. שלישית, שיעור הדגימה של הדמיה תלת-ממדית מסוגל ללכוד איטי CVRs ושינויי סידן איטי astrocytes. 1-2 הרץ לכל מחסנית עדיין לא מהיר מספיק כדי ללמוד מהיר cvrs11 או אותות סידן מהיר ב אסטרוציטים12,13.
יתר על כן, כדי להשפיע על כלי העניין באופן מקומי, יש לנו אופטימיזציה הליך של החדרת מדויקת של זכוכית מיקרו פיפטה למיקום מסוים של קליפת המוח של העכבר. קיימים מספר שלבים קריטיים ליישום מוצלח של שיטה זו. ראשית, את הזווית של המחזיק מיקרו-פיפטה זכוכית חייב להיות מותאם בקפידה. זה אמור לאפשר למיקרו-פיפטה לתמרן בחופשיות מתחת למטרה ושמיכות הזכוכית מעל קליפת המוח החשופה. שנית, במהלך החדרת הזכוכית מיקרו הפיפטה לתוך שכבת הקליפה ואת קליפת המוח, לחץ מחזיק קטן הוא הכרחי כדי לשמור את הקצה הצינורות לא סתומים. עם זאת, יש להפעיל את הזהירות לא להפעיל לחץ גדול מדי כך שהמתחם לא ידלוף לפני שהוא מעשן. שלישית, העשן של הפיפטה צריך להיבדק ברובד הגבוה מעל המוח כדי למצוא את הלחץ האופטימלי והמשך שחרור מספיק מתחם על אחד העלים בזמן שהוא לא מציג תזוזה ברורה של תאים וכלים בשל מכני לחץ.
כדי ליצור מדידה מדויקת יותר של מהירות CVR, מהירות סריקה של אמצעי האחסון יש לשפר. יש אחרים מפותחים מיקרוסקופים-סריקה מיקרוסקופ, למשל, שני פוטון מיקרוסקופ עם הטיה אופטי אקוסטי (AOD) סריקות מהר ככל 5 כרכים לשנייה עם רזולוציה מרחבית זהה וגודל נפח (תקשורת דוא ל). מיקרוסקופים גיליון אור לסרוק אפילו גודל גדול יותר של נפח (350 יקרומטר x 800 יקרומטר x 100 יקרומטר) עם 10 כרכים לשנייה14.
הכנה לעכבר שלנו יש גם מגבלות. ניתוח חמור של העכבר עלול להיות סיבוכים פוטנציאליים. הקלת כאבים ברפואה ובהרדמה עלולה להשפיע על תגובות נוירונימי. דלקת ניווניות חריפה יכולה גם להיות מופעלת, וכתוצאה מכך הפעלה microglial ו-leukocytosis ברקמות הקליפת המוח וכלי הדם. למרות גודל הטיפ של זכוכית מיקרו-פיפטות הוא בדרך כלל קטן מאוד (< 1 μm), את הליך הכניסה ו-ATP לעשן יכול לגרום גם הגירה microglial והחדרת האתר הכניסה בתוך 0.5-1 שעה לאחר ההוספה.
לסיכום, שילוב של הדמיה תלת-ממדית במיקרוסקופיה דו-פוטון ומקומי, מיקרו פיפטה מותאם למדי הוא כלי מתקדם לחקר פעילויות נוירונימי והמנגנון שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרן לוננבק, קרן נובו-נורדיסק, המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הרפואה ומלגת קרן נורDEA למרכז להזדקנות בריאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma–Aldrich | A6138 | Apply upon exposed cortex for protection |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Stain puffing compound to red fluorescent color |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound |
| Cyanoacrylate glue and activator | Loctite | Adhesives and SF7452 | Glue for metal piece and coverglass |
| Eye lubricant | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark | Keep the mouse eyes moisterized | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blood serum dye, green fluorescent color |
| NG2DsRed mice | Jackson Laboratory | 8241 | These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators |
| TRITC-dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blood serum dye, red fluorescent color |
| List of Equipments | |||
| Air pump | WPI | PV830 | Give air pressure to pipette puffing |
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL 700 | Measure levels of blood gases |
| Blood pressure monitor | World Precision Instruments | BP-1 | Monitor aterial blood pressure |
| Body temperature controller | CWE | Model TC-1000 | Keep the mouse body temperature in physiological range |
| Capnograph | Harvard Apparatus | Type 340 | Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse |
| Electrical stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply whisker pad stimulation |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | D-79232 | Mechanically ventilate the mouse in physiological range |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Two-photon microscope | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| List of Surgical Instruments | |||
| Anatomical tweezer | Lawton | 09-0007 | |
| Angled and balanced tweezer | S&T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Iris scissor | Lawton | 05-1450 | |
| Micro vascular clamp | S&T AG | 462 | |
| Mouse vascular catheters | Verutech | 100828 |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J.
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Cai, C., et al. Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Mathiesen, C., et al. Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo. Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex. The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).
- Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation. Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).
- Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. Active Contours without Edges for Vector-Valued Images. Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).
- Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).
- Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons. Neuron. 98 (4), 726 (2018).
- Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
