Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ثقافة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحويصلات العملاقة

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59555
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

Summary

نبرهن على ثقافة الخلايا الواحدة من البكتيريا داخل الحويصلات العملاقة (GVs). تم إعداد GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية بواسطة طريقة نقل قطرات وتم تعطيلها على غشاء معتمد على الركيزة الزجاجية للمراقبة المباشرة للنمو البكتيري. وقد يكون هذا النهج أيضاقابلا للتكيف مع الخلايا الأخرى.

Abstract

قمنا بتطوير طريقة لزراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحويصلات العملاقة (GVs). ثقافة الخلايا البكتيرية مهمة لفهم وظيفة الخلايا البكتيرية في البيئة الطبيعية. بسبب التقدم التكنولوجي، يمكن الكشف عن وظائف الخلايا البكتيرية المختلفة على مستوى خلية واحدة داخل مساحة محصورة. GVs هي مقصورات كروية صغيرة الحجم تتكون من جزيئات الدهون أمفيليليك ويمكن أن تعقد مواد مختلفة، بما في ذلك الخلايا. في هذه الدراسة، تم تغليف خلية بكتيرية واحدة في 10-30 ميكرومتر GVs بواسطة طريقة نقل قطرات وGVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية تم تعطيلها على غشاء معتمد على الركيزة الزجاجية. طريقتنا مفيدة لمراقبة النمو في الوقت الحقيقي من البكتيريا واحدة داخل GVs. نحن المستزرعة الإشريكية القولونية (E.القولونية)الخلايا كنموذج داخل GVs، ولكن هذه الطريقة يمكن تكييفها لأنواع الخلايا الأخرى. يمكن استخدام أسلوبنا في المجالات العلمية والصناعية للميكروبيولوجيا، والبيولوجيا، والتكنولوجيا الحيوية، والبيولوجيا التركيبية.

Introduction

وقد حظيت ثقافة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باهتمام متزايد. زراعة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل مساحة محصورة يمكن أن توضحالوظائف البكتيرية مثل تقلب الفينوتيبيك 1،2،3،4،سلوك الخلية5، 6 , 7 , 8 , 9، ومقاومة المضادات الحيوية10،11. بسبب التطورات الأخيرة في تقنيات الثقافة، يمكن تحقيق ثقافة البكتيريا واحدة داخل مساحةمحصورة، كما هو الحال في رقاقة جيدة 4،7،8،هلام قطرات12،13 ، والمياه في النفط (W /O) قطرات 5،11. ولتعزيز فهم الخلايا البكتيرية الوحيدة أو استخدامها، يلزم إجراء المزيد من التطورات التقنية لتقنيات الزراعة.

الحويصلات التي تحاكي غشاء الخلية البيولوجية هي مقصورات كروية تتكون من جزيئات أمفيليليك ويمكن أن تعقد مواد مختلفة. وتصنف الحويصلات حسب الحجم وتشمل الحويصلات الصغيرة (SVs، القطر <؛ 100 نانومتر)، والحويصلات الكبيرة (LVs، <1 μm)، والحويصلات العملاقة (GVs، >1 ميكرومتر). وتستخدم عادة SVs أو LVs كناقلات المخدرات بسبب تقاربها مع غشاء الخلية البيولوجية14. وقد استخدمت أيضا GVs كنظام مفاعل لبناء protocells15 أو الخلايا الاصطناعية16. تم الإبلاغ عن تغليف الخلايا البيولوجية في GVs17،18،وبالتالي تظهر GVs إمكانات كنظام زراعة الخلايا عند دمجها مع نظام المفاعل.

هنا، جنبا إلى جنب مع شريط فيديو من الإجراءات التجريبية، ونحن نصف كيف يمكن استخدام GVs كسفن ثقافة الخلية رواية19. تم إجراء GVs التي تحتوي على البكتيريا من قبل طريقة نقل قطرات20 ثم تم تعطيلها على غشاء معتمد على زجاج الغلاف. استخدمنا هذا النظام لمراقبة النمو البكتيري على مستوى الخلية الواحدة داخل GVs في الوقت الحقيقي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية بواسطة طريقة نقل قطرات

  1. إعداد حلول مخزون الدهون من 1-بالمتيل-2-أوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوليكولين (POPC, 10 م، 1 مل) و 1،2-ديستيرويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين-ن-[بيوتينتيل(البولي ايثيلينغليكول)-2000] (البيوتين-PEG-DSPE، 0.1 مليون متر، 1 مل) في الكلوروفورم/ محلول الميثانول (2/1، v/v) وتخزين المخزون في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد محلول زيتي يحتوي على الدهون
    1. صب 20 ميكرولتر من محلول POPC و 4 ميكرولتر من محلول البيوتين-PEG-DSPE في أنبوب زجاجي (الشكل1ب (ط)).
    2. تبخر المذيب العضوي عن طريق تدفق الهواء لتشكيل فيلم الدهون ووضع الفيلم في المجفف لمدة 1 ساعة لتبخر تماما المذيب العضوي (الشكل1ب (2)).
      ملاحظة: فمن الضروري لتبخر المذيبات العضوية في غطاء محرك الدخان.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من الزيوت المعدنية (0.84 غرام/مل، جدولالمواد) إلى القارورة الزجاجية (الشكل1ب '3)).
    4. التفاف الجزء الافتتاحي من قارورة زجاجية مع فيلم وsonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية (120 W) لمدة 1 ساعة على الأقل (الشكل1b (3)). التركيزات النهائية من POPC والبيوتين-PEG-DSPE هي 1 MM و 0.002 mM، على التوالي.
  3. ما قبل زراعة الخلايا البكتيرية
    1. تلقيح E. coli في 1X LB المتوسطة (1 غرام استخراج الخميرة، 2 غرام باكتو تريبتون، و 2 غرام كلوريد الصوديوم في 200 مل من الماء منزوع الأيونات) من لوحة LB وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 12-14 ساعة (بين عشية وضحاها).
    2. بعد الحضانة، وجمع 20 درجة مئوية من الحل الثقافي ونقل إلى 1.98 مل من الطازجة 1X LB المتوسطة، وثقافة الخلايا مرة أخرى لمدة 2 ساعة.
    3. تحقق من الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600)قيمة الحل ما قبل الثقافة (أعدت في الخطوة 1.3.2). وينبغي استخدام حل ما قبل الثقافة لـOD 600 = 1.0-1.5.
  4. إعداد الحلول المائية الخارجية والداخلية للمركبات الكهربائية
    1. إذابة الجلوكوز في 1X LB المتوسطة لإعداد محلول مائي الخارجي من GVs. إعداد 20 مل من محلول الجلوكوز الأسهم (500 مل).
    2. تخفيف محلول الجلوكوز الأسهم مع 1X LB المتوسطةإلى 200 mM (الجدول 1).
    3. إذابة السكروز في 1X LB المتوسطة لإعداد محلول مائي داخلي من GVs. إعداد 20 مل من محلول السكروز الأسهم (500 مل).
    4. امزج محلول ما قبل الثقافة (OD600 = 1.0-1.5)، محلول السكروز (500 مليون متر)، و1x LB متوسطة(الجدول1). يجب أن تكون القيمة النهائية للمحلول الثقافي OD600 0.01-0.015 ويجب أن يكون تركيز السكروز النهائي 200 mM.
      ملاحظة: احرص على تجنب الضغط التناضحي. من الضروري تحقيق التوازن بين التركيز بين الحل المائي الداخلي والخارجي.
  5. إعداد قطرات الماء في الزيت (W/O) التي تحتوي على خلايا بكتيرية
    1. إضافة 2 ميكرولتر من محلول مائي داخلي من GVs (أعدت في الخطوة 1.4.4) إلى 50 ميكرولتر من محلول الزيت الذي يحتوي على الدهون (الزيوت المعدنية مع POPC والبيوتين-PEG-DSPE) في أنبوب بلاستيكي مغطى بـ 0.6 مل (الشكل1ب '4').
    2. استحلاب المكونين في الأنبوب البلاستيكي عن طريق النقر على الأنبوب باليد (الشكل1ب (v)).
  6. تشكيل GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية
    1. إضافة 50 ميكرولتر من محلول مائي خارجي من المركبات المضادة للفيروسات القهقرية (أعدت في الخطوة 1.4.2) في أنبوب بلاستيكي مغطى بسعة 1.5 مل (الشكل1ب (6)) وطبقة بلطف 150 ميكرولتر من محلول الزيت الذي يحتوي على الدهون (الزيوت المعدنية مع POPC والبيوتين-PEG-DSPE) على سطح الأوج الخارجي (الشكل1 ب '7'). قم بحضانة هذه العينة في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 درجة مئوية) لمدة 10-15 دقيقة تحقق للتأكد من أن واجهة النفط والحلول المائية مسطحة.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من محلول قطرات W/O (المعد في الخطوة 1.5.2) على واجهة الزيت والمحلول المائي باستخدام ماصة (الشكل1ب '8)).
    3. طرد مركزي للأنبوب البلاستيكي ذو الغطاء بسعة 1.5 مل (من الخطوة 1.6.2) لمدة 10 دقائق عند 1600 × ز في RT في جهاز طرد مركزي مكتبي (الشكل1ب (9)). بعد الطرد المركزي، يستنشق الزيت (الطبقة العليا) من الأنبوب البلاستيكي ذو الغطاء 1.5 مل باستخدام ماصة، وجمع GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية (الشكل1ب (x)).

2. إعداد نظام مراقبة GV (نظام زراعة الخلايا البكتيرية)

  1. إعداد الحويصلات الصغيرة (SVs) للبناء ng a دعم غشاء ثنائي الطبقة
    1. صب 20 ميكرولتر من محلول POPC و 4 ميكرولتر من محلول البيوتين-PEG-DSPE في أنبوب زجاجي (باستخدام نفس تكوين الدهون المستخدمة لإعداد GV في الخطوة 1.1).
    2. تبخر المذيب العضوي عن طريق تدفق الهواء لتشكيل فيلم الدهون ووضع هذه العينة في المجفف لمدة 1 ساعة لتبخر المذيب العضوي تماما.
    3. إضافة 200 درجة مئوية من الجلوكوز 200 M في 1X LB المتوسطة (الحل المائي الخارجي من GVs) إلى القارورة الزجاجية.
    4. التفاف الجزء الافتتاحي من قارورة زجاجية مع فيلم وsonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية (120 W) لمدة 1 ساعة على الأقل.
    5. إعداد SVs بواسطة طريقة البثق21 باستخدام مصغرة الطارد وغشاء البولي مع حجم المسام 100 نانومتر.
  2. إعداد غرفة مصنوعة يدويا
    1. حفر حفرة 7 مم مع لكمة جوفاء على ختم مزدوج الوجه (10 مم × 10 مم × 1 مم).
    2. لصق الختم ذو الوجهين مع ثقب على زجاج الغلاف (30 مم × 40 مم، سمك 0.25-0.35 مم).
  3. إعداد غشاء ثنائي الطبقة المدعومة على زجاج الغطاء في ثقب الغرفة
    1. إضافة 30 درجة مئوية من محلول SV إلى ثقب الغرفة (أعدت في القسم 2.2) وحضانة في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. اغسل الحفرة برفق مرتين مع 20 ميكرولتر من 1x LB المتوسطة التي تحتوي على 200 مل الجلوكوز (الحل المائي الخارجي من GVs) عن طريق الأنابيب.
  4. تجميد العمل بالطائرات المتنقلة على دعم غشاء ثنائي الطبقة على الزجاج غطاء في حفرة من الغرفة
    1. إدخال 10 ميكرولتر من النيوترافيدين مع الحل المائي الخارجي من GVs (1 ملغ / مل) في الحفرة وحضانة في RT لمدة 15 دقيقة.
    2. اغسل الحفرة برفق مرتين مع 20 ميكرولتر من 1x LB المتوسطة التي تحتوي على 200 مل الجلوكوز (الحل المائي الخارجي من GVs) عن طريق الأنابيب.
    3. إضافة جميع الحلول التي تحتوي على GVs (أعدت في الخطوة 1.6.3) في حفرة الغرفة وختم مع غطاء الزجاج (18 مم × 18 ملم، سمك 0.13-0.17 مم) (الشكل2ب).
  5. المراقبة المجهرية لنمو الخلايا البكتيرية داخل GVs
    1. تعيين نظام مرحلة التدفئة المجهرية مع المجهر المقلوب مجهزة 40x/0.6 عدسة موضوعية فتحة رقمية (NA) مع مسافة عمل طويلة (الشكل2ب).
    2. وضع الغرفة على نظام مرحلة التدفئة المجهرية (الشكل2ب). احتضان GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية في الغرفة في حالة ثابتة لمدة 6 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. التقاط وتسجيل صور المجهر لنمو الخلايا البكتيرية داخل GVs كل 30 دقيقة باستخدام أشباه الموصلات أكسيد المعادن التكميلية العلمية (sCMOS) الكاميرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نقدم طريقة بسيطة لتوليد GVs تحتوي على خلايا بكتيريةواحدة باستخدام طريقة نقل قطرات (الشكل 1). ويبين الشكل 1أ صورة تخطيطية لهطول الأمطار من المركبات الكهربائية التي تحتوي على بكتيريا. يتم نقل قطرات W /O التي تحتوي على البكتيريا عبر واجهة المياه الزيتية (أحادية الطبقة الدهنية) عن طريق الطرد المركزي لتشكيل GVs. الفرق في الكثافة بين السكروز (محلول مائي داخلي) والجلوكوز (محلول مائي خارجي) يساعد أيضا على عبور واجهة النفط والماء من قطرات W / O. من الضروري رصد الضغط التناضحي في محلول مائي داخلي وخارجي لأن اختلاف طفيف في التركيز بين هذه الحلول يمكن أن يؤدي إلى تشوه وانهيار المركبات الكهربائية. ويبين الشكل 1برسم بياني لتحضير الإذاج ة التي تحتوي على خلايا بكتيرية بواسطة طريقة نقل القطرة. باتباع هذا الإجراء، يمكن الحصول على GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية واحدة بسهولة.

لمراقبة نمو الخلايا البكتيرية داخل GVs، تم بناء نظامالثقافة الأصلي للمراقبة المجهرية (الشكل 2). تم تعطيل GVs التي تحتوي على البكتيريا على سطح غشاء معتمد المغلفة مع neutravidin على غطاء الزجاج (الشكل2a). وقد مكنت هذه التقنية تجميد المراقبة لفترات طويلة من GVs.

وترد في الشكل 3صور مجهرية نموذجية على النقيض من المرحلة للمركبات ذات الحجم المختلف التي تحتوي على خلايا بكتيرية واحدة. في هذه التجربة، حصلنا أيضا على GVs تحتوي على خلايا بكتيرية مع أحجام تتراوح بين 10 ميكرومتر إلى 30 ميكرومتر. ويبين الشكل 3 النمو البكتيري على مستوى الخلية الواحدة داخل المركبات الكهربائية بأحجام مختلفة تبلغ 10.7 ميكرومتر (الشكل3أ) و28 ميكرومتر (الشكل3ب). لكلا الحجمين من GVs، خضعت خلايا القولونية E. عمليات الاستطالة والانقسام، مع واحد أو اثنين من خلايا القولونية E. تنمو إلى عدد كبير جدا من الخلايا أكثر من 6 ح. وهكذا، نمت خلايا القولونية E. بشكل ملحوظ داخل GVs.

ويبين الشكل 4التردد النسبي للمركبات الحية التي تحتوي على عدد معين من الخلايا البكتيرية. في حالتي التجريبية (OD600 = 0.01-0.015)، تم تغليف الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة في حوالي 10٪ من GVs التي تم الحصول عليها (كانت GVs فارغة ما يقرب من 80٪). وكانت المركبات المضادة للفيروسات القهقرية المغلفة على مستوى الخلية الواحدة حوالي 50 في المائة من الـ GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية، كما هو مقدر من بداية الشكل4.

Figure 1
الشكل 1: الإجراءات التجريبية للمركبات الكهربائية التي تحتوي على بكتيريا. (أ) مخطط من GVs التي تحتوي على البكتيريا التي تم إعدادها بواسطة طريقة نقل قطرات. W / O microdroplets التي تحتوي على البكتيريا تمر من خلال واجهة أحادية الطبقة الدهون بقوة الطرد المركزي ومن ثم تشكيل غشاء ثنائي الطبقة الدهون. (ب) تدفق توليف من GVs التي تحتوي على البكتيريا. '1' المذيبات العضوية المحتوية على الدهون (POPC وbiotin-PEG-DSPE، نسبة الأضراس 100:0.2). '2' فيلم الدهون في الجزء السفلي من القارورة الزجاجية. '3' محلول الزيت المحتوي على الدهون. '4' خليط من 50 ميكرولتر من محلول الزيت و2 ميكرولتر من محلول مائي داخلي (سكروز 200 مل و1 x رطل متوسط) يحتوي على خلايا بكتيرية. '5' الاستحلاب عن طريق التنصت اليدوي (أكثر من 50 مرة). '6' 50 ميكرولتر من المحلول المائي الخارجي (200 مل من الجلوكوز في وسط رطل 1x). '7' طبقات 150 ميكرولتر من محلول الزيت على الحل المائي الخارجي. '8' طبقات من محلول قطرات W/O. '9' الطرد المركزي للأنبوب. '10' المركبات الكهربائية المعجّلة التي تحتوي على خلايا بكتيرية بعد شفط الزيت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نظام bservation من ثقافة الخلايا البكتيرية داخل GVs. (أ) يتم تعطيل GVs على غشاء معتمد من خلال البيوتين-نيوترافيدين ملزمة على زجاج الغلاف. يتم احتضان GVs بواسطة نظام التدفئة. (ب) صورة نظام المراقبة بما في ذلك غرفة يدوية الصنع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور مجهر على النقيض من المرحلة من GVs تحتوي على خلايا بكتيريا واحدة (المشار إليها من قبل السهام السوداء). لقطات إضافية لنمو الخلايا البكتيرية داخل GVs مختلفة الحجم. (أ) حجم الحويصلة = 10.7 ميكرومتر. (ب) حجم الحويصلة = 28 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل إحصائي لعدد الخلايا البكتيرية المغلفة لكل GV. تم رسم الترددات النسبية للمركبات GVs كرسوم بيانية. Inset: تكبير الترددات النسبية للمركبات الكهربائية التي تحتوي على خلايا بكتيرية من خلايا واحدة إلى 10 ولتر. وتم تحليل ما مجموعه 235 من المركبات الكهربائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

محلول مائي خارجي محلول مائي داخلي النهائي
500 مليون مل جلوكوز مع LB متوسط 200 ميكرولتر – 200 متر مربع
500 مليون متر سكروز مع LB متوسطة – 200 ميكرولتر 200 متر مربع
1x رطل متوسط 300 درجة مئوية 295 ميكرولتر –
حل ما قبل الثقافة (OD600 = 1.0-1.5) – 5 ميكرولتر OD600 = 0.01–0.015
مجموع حجم 500 ميكرولتر 500 ميكرولتر

الجدول 1: تكوين وحجم الحلول المائية الخارجية والداخلية للمركبات الكهربائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، ونحن نصف طريقة لزراعة الخلايا البكتيرية على مستوى خلية واحدة داخل GVs. تتضمن هذه الطريقة البسيطة تشكيل GVs التي تحتوي على خلايا بكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام طريقة نقل قطرات. بالمقارنة مع النهج الأخرى للحصول على GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية، ولهذه الطريقة ميزتين: '1' من السهل تطويرها، و(2) مطلوب حجم صغير (2 ميكرولتر) من محلول العينة لإعداد GVs. طريقة نقل قطرات20 لإعداد GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية أبسط من الترطيب الكلاسيكي22 وطرق microfluidics17. على سبيل المثال، طريقة الترطيب الكلاسيكية22 هي طريقة بسيطة وسهلة لإعداد GVs، ولكن كفاءة تغليف المواد في GVs منخفضة جداً وعلى الأقل بضع مئات من ميكرولتر من العينة مطلوبة. السليلوز ورقة حرض على الترطيب23 والترطيب بمساعدة هلام24 طرق لجعل GVs لديها كفاءة تغليف عالية من الجزيئات الحيوية مقارنة مع طريقة الترطيب الكلاسيكية22. كفاءة تغليفها عالية مثل تقنية نقل قطرات، ومن المتوقع أن هاتين الطريقتين قد تسمح تغليف الخلايا داخل GVs. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة microfluidics17 تغلف بدقة خلايا واحدة داخل GVs ويظهر كفاءة تغليف عالية جدا من المواد في GVs ولكن يتطلب التعامل مع معقدة وتقنيات لتلفيق الأجهزة الدقيقة وكبيرة حجم العينة (على الأقل بضعة ملليلتر) لتدفق الأنبوب.

في هذا البروتوكول، فإن استقرار واجهة النفط والمياه مهم للحصول على GVs التي تحتوي على الخلايا البكتيرية (الشكل1ب (7)). للحصول على العديد من GVs، فمن الضروري لتسطيح واجهة النفط والماء. ولذلك، فإن الإعداد السليم لمرحلة النفط ضروري. نحن sonicated مرحلة النفط لمدة 1 ساعة على الأقل في حمام بالموجات فوق الصوتية عالية الطاقة (120 W) لإذابة تماما جزيئات الدهون. من المهم طبقة مرحلة النفط على محلول مائي الخارجي مباشرة بعد sonication (الشكل1ب (7)).

الأسلوب الموضح هنا له اثنين من القيود. أولا، غالبا ما كسر GVs والخلايا البكتيرية تسرب إلى محلول مائي الخارجي. ويرجع ذلك إلى أنه خلال تشكيل GV، لا يمكن لبعض قطرات W/O نقلها من خلال واجهة المياه النفطية وتصبح ممزقة. هذا أمر لا مفر منه عند استخدام طريقة نقل قطرات20. بالإضافة إلى ذلك، قد كسر GVs أثناء المراقبة. يجب تحسين استقرار GVs، مثل استخدام هيكل عظمي اصطناعي يحقق الاستقرار في GVs25. ثانيا، لا يمكن التحكم في عدد الخلايا البكتيرية المغلفة بشكل مثالي. ويبين الشكل 4 أن عددا كبيرا من الخلايا البكتيرية كانت مغلفة في GVs، وبالتالي، فإنه من الصعب السيطرة على عدد الخلايا البكتيرية في GVs باستخدام طريقة نقل قطرات. للتحكم في رقم الخلية، يمكن استخدام تقنية microfluidics.

GVs قد السيطرة على محلولها المائي الداخلي أكثر فعالية من غيرها من المواد (قطرات هلام12،13 أو W / O قطرات5،11). على سبيل المثال، يتم تغيير الظروف المائية للحلول الداخلية والخارجية للمركبات الصلبة عن طريق نفاذية الغشاء الطبيعي26 أو نفاذية تسهلها مسام الغشاء16 أو الناقل27. في الطريقة الحالية ، ظلت جزيئات النفط (الزيوت المعدنية في هذه الحالة) في الغشاء20. تأثير النفط المتبقية في الغشاء على نفاذية المواد الغذائية أو الأكسجين للنمو البكتيري غير معروف. على الرغم من أننا لا نعرف نفاذية الغشاء الطبيعي من المواد الغذائية أو الأكسجين، ونحن نعتبر أن كمية المواد الغذائية أو الأكسجين في وسط النمو كانت كافية للنمو البكتيري في هذه الدراسة. نفاذية الغشاء الطبيعي من المواد الغذائية أو الأكسجين مهم جدا لنمو الخلايا البكتيرية وهو موضوع مهم للدراسة في المستقبل. تقنية التحكم نفاذية لا يمكن أن تجرى باستخدام طريقة الثقافة مع قطرات هلام12،13 أو W / O قطرات5،11. وبالتالي فإن GVs تصبح الخيار الأول لتطبيقات الثقافة البكتيرية في مساحة محصورة.

لدينا طريقة الثقافة البكتيرية هو مفهوم جديد محتمل وأداة في علم الأحياء الدقيقة19 لثقافة البكتيريا البيئية غير معروف للحصول على أو تحليل منتجاتها الأيضية. وعلاوة على ذلك، لدينا البكتيريا التي تحتوي على الخلايا GVs هي نظام هجين من نموذج الخلايا الاصطناعية (GVs) وخلية حية (الخلايا البكتيرية) لجعل أداة جديدة للتكنولوجيا الحيوية28 وأسفل إلى أعلى البيولوجيا الاصطناعية29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال مبادرة رائدة للباحثين الشباب الممتازين (LEADER، رقم 16812285) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا (MEXT) في اليابان، وهي منحة مساعدة للبحوث العلمية الشابة (رقم 18K18157، 16K21034) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) إلى M.M.، والمنحة في المعونة من MEXT إلى K.K. (رقم 17H06417، 17H06413).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 146، ثقافة الخلايا البكتيرية، ثقافة الخلية الواحدة، الحويصلات العملاقة، طريقة نقل قطرات، حاضنة الخلايا الاصطناعية القائمة، علم الأحياء الدقيقة
ثقافة الخلايا البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة داخل الحويصلات العملاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morita, M., Ota, Y., Katoh, K.,… More

Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter