Summary
Vi demonstrerer en enkelt cellekultur af bakterier inde i gigantiske vesikler (GVs). GVS indeholdende bakterieceller blev fremstillet ved dråbe overførselsmetoden og blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat for direkte observation af bakterievækst. Denne fremgangsmåde kan også tilpasses andre celler.
Abstract
Vi udviklede en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i gigantiske vesikler (GVs). Bakteriel cellekultur er vigtigt for at forstå funktionen af bakterieceller i det naturlige miljø. På grund af teknologiske fremskridt kan forskellige bakteriecelle funktioner afsløres på enkelt celleniveau inde i et lukket rum. GVS er sfæriske mikro-størrelse rum består af amfifile lipid molekyler og kan holde forskellige materialer, herunder celler. I dette studie blev en enkelt bakteriecelle indkapslet i 10 – 30 μm GVS ved dråbe overførselsmetoden, og GVS indeholdende bakterieceller blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat. Vores metode er nyttig til at observere real-time vækst af enkelte bakterier inde i GVs. Vi dyrkede Escherichia coli (E. coli) celler som en model inde i GVS, men denne metode kan tilpasses andre celletyper. Vores metode kan anvendes inden for videnskab og industri inden for mikrobiologi, biologi, bioteknologi og syntetisk biologi.
Introduction
Kulturen af bakterieceller på enkelt celleniveau har fået stigende opmærksomhed. Dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i et lukket rum kan belyse bakterielle funktioner som fænotypiske variabilitet1,2,3,4, celle adfærd5, 6 , 7 , 8 , 9og antibiotikaresistens10,11. På grund af de seneste fremskridt inden for kultur teknikker, kan kulturen af enkelte bakterier opnås inde i et lukket rum, såsom i en brønd-chip4,7,8, gel dråbe12,13 og vand-i-olie (W/O) dråbe5,11. For at fremme forståelsen eller udnyttelsen af enkelte bakterieceller er der behov for yderligere tekniske udviklinger af dyrkningsteknikker.
Vesikler, der efterligner den biologiske celle membran er sfæriske rum bestående af amphifilic molekyler og kan holde forskellige materialer. Vesikler klassificeres efter størrelse og omfatter små vesikler (SVs, diameter < 100 nm), store vesikler (LVs, < 1 μm) og gigantiske vesikler (GVs, > 1 μm). SVs eller LVs er almindeligt anvendt som lægemiddelbærere på grund af deres affinitet til den biologiske celle membran14. GVs er også blevet brugt som et reaktor system til opførelse af protoceller15 eller kunstige celler16. Indkapsling af biologiske celler i GVS er blevet rapporteret17,18, og dermed GVS viser potentiale som et cellekultursystem, når det kombineres med reaktor systemet.
Her, sammen med en video af eksperimentelle procedurer, vi beskriver, hvordan GVs kan bruges som nye celle-kultur fartøjer19. GVS indeholdende bakterier blev lavet af dråbe Transfer metode20 og blev derefter immobiliseret på en understøttet membran på et cover glas. Vi brugte dette system til at observere bakterievækst på enkelt celleniveau inde i GVs i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af GVs indeholdende bakterieceller ved droplet overførselsmetoden
- Forbered lipid stamopløsninger af 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 mL) og 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[biotinyl (polyethylenglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) i chloroform/ methanol-opløsning (2/1, v/v), og opbevar bestanden ved-20 °C.
- Fremstilling af en olie opløsning indeholdende lipid
- 20 μL af POPC-opløsningen og 4 μL af biotin-PEG-DSPE-opløsningen hældes i et glasrør (figur 1b (i)).
- Det organiske opløsningsmiddel fordampe med luftstrømmen for at danne en lipid-film og anbringe filmen i en ekssikkator i 1 time for at fordampe det organiske opløsningsmiddel fuldstændigt (figur 1b (II)).
Bemærk: Det er nødvendigt at fordampe det organiske opløsningsmiddel i en stinkhætte. - Tilsæt 200 μL mineralolie (0,84 g/mL, tabel over materialer) til hætteglasset med glas (figur 1b (III)).
- Pak den åbne del af hætteglasset med film og Sonik den i et ultralydbad (120 W) i mindst 1 time (figur 1b (III)). De endelige koncentrationer af POPC og biotin-PEG-DSPE er henholdsvis 1 mM og 0,002 mM.
- Præ-kultur af bakterieceller
- Inoculate E. coli i 1x lb medium (1 g gærekstrakt, 2 g Bacto tryptone og 2 g natriumchlorid i 200 ml afioniseret vand) fra en lb-plade og inkuber ved 37 °c i 12 – 14 timer (natten over).
- Efter inkubation opsamles 20 μL af kultur opløsningen og overføres til 1,98 mL frisk 1x LB-medium og kulturen cellerne igen i 2 timer.
- Kontroller den optiske tæthed ved 600 nm (OD600)-værdien af præ-kultur opløsningen (fremstillet i trin 1.3.2). En præ-kultur opløsning af OD600 = 1,0-1.5 bør anvendes.
- Klargøring af de ydre og indre vandige opløsninger af GVs
- Glucose opløses i 1x LB-medium for at tilberede en ydre vandig opløsning af GVs. Forbered 20 mL af en bestand glukose opløsning (500 mM).
- Glucoseopløsningen fortyndes med 1x LB medium til 200 mM (tabel 1).
- Saccharose opløses i 1x LB medium til tilberedning af en indvendig vandig opløsning af GVs. Forbered 20 mL af en bestand af saccharose (500 mM).
- Før-kultur opløsningen blandes (OD600 = 1,0 – 1,5), saccharoseopløsning (500 mm) og 1x lb-medium (tabel 1). Den endelige OD600 -værdi af dyrknings opløsningen skal være 0,01 – 0.015, og den endelige saccharosekoncentration bør være 200 mm.
Bemærk: Vær forsigtig for at undgå osmotisk tryk. Det er nødvendigt at afbalancere koncentrationen mellem den indre og ydre vandig opløsning.
- Fremstilling af vand-i-olie (W/O) dråber indeholdende bakterieceller
- Der tilsættes 2 μL af den indre vandige opløsning af GVs (fremstillet i trin 1.4.4) til 50 μL af olie opløsningen indeholdende lipider (mineralsk olie med POPC og biotin-PEG-DSPE) i et 0,6 mL limede plastrør (figur 1b (IV)).
- Emulsificere de to komponenter i plastik røret ved at tappe røret i hånden (figur 1b (v)).
- Dannelse af GVs indeholdende bakterieceller
- Der tilsættes 50 μL af den yderste vandige opløsning af GVs (fremstillet i trin 1.4.2) i et 1,5 mL limede plastrør (figur 1b (vi)) og forsigtigt lag 150 μl af olie opløsningen indeholdende lipider (mineralsk olie med popc og biotin-peg-dspe) på overfladen af den ydre vandige opløsning (figur 1b (VII)). Denne prøve inkubates ved stuetemperatur (RT, 25 °C) i 10-15 min. Kontroller, at grænsefladen af olie-og vandige opløsninger er flad.
- Der tilsættes 50 μL af W/O-dråbe opløsningen (fremstillet i trin 1.5.2) på den olie-og vandige opløsningens grænseflade ved hjælp af en pipette (figur 1b (VIII)).
- Centrifuge 1,5 mL limede plastictube (fra trin 1.6.2) i 10 min ved 1.600 x g ved rt i en stationær centrifuge (figur 1b (IX)). Efter centrifugering, Aspirér olien (øverste lag) fra 1,5-mL limede plastic slange ved hjælp af en pipette, og saml GVs indeholdende bakterieceller (figur 1b (x)).
2. klargøring af en GV observationssystem (bakteriecelle kultur system)
-
Frem stilling af små vesikler (SVs) til konstrukti ng a understøttet tolags membran
- 20 μL af POPC-opløsningen og 4 μL af biotin-PEG-DSPE-opløsningen hældes i et glasrør (med samme lipidsammensætning som anvendt til fremstilling af GV i trin 1,1).
- Det organiske opløsningsmiddel fordampe med luftstrøm til dannelse af en lipid-film, og denne prøve placeres i en ekssikkator i 1 time for at fordampe det organiske opløsningsmiddel fuldstændigt.
- Tilsæt 200 μL 200 mM glucose i 1x LB medium (den yderste vandholdige opløsning af GVs) til hætteglasset.
- Wrap åbningen del af hætteglasset med film og sonikatet det i et ultralydbad (120 W) i mindst 1 h.
- Forbered SVs ved ekstruderingsmetode21 ved hjælp af en mini-ekstrudering og polycarbonatmembran med 100 nm porestørrelse.
-
Forberedelse af et håndlavet kammer
- Bore et 7 mm hul med en hul punch på en dobbelt-faced forsegling (10 mm x 10 mm x 1 mm).
- Indsæt den dobbelte forsegling med hullet på et dækglas (30 mm x 40 mm, tykkelse 0,25 – 0,35 mm).
-
Klargøring af en understøttet tolags membran på dækglasset i hullet i kammeret
- 30 μL af SV-opløsningen tilsættes til hullet i kammeret (fremstillet i punkt 2,2) og Inkuber ved RT i 30 minutter.
- Vask forsigtigt hullet to gange med 20 μL 1x LB-medium, der indeholder 200 mM glucose (den yderste vandige opløsning af GVs) ved pipettering.
-
Immobilisering af GVs på understøttet tolags membran på dækglasset i hullet af kammeret
- 10 μL af neutravidin med den yderste vandige opløsning af GVs (1 mg/mL) indføres i hullet og Inkuber ved RT i 15 min.
- Vask forsigtigt hullet to gange med 20 μL 1x LB-medium, der indeholder 200 mM glucose (den yderste vandige opløsning af GVs) ved pipettering.
- Tilsæt alle løsninger, der indeholder GVs (tilberedt i trin 1.6.3), ind i hullet i kammeret og forsegl med et dækglas (18 mm x 18 mm, tykkelse 0,13 – 0,17 mm) (figur 2b).
-
Mikroskopisk observation af bakteriecelle vækst inde i GVs
- Sæt et mikroskopisk opvarmnings stadie system med et inverteret mikroskop udstyret med en 40x/0,6 numerisk blænde (NA) objektiv linse med en lang arbejdsafstand (figur 2b).
- Placer kammeret på det mikroskopiske opvarmnings stadie system (figur 2b). De GVs, der indeholder bakterieceller i kammeret, inkubates i en statisk tilstand i 6 timer ved 37 °C.
- Optag og Optag mikroskop billeder af bakteriecelle vækst inde i GVs hver 30 min ved hjælp af en videnskabelig supplerende metaloxid halvleder (sCMOS) kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en simpel metode til generering af GVS indeholdende enkelte bakterieceller ved hjælp af dråbe overførselsmetoden (figur 1). Figur 1a viser et skematisk billede af udfældningen af GVS indeholdende bakterier. W/O dråber indeholdende bakterier overføres på tværs af olie-vand (lipid monolayer) grænseflade ved centrifugering til at danne GVs. Forskellen i tæthed mellem saccharose (indre vandig opløsning) og glucose (ydre vandig opløsning) også hjælper passage af olie-vand grænsefladen af W/O dråber. Det er nødvendigt at overvåge det osmotiske tryk i indre og ydre vandig opløsning, fordi en lille forskel i koncentrationen mellem disse opløsninger kan fremkalde deformation og kollaps af GVs. Et flowdiagram til klargøring af GVs, der indeholder bakterieceller ved dråbe overførings metoden, er vist i figur 1b. Ved at følge denne procedure, GVs indeholder enkelt bakterieceller kan nemt opnås.
For at observere bakteriecelle vækst inden for GVs blev et originalt kultur system konstrueret til mikroskopisk observation (figur 2). GVs indeholdende bakterier blev immobiliseret på en understøttet membran overfladebelagt med neutravidin på et cover glas (figur 2a). Denne immobiliserings teknik har muliggjort langvarig observation af GVs.
Typisk fasekontrast-mikroskopi billeder af de forskellige størrelser GVs, der indeholder enkelt bakterieceller, er vist i figur 3. I dette eksperiment opnåede vi også GVs indeholdende bakterieceller med størrelser fra 10 μm til 30 μm. Figur 3 viser bakterievækst på enkelt celleniveau i GVS med forskellige størrelser på 10,7 μm (figur 3a) og 28 μm (figur 3b). For begge størrelser af GVs, e. coli celler gennemgik forlængelse og division processer, med en eller to E. coli celler vokser til et meget stort antal celler over 6 h. Således, E. coli celler voksede stabilt inde i GVS.
Den relative hyppighed af GVs, der indeholder et givet antal bakterieceller, er vist i figur 4. I vores eksperimentelle tilstand (OD600 = 0,01 – 0.015) blev Bakteriecellerne indkapslet i et enkelt celleniveau i ca. 10% af de opnåede GVS (tomme GVS var ca. 80%). GVS indkapslet på enkelt celleniveau var ca. 50% af GVS indeholdende bakterieceller, som anslået fra justerings af figur 4.
Figur 1: eksperimentelle procedurer for GVs indeholdende bakterier. a) system af GVS, der indeholder bakterier, som er fremstillet ved en dråbe overførings metode. W/O Mikrodråber, der indeholder bakterier passere gennem en lipid enkeltlags grænseflade ved centrifugalkraft og derefter danne en lipid tolags membran. (b) strømmen af syntesen af GVS indeholdende bakterier. i) organiske opløsningsmidler indeholdende lipider (POPC og biotin-PEG-DSPE, 100:0,2 molær ratio). II) lipid-folie i bunden af hætteglasset med glas. III) olie opløsning indeholdende lipider. IV) blanding af 50 μL olie opløsning og 2 μL indvendig vandig opløsning (200 mM saccharose og 1x LB medium) indeholdende bakterieceller. (v) emulgering ved håndtryk (over 50 gange). Vi) 50 μL af den yderste vandige opløsning (200 mM glucose i 1x LB medium). VII) lagdeling på 150 μL olie opløsning på den yderste vandige opløsning. VIII) lagdeling af W/O-dråbe opløsningen. IX) centrifugering af røret. (x) udfældede GVs indeholdende bakterieceller efter aspiration af olien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: o bservation system af bakteriel cellekultur inde GVs. (a) GVS er immobiliseret på en understøttet membran gennem biotin – neutravidin binding på dækglasset. GVs inkuberet af et varmesystem. b) billede af observationssystemet, herunder et håndlavet kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fase-kontrast mikroskop billeder af GVs indeholdende enkelt bakterieceller (indikeret af de sorte pile). Snap-shots af bakteriecelle vækst inde i forskellige størrelser GVs. (a) vesikle størrelse = 10,7 μm. b) vesikel størrelse = 28 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: statistisk analyse af antallet af indkapslede bakterieceller pr. GV. De relative frekvenser af GVs blev plottet som histogrammer. Inset: forstørrelse af de relative frekvenser af GVs indeholdende bakterieceller fra enkelt til 10 < celler. I alt 235 GVs blev analyseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Ydre vandig opløsning | Indvendig vandig opløsning | Endelige | |
| 500 mM glucose med LB medium | 200 μL | – | 200 mM |
| 500 mM saccharose med LB-medium | – | 200 μL | 200 mM |
| 1x LB medium | 300 μL | 295 μL | – |
| Præ-kultur løsning (OD600 = 1,0 – 1.5) | – | 5 μL | OD600 = 0,01 – 0.015 |
| Samlet mængde | 500 μL | 500 μL |
Tabel 1: sammensætning og volumen af de ydre og indre vandige opløsninger af GVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau i GVs. Denne enkle metode indebærer at danne GVS indeholdende bakterieceller på enkelt celleniveau ved hjælp af dråbe overførselsmetoden. Sammenlignet med andre tilgange til opnåelse af GVs indeholdende bakterieceller, denne metode har to fordele: (i) det er let at udvikle, og (II) en lille mængde (2 μL) af prøven opløsning er nødvendig for at forberede GVs. Dråbe overførings metoden20 til klargøring af GVS, der indeholder bakterieceller, er enklere end den klassiske hydrering22 og mikrofluidics metoder17. For eksempel er den klassiske hydrering metode22 en enkel og nem metode til klargøring af GVS, men indkapsling effektiviteten af materialer i GVS er ret lav, og der kræves mindst et par hundrede mikroliter prøve. Den nyligt udviklede cellulose papir-abetted hydrering23 og gel-assisteret hydrering24 metoder til fremstilling af GVS har en høj indkapsling effektivitet af biomolekyler sammenlignet med den klassiske hydrering metode22. Deres indkapsling effektivitet er så høj som for dråbe overførsel teknik, og det forventes, at disse to metoder kan tillade indkapsling af celler i GVs. Desuden indkapsler mikrofluidics metode17 nøjagtigt enkeltceller inde i GVS og viser en meget høj indkapsling effektivitet af materialer i GVS, men kræver kompliceret håndtering og teknikker til fabrikering af mikroenheder og en stor prøvevolumen (mindst et par milliliter) til at flyde røret.
I denne protokol er stabiliteten af olie-vand-grænsefladen vigtig for opnåelse af GVs, der indeholder bakterieceller (figur 1b (VII)). For at opnå mange GVs, er det vigtigt at flade olie-vand grænsefladen. Derfor er korrekt tilberedning af oliefasen nødvendig. Vi soniseret oliefasen i mindst 1 time i et højeffekt ultralydbad (120 W) for helt at opløse lipid-molekylerne. Det er vigtigt at lag oliefasen på den ydre vandige opløsning umiddelbart efter sonikering (figur 1b (VII)).
Den beskrevne metode har to begrænsninger. Først, GVs ofte bryde og bakterieceller lække i den ydre vandige opløsning. Dette skyldes, at nogle W/O-dråber under GV dannelse ikke kan overføres gennem olie-vand-grænsefladen og bliver sprænkket. Dette er uundgåeligt, når du bruger dråbe Transfer metode20. Derudover kan GVs bryde under observation. Stabiliteten af GVs skal forbedres, såsom ved hjælp af en kunstig cytoskelet, der stabiliserer GVs25. For det andet kan antallet af indkapslede bakterieceller ikke styres perfekt. Figur 4 viser, at et stort antal bakterieceller var indkapslet i GVS, og derfor er det vanskeligt at kontrollere antallet af bakterieceller i GVS ved hjælp af dråbe overførselsmetoden. For at styre celle nummeret kan microfluidics-teknologien anvendes.
GVS kan styre deres indre vandig opløsning mere effektivt end andre materialer (gel dråber12,13 eller W/O dråber5,11). For eksempel, de vandige forhold i de indre og ydre opløsninger af GVs er ændret ved naturlig membran permeabilitet26 eller permeabilitet lettes ved en membran pore16 eller transportør27. I den nuværende metode forblev olie molekyler (mineralolie i dette tilfælde) i membranen20. Indflydelsen af olien tilbage i membranen på permeabilitet af næringsstoffer eller ilt til bakterievækst er ukendt. Selv om vi ikke kender den naturlige membran permeabilitet af næringsstoffer eller ilt, vi mener, at mængden af næringsstoffer eller ilt i vækstmediet var tilstrækkelig til bakterievækst i den nuværende undersøgelse. Den naturlige membran permeabilitet af næringsstoffer eller ilt er meget vigtigt for bakteriecelle vækst og er et vigtigt emne for fremtidig undersøgelse. Teknikken til kontrol af permeabilitet kan ikke udføres ved hjælp af dyrkningsmetoden med gel dråber12,13 eller W/O dråber5,11. GVs vil således blive det første valg for bakteriel kultur applikationer i et lukket rum.
Vores bakteriel kultur metode er et potentielt nyt koncept og værktøj i mikrobiologi19 til kultur ukendte miljømæssige bakterier for at opnå eller analysere deres metaboliske produkter. Desuden er vores bakteriecelle-holdige GVs et hybrid system af en kunstig celle model (GVs) og en levende celle (bakterieceller) for at lave et nyt værktøj til bioteknologi28 og bottom-up syntetisk biologi29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et førende initiativ for fremragende unge forskere (LEADER, nr. 16812285) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) i Japan, et tilskud-i-støtte til unge videnskabsmænd forskning (no. 18K18157, 16K21034) fra Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) til M.M., og tilskuds-in-Aid fra MEXT til K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al.
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al.
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L.
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
