Summary
Nós demonstramos a cultura da único-pilha das bactérias dentro das vesículas gigantes (GVs). GVs contendo células bacterianas foram preparados pelo método de transferência de gotas e foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro para observação direta do crescimento bacteriano. Essa abordagem também pode ser adaptável a outras células.
Abstract
Nós desenvolvemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro dos vesículas gigantes (GVS). A cultura bacteriana da pilha é importante para compreender a função de pilhas bacterianas no ambiente natural. Por causa dos avanços tecnológicos, as várias funções bacterianas da pilha podem ser reveladas no nível da único-pilha dentro de um espaço confinado. Os GVs são compartimentos de microdimensões esféricos compostos por moléculas de lipídios anfífilos e podem conter vários materiais, incluindo células. Neste estudo, uma única pilha bacteriana foi encapsulada em GVs de 10 – 30 μm pelo método de transferência da gota e os GVs que contêm pilhas bacterianas foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro. Nosso método é útil para observar o crescimento em tempo real de bactérias únicas dentro de GVs. Nós cultivou pilhas de Escherichia coli (E. coli) como um modelo dentro de GVS, mas este método pode ser adaptado a outros tipos da pilha. Nosso método pode ser usado na ciência e nos campos industriais da microbiologia, da biologia, da biotecnologia, e da biologia sintética.
Introduction
A cultura de células bacterianas no nível de célula única tem recebido atenção crescente. A cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de um espaço confinado pode elucidar funções bacterianas como a variabilidade fenotípica1,2,3,4, comportamento celular5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9, e resistência aos antibióticos10,11. Por causa dos avanços recentes nas técnicas da cultura, a cultura de únicas bactérias pode ser conseguida dentro de um espaço confinado, como em um poço-microplaqueta4, 7,8, gota de gel12,13 , e água-em-óleo (W/s) gota5,11. Para promover a compreensão ou a utilização de únicas pilhas bacterianas, uns desenvolvimentos técnicos mais adicionais de técnicas do cultivation são necessários.
As vesículas que imitam a membrana celular biológica são compartimentos esféricos consistindo de moléculas anfífilas e podem conter vários materiais. As vesículas são classificadas de acordo com o tamanho e incluem pequenas vesículas (SVs, diâmetro < 100 nm), grandes vesículas (LVs, < 1 μm) e vesículas gigantes (GVs, > 1 μm). SVs ou LVs são comumente usados como portadores de drogas por causa de sua afinidade com a membrana celular biológica14. Os GVS também têm sido utilizados como um sistema de reator para a construção de protocélulas15 ou células artificiais16. O encapsulamento de células biológicas em GVS foi relatado17,18, e assim o GVS mostra potencial como um sistema de cultura celular quando combinado com o sistema de reator.
Aqui, juntamente com um vídeo de procedimentos experimentais, descrevemos como os GVs podem ser usados como novos vasos de cultura de células19. GVs contendo bactérias foram feitas pelo método de transferência de gotas20 e, em seguida, foram imobilizados em uma membrana suportada em um vidro de cobertura. Utilizamos este sistema para observar o crescimento bacteriano no nível de célula única dentro de GVs em tempo real.
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Protocol
1. preparação de GVs contendo células bacterianas pelo método de transferência de gotas
- Prepare soluções em estoque lipídico de 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[biotinilo (polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) em clorofórmio/ solução de metanol (2/1, v/v) e armazene o estoque a-20 ° c.
- Preparação de uma solução de óleo contendo lipídios
- Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (Figura 1b (i)).
- Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para formar um filme lipídico e colocar o filme em um dessecador por 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico (Figura 1b (II)).
Nota: É necessário evate o solvente orgânico em uma capa das emanações. - Adicionar 200 μL de óleo mineral (0,84 g/mL, tabela de materiais) ao frasco para injetáveis de vidro (Figura 1b (III)).
- Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e a proceda num banho Ultrassônico (120 W) durante pelo menos 1 h (Figura 1b (III)). As concentrações finais de POPC e biotina-PEG-DSPE são de 1 mM e 0, 2 mM, respectivamente.
- Pré-cultura de células bacterianas
- Inocular e. coli em 1x lb médio (1 g de extrato de levedura, 2 g de triptona Bacto, e 2 g de cloreto de sódio em 200 ml de água deionizada) a partir de uma placa lb e incubar a 37 ° c por 12 – 14 h (durante a noite).
- Após a incubação, colete 20 μL da solução de cultura e transfira para 1,98 mL de meio fresco de 1x LB e cultive as células novamente por 2 h.
- Verifique a densidade óptica em 600 nm (OD600) valor da solução pré-cultura (preparada na etapa 1.3.2). Deve ser utilizada uma solução pré-cultura de OD600 = 1,0 – 1,5.
- Preparação das soluções aquosas exteriores e interiores de GVs
- Dissolver a glicose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa exterior de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de glicose de estoque (500 mM).
- Diluir a solução de glicose de estoque com 1x LB médio a 200 mM (tabela 1).
- Dissolver a sacarose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa interna de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de sacarose (500 mM).
- Misture a solução pré-cultura (OD600 = 1,0 – 1,5), a solução de sacarose (500 mm) e o meio 1x lb (tabela 1). O valor final do OD600 da solução da cultura deve ser 0.01 – 0,015 e a concentração final da sacarose deve ser 200 milímetros.
Nota: Tome cuidado para evitar a pressão osmótica. É necessário equilibrar a concentração entre a solução aquosa interna e externa.
- Preparação de gotas de água-em-óleo (W/O) contendo células bacterianas
- Adicionar 2 μL da solução aquosa interna de GVs (preparada na etapa 1.4.4) a 50 μL da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com POPC e biotina-PEG-DSPE) em um tubo de plástico lidded 0,6 mL (Figura 1b (IV)).
- Emulsionar os dois componentes no tubo de plástico tocando o tubo com a mão (Figura 1b (v)).
- Formação de GVs contendo células bacterianas
- Adicionar 50 μL da solução aquosa exterior de GVs (preparada no passo 1.4.2) num tubo de plástico com tampa de 1,5 mL (Figura 1b (vi)) e suavemente camada 150 μl da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com popc e biotina-Peg-dspe) na superfície do aquoso exterior solução (Figura 1b (VII)). Incubar esta amostra à temperatura ambiente (RT, 25 ° c) durante 10 – 15 min. Verifique se a interface do óleo e das soluções aquosas está plana.
- Adicionar 50 μL da solução de gota W/O (preparada no passo 1.5.2) na interface do óleo e solução aquosa utilizando uma pipeta (Figura 1b (VIII)).
- Centrifugue o tubo plástico lidded de 1,5 mL (da etapa 1.6.2) por 10 minutos em 1.600 x g em RT em um centrifugador do desktop (Figura 1b (IX)). Após a centrifugação, aspirar o óleo (camada superior) do tubo plástico lidded 1,5-mL usando uma pipeta, e coletar os GVs que contêm pilhas bacterianas (Figura 1b (x)).
2. preparação de um sistema de observação GV (sistema de cultura de células bacterianas)
-
Preparação de pequenas vesículas (SVs) para constructi ng a membrana de BICAMADA suportada
- Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (usando a mesma composição lipídica usada para a preparação de GV na etapa 1,1).
- Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para dar forma a um filme do lipido e coloc esta amostra em um exsicador para 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico.
- Adicionar 200 μL de glicose de 200 mM em meio de 1x LB (a solução aquosa externa de GVs) ao frasco de vidro.
- Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e proceda-lo em um banho ultra-sônico (120 W) para pelo menos 1 h.
- Prepare SVs pelo método de extrusão21 usando uma mini-extrusora e membrana de policarbonato com 100 nm tamanho dos poros.
-
Preparação de uma câmara artesanal
- Perfure um furo de 7 mm com um perfurador oco em um selo de dupla face (10 mm x 10 mm x 1 mm).
- Cole o selo de dupla face com o furo em um vidro de cobertura (30 mm x 40 mm, espessura 0,25 – 0,35 mm).
-
Preparação de uma membrana de BICAMADA suportada no vidro de cobertura no orifício da câmara
- Adicionar 30 μL da solução SV ao orifício da câmara (preparado na secção 2,2) e incubar na RT durante 30 min.
- Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
-
Imobilização de GVs no membrana de BICAMADA suportada no vidro da tampa no furo da câmara
- Introduzir 10 μL de neutravidina com a solução aquosa exterior de GVs (1 mg/mL) no orifício e incubar na RT durante 15 min.
- Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
- Adicionar todas as soluções contendo GVs (preparadas na etapa 1.6.3) no orifício da câmara e selar com um vidro de cobertura (18 mm x 18 mm, espessura 0,13 – 0,17 mm) (Figura 2b).
-
Observação microscópica do crescimento de células bacterianas dentro de GVs
- Defina um sistema de estágio de aquecimento microscópico com um microscópio invertido equipado com uma lente objetiva de abertura numérica de 40x/0,6 (NA) com uma longa distância de trabalho (Figura 2b).
- Coloque a câmara no sistema de estágio de aquecimento microscópico (Figura 2b). Incubar os GVs contendo células bacterianas na câmara a uma condição estática de 6 h a 37 ° c.
- Capture e registre imagens do microscópio do crescimento bacteriano da pilha dentro de GVs cada 30 minutos usando uma câmera complementar científica do semicondutor do óxido metálico (sCMOS).
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Representative Results
Apresentamos um método simples para a geração de GVs contendo células bacterianas únicas utilizando o método de transferência de gotas (Figura 1). A Figura 1a mostra uma imagem esquemática da precipitação de GVS contendo bactérias. As gotas de W/O que contêm as bactérias são transferidas através da relação da óleo-água (monolayer do lipido) pela centrifugação para dar forma a GVs. A diferença de densidade entre a sacarose (solução aquosa interna) e a glicose (solução aquosa externa) também auxilia o cruzamento da interface óleo-água das gotas de W/O. É necessário monitorar a pressão osmótica na solução aquosa interna e externa, pois uma ligeira diferença na concentração entre essas soluções pode induzir deformação e colapso de GVs. Um fluxograma para a preparação de GVs contendo células bacterianas pelo método de transferência de gotas é mostrado na Figura 1b. Seguindo este procedimento, os GVs que contêm únicas pilhas bacterianas podem facilmente ser obtidos.
Para observar o crescimento celular bacteriano em GVs, foi construído um sistema de cultura original para observação microscópica (Figura 2). GVs contendo bactérias foram imobilizadas em uma superfície de membrana suportada revestida com neutravidina em um vidro de cobertura (Figura 2a). Esta técnica de imobilização permitiu a observação prolongada de GVs.
Imagens típicas de microscopia de contraste de fase dos diferentes GVs de tamanho contendo células bacterianas únicas são mostradas na Figura 3. Neste experimento, também foram obtidos GVs contendo células bacterianas com tamanhos variando de 10 μm a 30 μm. A Figura 3 mostra o crescimento bacteriano no nível de célula única dentro de GVS com diferentes tamanhos de 10,7 μm (Figura 3a) e 28 μm (Figura 3b). Para ambos os tamanhos de GVs, as células de e. coli foram submetidas a processos de alongamento e divisão, com uma ou duas células de e. coli crescendo a um número muito grande de células acima de 6 h. Assim, as pilhas de E. coli cresceram estàvel dentro dos GVS.
A frequência relativa de GVs contendo um determinado número de células bacterianas é mostrada na Figura 4. Em nossa condição experimental (OD600 = 0,01 – 0,015), as células bacterianas foram encapsuladas no nível de célula única em aproximadamente 10% dos GVS obtidos (GVS vazios foram aproximadamente 80%). Os GVs encapsulados no nível de célula única foram aproximadamente 50% dos GVs contendo células bacterianas, como estimado a partir do conjunto da Figura 4.
Figura 1: procedimentos experimentais de GVs contendo bactérias. (a) esquema de GVS contendo bactérias preparadas por um método de transferência de gotas. As microgotas de W/O que contêm as bactérias passam através de uma relação do monocamada do lipido pela força centrífuga e formam então uma membrana do BICAMADA do lipido. (b) fluxo da síntese de GVS contendo bactérias. (i) solvente orgânico contendo lipídios (POPC e biotina-PEG-DSPE, 100:0,2 molar ratio). (II) película lipídica na parte inferior do frasco para injetáveis de vidro. (III) solução de óleo contendo lipídios. (IV) mistura de 50 μL de solução de óleo e 2 μL de solução aquosa interna (200 mM de sacarose e 1x LB médio) contendo células bacterianas. (v) emulsificação à mão tocando (mais de 50 vezes). (vi) 50 μL da solução aquosa exterior (glicose de 200 mM em meio de 1x LB). (VII) estratificação de 150 μL de solução de óleo na solução aquosa exterior. (VIII) estratificação da solução de gotículo de W/O. (IX) centrifugação do tubo. (x) GVs precipitados contendo células bacterianas após aspiração do óleo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o o sistema de bservation da cultura bacteriana da pilha dentro de GVs. (a) os GVS são imobilizados em uma membrana suportada através da biotina – ligação de neutravidina no vidro da tampa. Os GVs são incubados por um sistema de aquecimento. (b) retrato do sistema de observação que inclui uma câmara handmade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens de microscópio de contraste de fase de GVs contendo células de bactérias únicas (indicadas pelas setas pretas). Snap-shots de crescimento de células bacterianas dentro de diferentes tamanhos GVs. (a) tamanho vesicle = 10,7 μm. b) tamanho das vesículas = 28 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: análise estatística do número de células bacterianas encapsuladas por GV. As frequências relativas de GVs foram plotadas como histogramas. Inset: ampliação das frequências relativas de GVs contendo células bacterianas de células simples a 10 <. Um total de 235 GVs foram analisados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução aquosa exterior | Solução aquosa interna | Final | |
| 500 mM de glicose com LB médio | 200 μL | – | 200 milímetros |
| 500 mM sacarose com meio LB | – | 200 μL | 200 milímetros |
| 1x LB médio | 300 μL | 295 μL | – |
| Solução de pré-cultura (OD600 = 1,0 – 1,5) | – | 5 μL de | OD600 = 0,01 – 0,015 |
| Volume total | 500 μL | 500 μL |
Tabela 1: a composição e os volumes das soluções aquosas externas e internas dos GVs.
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Discussion
Aqui, nós descrevemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro de GVs. Este método simples envolve a formação de GVs contendo células bacterianas no nível de célula única usando o método de transferência de gotas. Comparado com outras abordagens para a obtenção de GVs contendo células bacterianas, este método tem duas vantagens: (i) é fácil de desenvolver, e (II) um pequeno volume (2 μL) da solução de amostra é necessário para preparar os GVs. O método de transferência de gotas20 para a preparação de GVS contendo células bacterianas é mais simples do que a hidratação clássica22 e os métodos microfluínicos17. Por exemplo, o método de hidratação clássica22 é um método simples e fácil para a preparação de GVS, mas a eficiência de encapsulamento de materiais em GVS é bastante baixa e pelo menos algumas centenas de microlitros de amostra é necessária. A hidratação em papel de celulose recentemente desenvolvida23 e hidratação assistida por gel24 métodos para fazer GVS têm uma alta eficiência de encapsulamento de biomoléculas em comparação com o método de hidratação clássica22. Sua eficiência da encapsulação é tão elevada quanto aquela da técnica da transferência da gota, e espera-se que estes dois métodos podem permitir o encapsulamento das pilhas dentro de GVs. Além disso, o método microfluídica17 encapsula precisamente pilhas únicas dentro de GVS e mostra uma eficiência muito elevada da encapsulação dos materiais em GVS mas exige a manipulação complicada e as técnicas para fabricar microdevices e um grande volume de amostra (pelo menos alguns mililitros) para fluir o tubo.
Neste protocolo, a estabilidade da interface óleo-água é importante para a obtenção de GVs contendo células bacterianas (Figura 1b (VII)). Para obter muitos GVs, é essencial aplainar a interface óleo-água. Conseqüentemente, a preparação apropriada da fase do óleo é necessária. Nós sonicated a fase de óleo para pelo menos 1 h em um banho ultra-sônico de alta potência (120 W) para dissolver completamente as moléculas lipídicas. É importante a camada de óleo na solução aquosa externa imediatamente após a sonicação (Figura 1b (VII)).
O método descrito aqui tem duas limitações. Primeiramente, os GVs quebram frequentemente e as pilhas bacterianas escapam na solução aquosa exterior. Isto é porque durante a formação de GV, algumas gotas de W/O não podem transferir através da relação da óleo-água e tornar-se rompido. Isto é inevitável quando se utiliza o método de transferência de gotas20. Adicionalmente, os GVs podem quebrar durante a observação. A estabilidade dos GVs deve ser melhorada, como por exemplo, usando um citoesqueleto artificial que estabiliza o GVs25. Em segundo lugar, o número de células bacterianas encapsuladas não pode ser perfeitamente controlado. A Figura 4 mostra que um grande número de células bacterianas foi encapsulado nos GVS e, portanto, é difícil controlar o número de células bacterianas em GVS usando o método de transferência de gotas. Para controlar o número da célula, a tecnologia de microfluínicos pode ser usada.
GVS pode controlar sua solução aquosa interna mais eficazmente do que outros materiais (gotas de gel12,13 ou W/O gotas5,11). Por exemplo, as condições aquosas das soluções internas e externas dos GVs são alteradas pela permeabilidade natural da membrana26 ou permeabilidade facilitada por um poro de membrana16 ou transportador27. No presente método, as moléculas de óleo (óleo mineral neste caso) permaneceram na membrana20. A influência do óleo remanescente na membrana sobre a permeabilidade de nutrientes ou oxigênio para o crescimento bacteriano é desconhecida. Embora não conhecamos a permeabilidade da membrana natural de nutrientes ou oxigênio, consideramos que a quantidade de nutrientes ou oxigênio no meio de crescimento foi suficiente para o crescimento bacteriano no presente estudo. A permeabilidade natural da membrana dos nutrientes ou do oxigênio é muito importante para o crescimento bacteriano da pilha e é um tópico importante para o estudo futuro. A técnica para controlar a permeabilidade não pode ser conduzida utilizando o método de cultura com gotas de gel12,13 ou W/O gotas5,11. Os GVs tornar-se-ão assim a primeira escolha para aplicações da cultura bacteriana em um espaço confinado.
Nosso método da cultura bacteriana é um conceito e uma ferramenta potencial novos na microbiologia19 às bactérias ambientais desconhecidas da cultura para obter ou analisar seus produtos metabólicos. Além disso, nossas células bacterianas contendo GVs são um sistema híbrido de um modelo de célula artificial (GVs) e uma célula viva (células bacterianas) para fazer uma nova ferramenta para a biotecnologia28 e bottom-up biologia sintética29.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma iniciativa líder para excelentes pesquisadores jovens (líder, n º 16812285) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão, um subsídio de ajuda para a pesquisa de jovens cientistas (no. 18K18157, 16K21034) da sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) a m. s., e Grant-in-Aid de MEXT a K.K. (no. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
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