Summary
我们描述了两种方法,用于评估与转移(TMEM)的肿瘤微环境(TMEM)和癌细胞内溢相关的瞬态血管渗透性,使用静脉注射高分子量(155 kDa)dextran小鼠。这些方法包括活体动物的活体成像和使用免疫荧光的固定组织分析。
Abstract
癌症相关死亡的最常见原因是转移,这个过程需要将癌细胞从原发性肿瘤传播到继发位点。最近,我们确定,原发性乳腺癌和肺部转移部位的癌细胞传播只发生在称为肿瘤微环境(TMEM)的门口。TMEM 门数是乳腺癌患者转移性疾病远程复发的预后。TMEM 门由癌细胞组成,该细胞在与血管周围、原兆噬细胞直接接触时过度表达行为蛋白调节蛋白 Mena,该细胞表示高水平的 TIE2 和 VEGF,其中这两个细胞都与血液紧密结合血管内皮细胞。癌细胞可以通过TMEM门内血管,由于由TMEM相关巨噬细胞和TMEM相关的梅纳表达癌细胞的联合活动编排的瞬态血管渗透。在本手稿中,我们描述了两种评估 TMEM 介导的瞬态血管渗透性的方法:生命内成像和固定组织免疫荧光。虽然这两种方法各有优缺点,但两种方法的结合可以最完整地分析 TMEM 介导的血管渗透性以及 TMEM 功能的微观环境先决条件。由于乳腺癌的转移过程,可能还有其他类型的癌症,涉及通过TMEM门传播癌细胞,因此必须采用成熟的方法来分析TMEM门活动。此处描述的两种方法为分析 TMEM 门性提供了一种全面的方法 , 无论是幼稚的还是药物治疗的动物 , 这对预防癌细胞的制剂的临床前试验至关重要通过TMEM传播。
Introduction
最近对癌症转移的理解的进步发现,上皮到间质过渡(EMT)和诱导迁移/侵入性癌细胞亚群本身不足以进行造血传播1.确实,以前人们认为,通过整个与癌症相关的内皮物转移癌细胞,因为肿瘤新血管学通常具有低围肠覆盖率的特点,因此具有很强的渗透性和渗透性。不稳定2,3,4。虽然肿瘤内功能缺陷的暗示性很强,但致癌过程中的血管修饰本身并不提供肿瘤细胞能够以不受控制的方式轻易穿透血管的证据。从生命内成像(IVI)研究的见解,其中肿瘤细胞荧光标记和血管标记通过静脉注射荧光探针(如dextran或量子点),表明,虽然肿瘤血管是均匀的可渗透至低分子量的extrans(例如70 kD)、高分子量的extrans(155 kD)和肿瘤细胞只能在位于血管分支点5的专门内血管内分部穿过内皮。6,7.使用动物模型和人类患者衍生材料进行的免疫组织化学(IHC)分析表明,这些部位是专门调节局部和瞬态血管渗透性的"门道",提供了一个简短的窗口。迁徙/侵入性癌细胞进入循环的机会。这些门道被称为"转移的肿瘤微环境"或"TMEM",而且,相当预料的是,它们的密度与乳腺癌患者患转移性疾病的风险增加有关8,9, 10.
每个TMEM门由三种不同类型的细胞组成:血管内大噬细胞,肿瘤细胞过度表达行为蛋白哺乳动物启用(Mena),和内皮细胞,所有直接物理接触对方1, 5,9,10,11,12,13。TMEM作为血管内门的功能的关键事件是血管内皮生长因子(VEGF)通过血管内大噬细胞14向基础血管的局部释放。VEGF 可以破坏内皮细胞 15、16、17、18、19 之间的同型结点,这种现象会导致瞬态血管泄漏,也称为"爆裂"渗透性,如IVI研究5所述。 TMEM 巨噬细胞已被证明表达酪氨酸激酶受体TIE2,这是VEGF介导的TMEM功能和这些巨噬细胞的定位到血管周围利基5,20,21,22.除了调节癌细胞传播和转移外,TIE2+巨噬细胞已被证明是肿瘤血管生成21、22、23的中央调节器, 24,25,26,27,28,29,30,31。因此,TIE2+巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,是转移级联的主要调节器。
为了更好地概念化TMEM介导的血管渗透性(即"爆裂"),将它与与内皮细胞-细胞结的溶解无关的其他血管渗透性模式区分开来非常重要。在完整的内皮内皮(其紧和粘结未中断),有三种主要类型的血管渗透性:(a) 细胞化,可能,也可能不,与摄入的物质的转细胞;(a) 细胞虫症,可以,也可能不,与摄入的物质的转细胞;((d) 细胞内渗透。(d) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性,可能或可能不会与摄入材料的转细胞结合;(b) 通过内皮芬斯特雷运输材料;和(c) 通过副细胞通路运输材料,由内皮紧接15、16、17、18、19、32调节,33,34.虽然在许多肿瘤中解除管制,但上述血管渗透模式主要在正常组织生理学和平衡的背景下加以描述,其极端是渗透性有限的组织(例如,血脑屏障,血检屏障),或丰富的渗透性(例如,肾肾肾小球仪的芬芳毛细血管)34,35,36,37 。
使用多光子生命内成像和多路免疫荧光显微镜,我们能够区分TMEM介导的血管渗透性("爆裂")和乳腺肿瘤中其他血管渗透性模式。为此,我们在小鼠中单次静脉注射高分子量荧光标记的探针。然后,使用活小鼠的活体成像捕获自发性爆裂事件;或者,通过血脉(如CD31+或内杜木明+)和使用免疫荧光显微镜的TMEM门分,可以量化探针的外化。此处介绍的协议描述了这两种技术,这些技术可以独立使用,也可以相互结合使用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有使用活体动物的实验必须按照动物使用和护理准则和条例进行。本研究中描述的程序是按照国家卫生研究院关于照料和使用实验动物的规定,并经阿尔伯特·爱因斯坦医学医学学院动物护理和使用学院批准进行的。委员会。
1. 利用活体动物成像评估"爆裂渗透性"
- 将合成乳腺肿瘤移植到具有荧光巨噬细胞的小鼠宿主中
- 生成适合移植的肿瘤组织片段。
- 通过跨越自发的、自生的、基因工程的小鼠乳腺癌模型 MMTV-PyMT 小鼠与表达荧光记者38的转基因小鼠,在小鼠乳腺癌模型中生成荧光标记肿瘤, 39 [例如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)或Dendra2]。
- 允许带有荧光标记肿瘤的 MMTV-PyMT 小鼠长到不超过 2 厘米(大约 10-12 周的年龄)的大小。
- 将携带MMTV-PyMT小鼠的肿瘤放入一个有5%的黄曲的腔室,直到所有呼吸停止30秒后,将其安乐死。
- 进行宫颈脱位。
- 使用局部脱毛霜从安乐死小鼠的腹部去除头发。
- 将带有 DMEM/F12 细胞培养基培养基的培养皿放在冰上。
- 将鼠标和培养皿放在冰上,放入烟罩。
- 用70%的乙醇消毒小鼠的腹部。
- 使用无菌手套和手术工具(消毒剪刀、钳子和刀片)去除肿瘤并将其放入培养皿中。
- 将肿瘤切成小块(+2毫米 x 2毫米 x 2毫米大小),丢弃任何坏死部分,而它们在培养皿中。
- 将肿瘤片移植到受体宿主中。
- 用转基因荧光标记巨噬细胞饲养小鼠,例如 MacGreen40或 MacBlue 41小鼠(Csf1r -GAL4VP16/UAS-ECFP)
- 允许带有荧光标记的巨噬细胞的FVB小鼠长到+4-6周)。
- 用5%的半分面胶作为载体气体,用荧光标记巨噬细胞对FVB小鼠进行麻醉。
- 将麻醉量降低至±3%异二苯,并在小鼠眼睛上涂上眼膏,以防止干燥。
- 从小鼠的第 4个乳腺上去除头发。
- 用贝他当素清洁皮肤。在整个程序的其余部分保持无菌条件非常重要。这包括使用消毒仪器和试剂。
- 使一个小切口 +2-3 毫米只是低于第 4 个奶嘴。
- 解剖,直到乳腺脂肪垫暴露。
- 从培养皿中取一块肿瘤,用人工细胞外基质涂上。
- 移植肿瘤下的第4个乳腺脂肪垫。
- 使用氰丙烯酸酯粘合剂关闭切口。
- 持续监测动物,直到它从麻醉中完全恢复,并能够保持胸腔回肠。此外,在完全恢复之前,不要将动物归还给其他动物的公司。
- 为了尽量减少感染,在动物的饮用水瓶(8液体盎司)中加入1 mL的100毫克/mL苯丙沙辛抗生素。
- 让肿瘤生长到明显(+5毫米;+4周)。
- 根据实验情况,将小鼠分配到治疗组,并执行相应的治疗(如果适用)。
- 生成适合移植的肿瘤组织片段。
- 用于生命内成像的设置
- 打开显微镜的双光子激光和探测器。
- 打开加热盒并预热显微镜的 x-y 级。
- 将定制的舞台插入42到 x-y 阶段。
- 成像窗口的准备
- 在设置成像之前,高压灭菌器定制圆形成像窗口框架42。
- 使用移液器或胰岛素注射器将一层薄薄的氰丙烯酸酯粘合剂放在窗框上,并贴上 8 mm 圆形盖玻璃。
注:1) 避免在盖玻璃的透明孔径上残留,这一点很重要。2) 在进行成像前,必须将盖玻璃粘附在窗框上至少 1 小时。 - 使用用少量丙酮润湿的实验室擦拭,仔细擦拭盖玻璃透明孔径上多余的氰化。
- 制备尾静脉导管,用于在成像过程中给给液体和荧光染料
- 切割一块30厘米的聚乙烯管,以构建一个尾静脉导管。
- 将 30 G 针头的针部从 Luer 尖塔上分离,轻轻来回弯曲针头,直到其断裂。
注:针头应靠近 Luer 角针,而不是针尖。这可以通过钳子或钳子来抓住针头,以防止针棒受伤。 - 将针头的钝端插入聚乙烯管的一端。
- 将另一根 30 G 针头的锋利端插入管的另一端,保持其 Luer 分管连接。
- 用磷酸盐缓冲盐水填充 1 cc 注射器,将其连接到组装导管的 Luer 分管,并冲洗尾静脉导管,确保系统中没有气泡。
- 对于血管标签,用 100 μL 的 100 μL 10 mg/kg 155 kDa dextran-四甲基二甲胺 (TMR) 或量子点填充 1 cc 注射器。
- 用于成像的鼠标制备
- 使用 4%-5% 的杂散物与 100% 氧气混合在下面的笼子(+1 英尺以下)中麻醉小鼠,流量为每分钟 1.5-2 L。
- 打开手术工作区上的热灯。此步骤对于在手术期间保持小鼠的核心生理体温至关重要。
- 将鼠标放在热灯下,在手术期间将麻醉降低至2%-3%。
注:请务必将热灯与鼠标保持安全距离(约 1 英尺),以避免过热。 - 将眼膏放在小鼠眼睛上,以防止眼睛干燥和失明。
- 通过执行脚趾夹测试测试鼠标是否被麻醉。如果动物退出,将异曲兰的剂量增加1%,并在1-2分钟内重新测试。
- 将尾静脉导管插入尾部最远端。
- 用一小块实验胶带将尾静脉导管固定在尾巴上,胶带包裹在尾巴上,粘在针上,以确保它不会脱落。
- 通过尾静脉导管注入每h 50 μL的PBS,以提供足够的水化。避免向导管中注入过多的液体(不超过每小时 200 μL)或任何气泡,这一点至关重要,因为这可能对鼠标造成致命。
- 使用脱毛霜去除第4和第5乳腺腹部的头发。
- 用贝他当素清洁皮肤,让皮肤干燥。
- 使纵向中线切口开始立即优于生殖器,并携带切口到第4乳腺的优越方面的水平。
- 将切口横向至第 4乳腺的优越方面。在这一点上,避免损害血液供应至关重要。
- 使用无菌钳子和剪刀将乳腺脂肪垫从围膜上分离出,形成组织皮瓣。
注:皮肤皮瓣成像易受显著运动伪影和组织脱水的影响。如前所述,通过在皮瓣的皮肤侧贴上一块坚硬的橡胶(使软组织变硬并将其与身体其他部位分离),然后将肿瘤放入浅成像中,可以避免这些障碍。窗口,以保持水化。这对于稳定成像至关重要,因为在此环境中的肿瘤和周围组织非常合规。 - 将一小块尺寸为 2 cm x 2 cm 的硬质橡胶固定在皮瓣的皮面上,以固定(使用氰丙烯酸酯胶水)来稳定皮瓣。肿瘤应位于橡胶稳定的区域的中心。
- 保持暴露的组织用PBS滴水合。
- 在定制成像窗框的外边缘涂抹一小片氰化丙烯酸酯。
- 在盖玻璃中心涂抹一小滴 PBS (±10±20 μL)。
- 用实验室擦拭干燥周围的皮瓣组织。务必确保窗框上的氰化不与玻璃上的 PBS 接触,因为这可能导致氰化丙烯酸酯聚合并过早设置。
- 将小成像窗口固定在组织活门上,肿瘤位于透明孔径的中心。
- 从舞台上拆下加热盒。
- 将麻醉小鼠和尾静脉导管转移到显微镜阶段。格外小心,确保尾静脉导管不会脱落。
- 将鼠标放在舞台上的易发位置。
- 将鼻锥的鼻锥放在鼻腔上,以确保麻醉的维持。
- 将窗口插入自定义 x-y 级板上的孔中。
- 将加热盒放回舞台上以保持生理温度。
- 通过将脉冲血氧仪探头通过夹子传感器连接到后爪,监控动物的生命体征。
- 慢慢减少约卢兰到0.5%-1%,以保持足够的血液流动,避免过度麻醉小鼠。
- 生命内成像
注:本部分描述的成像是在定制双激光多光子显微镜上进行的,先前已经描述了5,39,45。简而言之,飞秒激光用于产生以 880 nm 为中心的 90 飞秒脉冲激光。荧光光在从激励光分离后,通过二色光(色度,Z720DCXXR)与激发光分离后,通过四个同时采集的探测器中的三个(蓝色 = 447/60、绿色 = 520/65 和红色 580/60;中央波长/带宽)进行检测。显微镜支架包含 25 倍、1.05 NA(数字孔径)长工作距离(2 mm)物镜。需要注意的是,虽然我们使用了定制的显微镜,但下述协议也可以在任何市售的多光子显微镜上完成。- 在 25x、1.05 NA 显微镜物镜和车窗盖玻璃之间放置一滴蒸馏水,使其与光学接触。
- 使用显微镜目镜将焦点对准窗口表面附近有荧光肿瘤细胞的区域。
- 查找流动的血管和标记的巨噬细胞。关键是要有流动的血管来评估血管的动力学。
- 将显微镜切换到多光子模式。
- 设置 z 系列的上限和下限,该范围约为 50 μm。
- 通过使用焦点调节器将目标移动到最浅的位置,并单击 Z 位置顶部按钮将此位置标记为软件中的零,从而设置 z 系列的上限。
- 设置将目标移动到最深处(通常从顶部移动到 50-70 μm 的较小肿瘤)的 z 系列的下限,然后单击 Z 位置底部按钮。
- 将 z 步长大小设置为 5 μm。
- 单击"时移"面板按钮,将采集之间的时间间隔设置为至少 10 秒,以提供足够的时间来补充目标透镜上方的水。这是用挤压移液器在长时间内在目标上手动完成的。
- 取出尾静脉导管中带PBS的注射器,用另一个含有155 kDa dextran-TMR(四甲基罗丹胺)的注射器更换。
- 通过尾静脉导管注射100 μL的155 kDa dextran-TMR。
- 注射后,用PBS注射器更换TMR注射器。
- 通过单击 Z-Stack 和时移按钮,然后单击记录按钮来获取 z 堆栈延时成像。
- 每30-45分钟注射50μL的PBS,以保持动物的充分水化。避免同时注射超过 200 μL,因为这可能导致液体过载。
- 安乐 死
- 将异曲成增加到5%,并将动物保持在5%的异曲原以下,鼻锥就位,直到呼吸停止后30s。
- 将鼠标从舞台上卸下。
- 进行宫颈脱位。
- 图像处理
- 将所有图像加载到 ImageJ 中,并将其格式化为 5 维超堆栈(x、y、z、t 和颜色通道)。
- 使用既定方法38,执行光谱重叠分离(即:GFP和CFP)和消除超堆栈的x-y漂移。
- 使用亮度和对比度调整来增加血通道的白电平,使背景信号变得可见。
- 对于每个 z 切片,仔细检查每个影片是否有瞬态血管泄漏的迹象("爆裂")。以快速帧速率 (40 fps) 运行影片可能有助于进行这种识别。
- 一旦识别了突发,将此通道的亮度返回到正常水平,并将超堆栈裁剪到此区域和 z 切片。
2. 使用固定组织分析评估血管外部
-
肿瘤和样品制备
注:本议定书的第二部分假定乳腺肿瘤是从乳腺癌的正交移植小鼠模型(即MMTV-PyMT)中采集的。此模型可能与协议第 1 部分中描述的模型相同,尽管此时不需要荧光标记的肿瘤。- 实验管道终止(即药物治疗等)终止后,在牺牲小鼠之前,进行100μL的10mg/mL 155 kDa-四甲基红胺的尾输注。
- 牺牲小鼠和收获乳房肿瘤。
- 将肿瘤固定在10%的形式48-72小时,并继续石蜡嵌入。
- 使用微图,从正式固定石蜡嵌入(FFPE)组织中切割两个5μm厚的连续幻灯片。一张幻灯片用于染色 dextran,另一张用于执行 TMEM 三重 IHC,供参考。
注:TMEM三免疫组化学方案已在其他地方10描述。
-
IF 染色和扫描两个顺序部分中的第一个
- 将幻灯片提交到标准去石蜡化协议。这包括在二甲苯中进行两次后续浸渍(每次10分钟),随后在连续稀释的酒精溶液中脱水(100%、95%、70%和50%EtOH,在H2O中,每次浸泡2分钟)。
- 通过加热(接近沸点)浸没在青石中的部分(pH 6.0 调整)20分钟,执行抗原检索。
- 让样品冷却至室温15-20分钟,然后在PBS中洗3次,每次洗2分钟。
- 在阻塞缓冲液中堵塞60-90分钟(10%FBS;1%BSA;0.0025%鱼皮明胶;0.05%PBST,即0.05%补间-20的PBS)。
- 用原发大鼠和兔子抗体的混合物孵育样品,分别针对内皮素和TMR,然后用PBST3x,每次2分钟洗涤。
- 用二级驴抗体的混合物孵育样品,以对付大鼠IgG(与Alexa-647结合)和兔子IgG(与Alexa-488结合),然后分别用PBST3x 2分钟洗涤。
- 执行常规 DAPI 染色(即浸入 DAPI 溶液 5-6 分钟),使用不含甘油的"硬"安装介质安装幻灯片,并存放在黑暗的地方,直到扫描。
- 为获得最佳效果,可在数字整个幻灯片扫描仪上扫描幻灯片。
-
图像分析
- 使用适合数字病理学的任何软件,每箱捕获 10 个高功率场 (HPF)。
- 将内皮乌斯金(红色)和 TMR(绿色)通道分别保存为 TIFF。
- 使用 ImageJ,上传 TIFF 文件并将其转换为 8 位图像。
- 将 8 位图像阈值到负控制级别,并生成两个双面化图像,显示内皮素和 TMR"掩码"。
- 从二进制工具中,选择 Endomucin 蒙版上的填充孔。
- 生成并保存以下五个感兴趣的区域:1) 阈值的 dextran 图像为"Dextran ROI"(ROI1),2) 阈值内西金图像为"血管 ROI"(ROI2),3) 倒置内显辛图像为"外血管 ROI"(ROI3),4)相交的"血管外 ROI"和"额外 ROI"图像 (ROI1 = ROI3) 作为"血管外投资回报率"(ROI4),5) 整个图像为"肿瘤 ROI"(ROI5)。
- 将 ROI4 区域除以 ROI5 区域,再乘以 100 以生成血管外分光覆盖整个肿瘤的百分比面积。
- 每箱重复10-20个HPFs(取决于组织可用性)的过程,并为每个病例生成平均血管外分量(%面积)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本文中描述的实验过程在图1A-C中进行了简要的总结和说明。
为了测量TMEM介导的血管渗透性("爆裂活性")和减少其他血管渗透模式(如导言所述的跨细胞和准细胞)的实验噪音,我们进行了静脉注射(即v.)注入高分子量探针,如155 kDa Dextran,与四甲基罗丹胺结合。低分子量的Dextrans没有区分三种血管渗透模式。我们以往的经验显示,155 kDa TMR-Dextran 的全身循环有效地标记了正常组织的血管,如乳腺和肺(图 2A,B),以及肿瘤组织,如肿瘤组织肺部原发性乳腺癌和乳腺癌转移(图2C,D)。正如先前的研究5,46,155 kDa TMR-Dextran所证实的,因此是测量原发性肿瘤和继发性肿瘤部位"爆裂"的合适探针。峰值爆发活性(点黄色区域)的特征示例,在原发性MMTV-PYMT乳腺肿瘤中使用多光子生命内成像,如一系列静止图像(图3A)。爆活性总是与TMEM门(虚线白色圆圈)结合,其特征是Dendra2的空间并列——肿瘤细胞CFP=巨噬细胞和内皮(图3A)。如前所述,每个TMEM门由一个血管内大噬细胞,一个梅纳过度表达肿瘤细胞,和一个内皮细胞,所有在直接的身体接触彼此。虽然Mena在这些实验中使用的小鼠模型中没有明确标记,但它先前已被证明在后期PyMT癌47中被过度表达。这简化了TMEM门的识别,并消除了在肿瘤细胞中明确标注Mena的需要。
为了评估固定组织分析中依赖TMEM的血管渗透性,我们在从14周大的MMTV-PyMT供体小鼠身上移植了肿瘤块的小鼠中执行了本协议中所述的程序。当小鼠达到适当的肿瘤大小时,它们接受155-kDa TMR-Dextran的单个i.v.剂量,如本协议第2部分所述,并在1小时后被牺牲。肿瘤组织被收集并进行IF分析。内西乌辛荧光信号用作dextran荧光信号的排除面膜,允许在高渗透和低血管或不可渗透的血管之间进行区分(图3B)。如前文在Karagiannis等人48中所述,顺序幻灯片也沾染了先前建立的TMEM三重污点,并与相应的IF幻灯片对齐。使用这种方法,我们确认乳腺肿瘤组织内的高渗透血管至少有一个相关的TMEM门道(图3B)。
图 1.程序摘要。(A) 从转基因动物(绿色)中取走的乳房(绿色)的登德拉-2标记侵入性癌[FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)mul-Tg(MMTV-iCre)Jwp-Tg(loxP-停止-洛克斯-Pdendra2)Jwp],并切成小块。然后,一块被正射移植到另一种转基因动物,其巨噬细胞被标记为青色荧光蛋白(青色) [FVB/N-Tg (Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]。然后,将正位移植到肿瘤上允许生长,之后将小鼠分配到适当的治疗臂上。(B) 治疗完成后,将小鼠进行生命内成像。麻醉后,进行皮瓣手术,然后用橡胶背衬稳定。然后,在肿瘤上贴着一个浅成像窗口。最后,将鼠标放置在显微镜舞台上,使窗口适合定制舞台板,然后获取图像。(C) 或者,A的小鼠在1小时后施用高分子量dextran并牺牲。 肿瘤然后被去除,固定,并处理石蜡嵌入。组织部分被切割,在IHC中为TMEM染色,在IF中为dextran和血管染色,并在数字全滑动扫描仪上扫描。最后,对两个扫描的图像进行对齐,并选择单独的视场进行分析和定量血管泄漏。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.在健康和患病组织中,TMR-Dextran标记血管的可视化。(A) 转基因动物体内健康发育的乳腺的图像,其血管被TMR-Dextran(红色)标记,乳腺导管上皮被荧光蛋白Dendra-2(绿色)标记,以及用青色标记的巨噬细胞荧光蛋白(蓝色)=FVB/N-Tg(洛克斯P-停止-洛克斯-普彭德拉2)Jwp-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)*。(B) 健康的肺组织通过小鼠内的肺成像窗口进行可视化,小鼠的血管被 TMR-Dextran (红色)标记。蓝色 = 来自胶原纤维的 SHG。(C) Dendra2 标记的侵入性导管癌取自转基因动物 [FVB/N-Tg (MMTV-PyMT) mulxTg (MMTV-iCre) Jwp-Tg (loxP-stop-loxP-Pdendra2) Jwp]和正位移植到另一种转基因动物巨噬细胞被标记为青色荧光蛋白(蓝色) =FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)和标有TMR-Dextran(红色)的容器。(D) 静脉注射肿瘤细胞(E0771;用荧光蛋白三叶草标记)到转基因动物的8天后肺转移,其巨噬细胞被青色荧光蛋白(青色)标记为FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)•和血管,由 TMR-Dextran (红色)标记。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.使用生命内成像和固定组织分析可视化 TMEM 介导的血管渗透性。(A) 从转基因动物的乳房(绿色)的登德拉-2标记侵入性癌(绿色)中新血管(红色)中新血管(红色)的155kDa TMR-Dextran标记的一次时间失效的体内成像电影中的静止图像(MMTV-iCre)Jwp-Tg(loxP-stop-loxP-Pdendra2)Jwp和正位移植到另一种转基因动物中,巨噬细胞被青色荧光蛋白(青色)标记[FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]。虚线表示泄漏(爆裂)事件之前(t = 0')、期间(t = 17')和后(t = 52')的瞬态血管泄漏区域的轮廓。虚线的白色圆圈指向 TMEM 门口,如实时成像中捕获的。(B) 内杜木因的多通道免疫荧光(第一列)、155-kDa dextran-TMR(第二列)、其与DAPI(第三列)、阈值血管和血管外膜(第四列)的合并图像MMTV-PyMT小鼠中TMEM IHC(第五列)的相应顺序部分。顶行:远离TMEM的血管轮廓,显示为"非泄漏"血管轮廓。底行:TMEM相关的血管型材,显示为"漏"型血管。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里,我们概述了两个协议,可用于可视化和量化一种特定类型的血管渗透性,这是存在于TMEM门口,并与血管紧和粘附结的中断相关。这种类型的血管渗透性是瞬态的,由三方TMEM细胞复合体控制,如上文5所述。识别和量化 TMEM 相关血管渗透性的能力对于评估亲转移性癌细胞微环境以及检查传统细胞毒性疗法对肿瘤的影响的临床前研究至关重要微环境以及靶向和非靶向疗法的抗转移潜力。重要的是,我们在这里证明,这种评估可以通过在固定组织中进行生命内成像或免疫荧光来完成。这两种方法都有其优点和缺点。生命内成像允许直接可视化血管渗透性的动态过程,但需要专门的设备和培训。另一方面,在固定组织中进行的免疫荧光只提供静态图像,但可以在大多数实验室中常规执行。
癌症患者通常接受某种形式的全身治疗,全身治疗的成功通常通过评估与癌细胞存活相关的参数(如凋亡、增殖或肿瘤大重)来评估。然而,同样重要的是了解这些系统疗法如何影响癌细胞传播,因为大多数癌症相关死亡是由于转移引起的,这个过程既涉及癌细胞增殖,也涉及癌细胞传播1.例如,最近的研究表明,化疗可以诱导小鼠和人类乳腺癌的TMEM门的密度显著增加48,49。此外,研究还表明,化疗诱导TMEM活性,导致癌细胞造血传播,增加循环癌细胞,增加肺转移48。化疗引起的TMEM活性增加可以通过系统给药来抑制TIE2功能,因此TMEM活性,称为rebastinib14,48。因此,本文描述的协议可以通过将治疗小鼠与未治疗小鼠群进行比较,为各种系统治疗对TMEM活性的影响提供有价值的端点测量。
近年来,癌症抗血管治疗的概念被重新审视,建议血管"正常化"策略(即血管异常结构和功能的暂时重组)可能比靶向更可取血管破坏,因为它使新血管更有效地提供药物50,51,52,53,54。鉴于这一新兴假说,其他组也开发了评估血管渗透性和测试血管正常化策略效率的测定55。应该提到,原则上,这些方法用于评估与TMEM无关的血管渗透模式。因此,选择最合适的血管渗透性测定取决于研究的范围,研究人员必须确保他们理解每个已发表的血管渗透性测定方法的适用性,然后再将其应用于其研究。
如上所述,此处描述的两种方法中的每一个都比其他方法具有某些优势。例如,在体内测量"爆裂渗透性"可提供宝贵的动力学信息,但由于爆破是一种罕见的事件,因此可能需要长时间进行几个小时的成像,才能获得足够的数据。此外,生命内成像需要专门的设备,并非所有调查人员都可以使用这些设备。另一方面,对固定组织中TMEM活性的评估相对容易,只需要标准的实验室设备。此外,对固定组织中TMEM活性的分析更容易解释,但缺乏动力学信息。此外,固定组织分析不太具体,因为它可能捕获随着时间的推移从完整的内皮瘤的细胞和副细胞血管渗透性,甚至由于自发血管损伤的突然泄漏事件dextran的累积泄漏。因此,这两种方法的协同使用将使对TMEM介导的血管渗透性的解释更加具体和敏感。虽然我们没有明确测试这里介绍的技术的其他应用,它们可能证明可用于研究诱导血管渗透性,例如通过感染或药物治疗。
总之,TMEM相关血管渗透性的测量,如此处的两种独立方法所概述,为评估促进转移性肿瘤微环境及其相关的TMEM活性提供了有用的工具,并可用于一些范围由任何实验室。这些方法在临床前评估全身疗法对癌细胞传播的影响方面特别有用。此外,它们可用于评估可以阻断化疗诱导的TMEM活性的制剂的效果,最后,这些方法可用于评估第一阶段患者试验前的最佳联合疗法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人没有透露任何利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院的分析成像设施(AIF)提供成像支持。这项工作得到了NCI(P30CA0133330、CA150344、CA 100324和CA216248)、SIG 1S10OD019961-01、格鲁斯-利珀生物光子学中心及其综合成像项目以及蒙特菲奥雷的露丝·基尔施施泰因T32外科医生培训资助项目的支持。肿瘤微环境研究(CA200561)。
葛兰素史克共同撰写稿件,对图1C和3B进行成像,开发固定组织分析协议,分析并解释所有数据;JMP共同撰写了手稿,并为图1B、2C和3A进行了手术和生命内成像;LB & AC为图 2B 进行了手术和生命内成像;RJ为图2A进行了手术和生命内成像;JSC共同撰写稿件,并分析和解释所有数据;MHO共同撰写手稿,并分析和解释所有数据;和DE为图2D进行了手术和生命内成像,共同撰写了手稿,开发了固定组织分析和生命内成像方案,并分析和解释了所有数据。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
| Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
| Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
| DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
| Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
| Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
| Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
| Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
| Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
| Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
| TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
| Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 184835 |
References
- Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
- Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
- Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
- Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
- Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
- Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
- Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
- Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
- Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
- Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
- Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
- Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
- Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
- Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
- Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
- Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
- Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
- Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
- Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
- Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
- Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M.
- Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
- Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
- Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
- Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
- Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
- Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
- Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
- Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
- Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).
