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Cancer Research

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59633
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Summary

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Abstract

A causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer é a metástase, um processo que requer a disseminação de células cancerosas do tumor primário para sítios secundários. Recentemente, nós estabelecemos que a disseminação da pilha de cancro no cancro da mama preliminar e em locais metastáticos no pulmão ocorre somente nas entradas chamadas MicroEnvironment do tumor da metástase (TMEM). O número da entrada de TMEM é prognóstico para o retorno distante da doença metastática em pacientes do cancro da mama. As portas de tmem são compostas de uma célula cancerosa que expresse sobre-expressa a proteína reguladora de actina Mena no contato direto com um macrófago perivascular, pró-angiogênicos que expresse níveis elevados de TIE2 e de VEGF, onde ambas estas pilhas são amarradas firmemente a um sangue célula endotelial do vaso. As células cancerosas podem intravasate através das entradas de TMEM devido à permeabilidade vascular transiente orquestradas pela atividade comum do macrófago TMEM-associado e da célula cancerosa TMEM-associada de Mena-expressando. Neste manuscrito, nós descrevemos dois métodos para a avaliação da permeabilidade vascular transiente TMEM-negociada: imagem latente intravital e a imunofluorescência fixa do tecido. Embora ambos os métodos tenham suas vantagens e desvantagens, combinar os dois pode fornecer as análises as mais completas da permeabilidade vascular tmem-negociada assim como pré-requisitos microambientais para a função de tmem. Desde o processo metastático no cancro da mama, e possivelmente outros tipos de cancro, envolve a disseminação da pilha do cancro através das entradas de TMEM, é essencial empregar métodos bem estabelecidos para a análise da atividade da entrada de TMEM. Os dois métodos descritos aqui fornecem uma abordagem abrangente para a análise da atividade de entrada de TMEM, seja em animais ingênuos ou farmacologicamente tratados, o que é de suma importância para os ensaios pré-clínicos de agentes que impedem a célula cancerosa disseminação via TMEM.

Introduction

Os avanços recentes em nossa compreensão da metástase do cancro descobriram que a transição epithelial-à-mesenchymal (EMT) e a indução de uma subpopulação migratória/invasora da pilha de cancro não são, por si só, suficientes para a disseminação hematógena 1. indeed, pensou-se previamente que as pilhas de cancro se por metástese intravasate através da totalidade do endotélio cancro-associado como o neovasculature do tumor é caracterizada frequentemente pela baixa cobertura do pericyte, e como tal, é altamente permeável e instável2,3,4. Embora altamente sugestivo de funções defeituosas dentro do tumor, as modificações vasculares durante a carcinogénese não fornecem a evidência por se que as pilhas do tumor podem penetrar vasos sanguíneos facilmente e em uma forma descontrolada. Introspecções dos estudos intravital da imagem latente (IVI), em que as pilhas do tumor Fluorescently-são etiquetadas e o vasculatura é etiquetado através da injeção intravenosa de pontas de prova fluorescentes (tais como o dextrano ou pontos do Quantum), mostra que, quando os vasos do tumor forem uniformemente permeável ao dextranos de baixo peso molecular (por exemplo, 70 kD), o dextranos de alto peso molecular (155 kD) e as células tumorais podem atravessar o endotélio apenas em sítios especializados de intravasação que estão preferencialmente localizados no ponto de ramificação vascular5, 6 anos de , as análises 7. immunohistochemical (IHC) usando modelos animais e o material paciente-derivado humano mostraram que estes locais são "doorways" que se especializam em regular a permeabilidade vascular, localmente e transientemente, fornecendo uma breve janela de oportunidade para que as células cancerosas migratórias/invasivas entrem na circulação. Estas portas são chamadas "microambiente do tumor da metástase" ou "tmem", e, completamente expectedly, sua densidade correlaciona com um risco aumentado de desenvolver a doença metastática em pacientes do cancro da mama8,9, a 10.

Cada porta TMEM consiste em três tipos distintos de células: um macrófago perivascular, uma célula tumoral sobreexpressando a proteína actina-reguladora de mamíferos ativada (Mena), e uma célula endotelial, tudo em contato físico direto uns com os outros1, 5,9,10,11,12,13. O evento-chave para a função de TMEM como uma entrada de intravasação é a liberação localizada do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) para o vaso subjacente pelo macrófago perivascular14. VEGF pode interromper junções neutralizantes entre as células endoteliais15,16,17,18,19, um fenômeno que resulta em vazamento vascular transitório, também conhecida como permeabilidade "estourando" como descrito em estudos de IVI 5. Os macrófagos de tmem foram mostrados para expressar o receptor da tirosina quinase TIE2, que é exigido para a função de tmem VEGF-negociada e homing destes macrófagos ao Niche perivascular5,20,21 , 22. além de regular a disseminação e a metástase de células cancerosas, TIE2+ macrófagos demonstraram ser reguladores centrais da angiogênesetumoral 21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Como tal, TIE2+ macrófagos representam um constituinte crítico do microambiente tumoral e o principal regulador da cascata metastática.

Para conceituar melhor a permeabilidade vascular mediada por TMEM (ou seja, "estourando"), é muito importante distingui-la de outros modos de permeabilidade vascular que não estão associados à dissolução de junções endoteliais de células celulares. Em um endotélio intacto (um cujas junções apertadas e aderens não são interrompidas), existem três tipos principais de permeabilidade vascular: (a) pinocitose, que pode, ou não, ser acoplada à transcitose do material ingerido; (b) transporte de material através de fenestrae endotelial; e (c) transporte de material através da via paracelular, que é regulado por junções apertadas endoteliais15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. embora desregulamentado em muitos tumores, os modos acima mencionados da permeabilidade vascular foram descritos na maior parte no contexto da fisiologia e do Homeostasis normais do tecido, os extremos de que são os tecidos com uma ou outra permeabilidade limitada ( por exemplo, barreira hematoencefálica, barreira sangue-testis), ou permeabilidade abundante (por exemplo, capilares fenestrados do aparelho glomerular renal)34,35,36,37.

Usando a imagem latente intravital do multifotônica e a microscopia multiplexada da imunofluorescência, nós podemos distinguir entre a permeabilidade vascular tmem-negociada ("estourando") e outros modos da permeabilidade vascular em tumores do peito. Para conseguir isto, nós realizamos uma única injeção intravenosa de um peso elevado-molecular, sonda fluorescently-etiquetada nos ratos. Eventos de ruptura espontânea podem ser capturados usando imagens intravitais em camundongos vivos; ou alternativamente, o extravasamento da sonda pode ser quantificado por estudos de colocalização com vasculatura sanguínea (por exemplo, CD31+ ou Endomucin+) e portas tmem usando microscopia de imunofluorescência. Os protocolos apresentados aqui descrevem ambas as técnicas, que poderiam ser usadas independentemente ou conjuntamente umas com as outras.

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Protocol

Todos os experimentos com animais vivos devem ser conduzidos de acordo com as diretrizes e regulamentos de uso e cuidado com animais. Os procedimentos descritos neste estudo foram realizados de acordo com os regulamentos nacionais de saúde relativos ao cuidado e uso de animais experimentais e com a aprovação do colégio Albert Einstein de medicina cuidados e uso animal Comissão (IACUC).

1. avaliação da "permeabilidade de ruptura" usando imagens de animais vivos

  1. Transplantação de tumores syngeneic do peito em anfitriões do rato com macrófagos fluorescentes
    1. Gerar pedaços de tecido tumoral adequado para transplante.
      1. Gerar tumores com rótulo fluorescently em modelos de câncer de rato mamário, cruzando o espontâneo, autóctone, geneticamente projetado mouse mamária modelo de câncer MMTV-pymt camundongos com ratos transgênicos expressando repórteres fluorescentes38, 39 [por exemplo, proteína verde fluorescente aumentada (EGFP), proteína fluorescente ciano aumentada (ecfp), ou Dendra2].
      2. Permita que os ratos de MMTV-pymt com tumores cDNAs etiquetados cresçam a um tamanho de não maior de 2 cm (aproximadamente 10-12 semanas da idade).
      3. Eutanize o tumor que carrega os ratos de MMTV-pymt colocando os em uma câmara com isoflurano de 5% até 30 segundos depois que todas as respirações param.
      4. Realize uma luxação cervical.
      5. Retire o cabelo do abdômen do rato eutanasiado usando um creme depilatório tópico.
      6. Coloque um prato de Petri com meio de cultura de células DMEM/F12 no gelo.
      7. Coloc o rato e a placa de Petri no gelo na capa das emanações.
      8. Sanitize o abdômen do rato com 70% de álcool etílico.
      9. Usando luvas estéreis e ferramentas cirúrgicas (tesoura esterilizada, fórceps e lâmina) remover os tumores e colocá-los na placa de Petri.
      10. Corte o tumor em pedaços pequenos (~ 2 mm x 2 mm x 2mm de tamanho), descartando qualquer porção necrótica, enquanto eles estão na placa de Petri.
    2. Transplantar as partes do tumor em anfitriões do receptor.
      1. Criar camundongos com macrófagos com rótulo de fluorescently geneticamente modificados, por exemplo, MacGreen40 ou macblue 41 MICE (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ecfp)
      2. Permita que os ratos de FVB com macrófagos cDNAs etiquetados cresçam a uma idade de ~ 4-6 semanas).
      3. Anestesiam os camundongos FVB com macrófagos fluorescentamente rotulados em uma câmara utilizando isoflurano a 5% com oxigênio como gás transportador.
      4. Reduza a anestesia para ~ 3% isoflurano e aplique pomada oftálmico aos olhos do mouse para evitar a secagem.
      5. Retire o cabelo de sobre a 4ª glândula mamária do rato.
      6. Limpe a pele com Betadine. É importante manter condições estéreis durante todo o resto do procedimento. Isso inclui o uso de instrumentos esterilizados e reagentes.
      7. Faça uma pequena incisão ~ 2-3 mm apenas inferior ao 4º mamilo.
      8. Dissecar até que a almofada gorda mamária esteja exposta.
      9. Tome um pedaço de tumor do prato de Petri e casaco em matriz extracelular artificial.
      10. Transplante de tumores debaixo da almofada gorda mamária 4th .
      11. Feche a incisão usando adesivo de cianoacrilato.
      12. Monitore continuamente o animal até que recupere inteiramente da anestesia e possa manter o recumbency esternal. Além disso, não para devolver o animal para a empresa de outros animais até a recuperação completa.
      13. Para minimizar infeções, adicione 1 mL de 100 mg/mL de antibiótico enrofloxacina à garrafa de água potável do animal (8 fl oz).
      14. Permitir que os tumores cresçam até palpáveis (~ 5 mm; ~ 4 semanas).
      15. Dependendo do experimento, alocar os camundongos em grupos de tratamento e realizar os tratamentos correspondentes, se aplicável.
  2. Configuração para imagiologia intravital
    1. Ligue o laser de dois fotônicos do microscópio e os detectores.
    2. Gire sobre a caixa de aquecimento e pré-aqueça o estágio x-y do microscópio.
    3. Coloque a inserção de estágio feita medida42 no estágio x-y.
  3. Preparação da janela de imagem
    1. Antes da configuração para a imagem latente, autoclave o frame de janela feito-à-medida da imagem latente circular42.
    2. Use uma pipeta ou uma seringa da insulina para coloc uma camada fina de adesivo do cianoacrilato à moldura de janela e afixe no lugar um vidro de tampa circular de 8 milímetros.
      Nota: 1) é importante evitar a obtenção de resíduos na abertura clara do vidro da tampa. 2) é importante aderir o vidro da tampa à moldura da janela pelo menos 1 h antes do uso para a imagem latente.
    3. Limpe cuidadosamente qualquer excesso de cianoacrilato na abertura clara do vidro de cobertura usando um laboratório de limpeza molhada com uma pequena quantidade de acetona.
  4. Preparação de cateter de veia cauda para administração de fluidos e corantes fluorescentes durante a imagem
    1. Corte uma parte de 30 cm de tubulação do polietileno para construir um cateter da veia de cauda.
    2. Retire a parte da agulha de uma agulha de 30 G do cone Luer, dobrando suavemente a agulha para a frente e para trás até que se quebre.
      Nota: a agulha deve ser mantida perto do cone luer e não da ponta da agulha. Isto pode ser feito com alicates ou fórceps para agarrar a agulha a fim impedir ferimento da vara da agulha.
    3. Insira a extremidade sem corte da agulha em uma extremidade da tubulação de polietileno.
    4. Insira a extremidade afiada de outra agulha de 30 G, mantendo a sua conicidade Luer unida, na extremidade oposta do tubo.
    5. Encha uma seringa de 1 cc com soro fisiológico tamponado com fosfato, prenda-a ao cone Luer do cateter montado e lave o cateter da veia cauda certificando-se de que não há bolhas de ar no sistema.
    6. Para a rotulagem vascular, encha uma seringa de 1 cc com 100 μL de 10 mg/kg 155 kDa Dextran-tetrametilrodamina (TMR) ou pontos quânticos.
  5. Preparação do rato para a imagem latente
    1. Anestesie o mouse em uma gaiola embaixo (~ 1 pé abaixo) uma lâmpada de calor usando 4%-5% isoflurano misturado com 100% de oxigênio definido para um fluxo de 1,5-2 L por min.
    2. Gire sobre a lâmpada de calor sobre a área de funcionamento cirúrgica. Esta etapa é crítica para manter a temperatura corporal fisiológica do núcleo do rato durante a cirurgia.
    3. Coloc o rato a lâmpada de calor e abaixe a anestesia a 2%-3% para a duração da cirurgia.
      Nota: Certifique-se de manter a lâmpada de calor a uma distância segura (~ 1 pé) longe do rato para evitar o superaquecimento.
    4. Coloc a pomada oftálmica nos olhos do rato para impedir a secagem dos olhos e da cegueira.
    5. Teste que o mouse é anestesiado realizando teste de pinça de dedo. Se o animal se retira, aumente a dosagem de isoflurano em 1% e reteste em 1-2 min.
    6. Insira o cateter da veia cauda no ponto mais distal na cauda possível.
    7. Afixe o cateter da veia de cauda à cauda com uma parte pequena de fita do laboratório que envolva em torno da cauda e varas à agulha para assegurá-la não começ desalojada.
    8. Injetar 50 μL por h de PBS através do cateter de veia cauda para proporcionar hidratação adequada. É fundamental evitar injetar muito fluido (não mais de 200 μL por h) ou quaisquer bolhas no cateter, pois isso pode ser fatal para o mouse.
    9. Retire o cabelo no abdômen sobre as 4ª e 5ª glândulas mamárias usando creme depilatório.
    10. Limpe a pele com Betadine e deixe a pele secar.
    11. Faça uma incisão longitudinal do midline que começa imediatamente superior aos genitais e carreg a incisão até o nível do aspecto superior da glândula mamária 4th .
    12. Transportar a incisão transversal ao aspecto superior da 4ª glândula mamária. É fundamental evitar comprometer o suprimento sanguíneo neste momento.
    13. Dissecar a almofada gorda mamária fora do peritônio que cria uma aleta do tecido usando o fórceps e as tesouras estéreis.
      Nota: a imagem da aleta da pele é suscetível aos artefatos significativos do movimento e à desidratação do tecido. Estes são evitados, como descrito anteriormente43,44, afixando uma peça rígida de borracha atrás para o lado da pele do retalho (para endureçar o tecido mole e isolá-lo do resto do corpo) e, em seguida, colocando o tumor em uma imagem superficial janela para preservar a hidratação. Isto é crítico para a imagem latente estável porque o tumor e o tecido circunvizinho neste ajuste são muito complacentes.
    14. Estabilize a aleta da pele afixando (com colagem do cianoacrilato) uma parte pequena de borracha rígida que mede 2 cm x 2 cm ao lado da pele da aleta. O tumor deve estar no centro da área a ser estabilizada pela borracha.
    15. Mantenha o tecido exposto hidratado com gotas de PBS.
    16. Aplique uma película pequena do cianoacrilato à borda exterior do frame de janela feito encomenda da imagem latente.
    17. Aplique uma pequena gota de PBS (~ 10 – 20 μL) ao centro do vidro da tampa.
    18. Seque o tecido da aba circundante com uma limpeza de laboratório. É crítico certificar-se de que o cianoacrilato no frame de janela não entra o contato com o PBS no vidro, porque este pode fazer com que o cianoacrilato polimerize e ajuste prematuramente.
    19. Afixe a janela pequena da imagem latente à aleta do tecido com o tumor no centro da abertura desobstruída.
    20. Retire a caixa de aquecimento do palco.
    21. Transfira o cateter anestesiado do rato e da veia da cauda à fase do microscópio. Use extrema cautela para garantir que o cateter da veia cauda não caia.
    22. Coloque o mouse no palco na posição prona.
    23. Coloc o cone do nariz do isoflurano sobre o focinho para assegurar a manutenção da anestesia.
    24. Insira a janela no furo na placa de estágio x-y personalizada.
    25. Coloque a caixa de aquecimento de volta para o palco para manter uma temperatura fisiológica.
    26. Monitore os sinais vitais do animal anexando uma sonda de oxímetro de pulso via sensor de clipe para a pata traseira.
    27. Diminua lentamente o isoflurano para 0,5%-1% para manter o fluxo sanguíneo adequado e evite anestesiando o mouse.
  6. Imagiologia intravital
    Nota: a imagem latente que nós descrevemos nesta seção foi executada em um microscópio do multifotônica do dois-laser costume-construído que seja descrito previamente5,39,45. Resumidamente, um laser femtossegundo é usado para gerar 90 femtossegundo pulsado luz laser centrada em 880 Nm. A luz da fluorescência é detectada com três dos quatro detectores simultaneamente adquirindo (azul = 447/60, verde = 520/65, e 580/60 vermelho; comprimento de onda/largura de banda centrais) após a separação da luz da excitação por um dichroic (chroma, Z720DCXXR). O suporte do microscópio contem uma lente objetiva de trabalho longa da distância de funcionamento (2 milímetros) de 25x, de 1, 5 NA (abertura numérica). É importante notar que, enquanto nós usamos um microscópio personalizado-construído, o protocolo descrito abaixo pode ser realizado em qualquer microscópio multifóton comercialmente disponível também.
    1. Coloc uma gota da água destilada entre o 25x, o objetivo do microscópio de 1, 5 NA e o vidro da tampa da janela para fazer o contato ótico.
    2. Use a ocular do microscópio para centrar-se sobre áreas com as pilhas fluorescentes do tumor perto da superfície da janela.
    3. Encontrar vasos sanguíneos fluindo e macrófagos rotulados. É crítico ter os vasos sanguíneos de fluxo para avaliar a dinâmica do vasculature.
    4. Mude o microscópio para o modo multifóton.
    5. Defina os limites superior e inferior de uma série z, que mede aproximadamente 50 μm.
      1. Defina o limite superior da série z usando o ajustador de foco para mover o objetivo para o local de início desejado, na posição mais superficial, e marcando essa posição como zero dentro do software clicando no botão superior da posição z.
      2. Defina o limite inferior da série z movendo o objetivo para a camada mais profunda (tipicamente 50-70 μm da parte superior para tumores menores) e clicando no botão inferior da posição z.
      3. Defina o tamanho da etapa z para 5 μm.
    6. Clique no botão do painel Time-Lapse e defina o intervalo de tempo entre as aquisições para pelo menos 10 s para fornecer tempo adequado para reabastecer a água acima da lente objetiva. Isto é feito manualmente com uma pipeta do aperto no objetivo durante o lapso de tempo longo.
    7. Retire a seringa com PBS no cateter da veia cauda e substitua-a por outra seringa contendo o 155 kDa Dextran-TMR (tetrametil rhodamina).
    8. Injete 100 μL de 155 kDa Dextran-TMR através do cateter de veia cauda.
    9. Após a injecção, substitua a seringa de TMR pela seringa PBS.
    10. Adquira uma imagem de lapso de tempo de pilha z clicando nos botões Z-Stack e Time-Lapse e, em seguida, clicando no botão de gravação.
    11. Injetar 50 μL de PBS a cada 30-45 min para manter a hidratação adequada do animal. Evite injetar mais de 200 μL no tempo, pois isso pode causar sobrecarga de fluido.
  7. Eutanásia
    1. Aumente o isoflurano para 5% e mantenha o animal abaixo de 5% de isoflurano com cone nasal no lugar até 30 s após a cessação das respirações.
    2. Retire o mouse do palco.
    3. Realize luxação cervical.
  8. Processamento de imagem
    1. Carregue todas as imagens no ImageJ e formate-as em um hyperstack de 5 dimensões (x, y, z, t e canal de cores).
    2. Execute a separação da sobreposição espectral (isto é: GFP e CFP) e eliminação da tração x-y dos hyperstacks usando métodos estabelecidos38.
    3. Use o ajuste de brilho e contraste para aumentar o nível de branco do canal sanguíneo para que o sinal de fundo fique visível.
    4. Para cada fatia z, Inspecione cuidadosamente cada filme para obter sinais de vazamento vascular transitório (um "Burst"). A execução dos filmes em taxas de quadros rápidas (40 fps) pode ajudar essa identificação.
    5. Uma vez que uma explosão foi identificada, retorne o brilho para este canal a um nível normal e recorte o hyperstack a esta região e z-fatia.

2. avaliação do dextrano extravascular utilizando análise de tecido fixo

  1. Preparação do tumor e da amostra
    Nota: a parte 2 deste protocolo supõe que os tumores da mama estiveram colhidos de um modelo transplantação orthotopic do do rato da transplantação do carcinoma do peito (isto é o MMTV-pymt). Este modelo poderia ser o mesmo que o descrito na parte 1 doSt do protocolo, embora os tumores fluorescently-etiquetados não sejam necessários neste momento.
    1. Após a terminação do pipeline experimental (ou seja, tratamentos medicamentoso, etc.), realize uma injeção de cauda-vaidosa de 100 μL de 10 mg/mL 155 kDa Dextran-tetrametil rhodamina, 1 h antes de sacrificar os camundongos.
    2. Sacrifique os camundongos e colha os tumores de mama.
    3. Corrija os tumores em formalina a 10% para 48-72 h e prossiga para a incorporação de parafina.
    4. Usando um micrótomo, corte duas lâminas seqüenciais de 5 μm de espessura dos tecidos de parafina encaixados (FFPE) fixos em formalina. Um slide é usado para manchar o Dextran, enquanto o outro será usado para executar TMEM Triple-IHC, para referência.
      Nota: o protocolo TMEM Triple-immunohistochemistry foi descrito em outra parte 10.
  2. SE a coloração e a digitalização para a primeira das duas secções sequenciais
    1. Envie slides para um protocolo de paraffinização padrão. Isso inclui duas imersões subsequentes em xileno (10 min cada), seguidas de desidratação em soluções de álcool serialmente diluídas (100%, 95%, 70% e 50% EtOH em H2O por 2 min cada imersão).
    2. Realize a recuperação do antígeno pelo aquecimento (perto do ponto de ebulição) as seções submersas no citrato (pH 6,0-ajustado) por 20 minutos.
    3. Deixe as amostras esfriar a temperatura ambiente para 15-20 min e depois lave em PBS 3x por 2 min cada lavagem.
    4. Bloco de 60-90 min em tampão de bloqueio (10% FBS; 1% BSA; 0, 25% gelatina de pele de peixe; 0, 5% PBST, ou seja, PBS com 0, 5% Tween-20).
    5. Incubar amostras com uma mistura de anticorpos primários de ratos e coelhos que visam Endomucin e TMR, respectivamente, e depois lave em PBST 3x,2 min cada.
    6. Incubar amostras com uma mistura de anticorpos secundários do burro de encontro ao rato IgG (conjugado a Alexa-647) e ao coelho IgG (conjugado a Alexa-488), e lave então em PBST 3x 2 minutos cada um.
    7. Realize uma coloração DAPI de rotina (ou seja, imersão em solução DAPI por 5-6 min), monte os slides usando um meio de montagem "Hard" sem glicerol e armazene em um local escuro até a digitalização.
    8. Para obter resultados ideais, digitalize os slides em um scanner de slides inteiro digital.
  3. Análise de imagem
    1. Capture 10 campos de alta potência (HPFs) por caso, usando qualquer software adequado para patologia digital.
    2. Salve os canais Endomucin (vermelho) e TMR (verde) separadamente como TIFF.
    3. Usando o ImageJ, carregue os arquivos TIFF e converta-os em imagens de 8 bits.
    4. Limite as imagens de 8 bits para o nível do controle negativo, e gerar duas imagens binarizadas, mostrando o endomucin e TMR "máscaras".
    5. A partir das ferramentas binárias , selecione preencher furos na máscara de endomucin.
    6. Gere e guarde as seguintes cinco regiões de interesse: 1) a imagem de dextrano limitados como "o ROI de dextrano" (ROI1), 2) a imagem limitados do endomucin como o "ROI vascular" (ROI2), 3) a imagem invertida do endomucin como "ROI extravascular" (ROI3), 4) o interseção " ROI extravascular "e" Dextran ROI "imagem (ROI1 ∩ ROI3) como" ROI Dextran extravascular "(ROI4), e 5) toda a imagem como" ROI tumoral "(ROI5).
    7. Divida a área ROI4 pela área ROI5 e multiplique por 100 para gerar a área de porcentagem que o dextrano extravascular cobre em todo o tumor.
    8. Repita o processo para 10-20 HPFs por caso (dependendo da disponibilidade do tecido) e gere uma média de Dextran extravascular (% área) para cada caso.

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Representative Results

Os procedimentos experimentais descritos neste artigo do protocolo são resumidos brevemente e ilustrados na Figura 1A-C.

Para medir a permeabilidade vascular mediada por TMEM ("atividade de ruptura") e reduzir o ruído experimental de outros modos de permeabilidade vascular (isto é, transcelular e paracelular, como explicado na introdução), realizamos intravenoso (i.v.) injeção de sondas de alto peso molecular, tais como 155 kDa Dextran, conjugados à tetrametil rhodamina. O dextranos de menor peso molecular não distingue os três modos de permeabilidade vascular. Nossa experiência prévia indicou que a circulação sistemática de 155 kDa TMR-Dextran etiquetou eficientemente o vasculatura de ambos os tecidos normais, tais como a glândula mamária e os pulmões (Figura 2a, B), assim como de tecidos neoplásticos, tais como câncer de mama primário e metástases de câncer de mama em pulmões (Figura 2C, D). Como confirmado também por estudos anteriores5,46, 155 kDa TMR-Dextran é assim uma ponta de prova apropriada para medir o "estouro" em locais preliminares e secundários do tumor. Um exemplo característico de atividade de pico de ruptura (área amarela pontilhada), usando imagens intravitais multifótons em um tumor primário de mama MMTV-PYMT é ilustrado como uma série de fotos ainda (Figura 3a). A atividade estourando foi anotada sempre em colaboração com uma entrada de tmem (círculo branco pontilhado), caracterizada pela justaposição espacial de uma pilha do tumor de Dendra2+ um CFP+ o macrófago e o endotélio (Figura 3a). Como mencionado, cada entrada de TMEM consiste em um macrófago perivascular, em um mena que overexpressando a pilha do tumor, e uma pilha endothelial, tudo no contato físico direto um com o Otras. Quando Mena não foi etiquetado explicitamente nos modelos do rato usados nestas experiências, tem-se mostrado previamente para tornar-se overexpressado na carcinoma atrasada do PyMT do estágio47. Isto simplifica a identificação de portas de TMEM e elimina a necessidade de etiquetar explicitamente Mena nas pilhas do tumor.

Para avaliar a permeabilidade vascular dependente de TMEM na análise fixa do tecido, nós executamos o procedimento descrito neste protocolo nos ratos que foram transplantados com os pedaços do tumor tomados dos ratos doadores velhos de 14 semanas MMTV-PyMT. Quando os ratos alcançaram um tamanho apropriado do tumor, receberam uma única dose de i.v. de 155-kDa TMR-Dextran, como descrito na parte 2 deste protocolo, e foram sacrificados após 1 hora. Os tecidos tumorais foram coletados e submetidos à análise de IF. O sinal fluorescente do endomucin foi usado como uma máscara da exclusão ao sinal fluorescente do dextrano, permitindo a discriminação entre altamente-permeável e baixo, ou não-permeável, vasos sanguíneos (Figura 3B). Como descrito anteriormente em Karagiannis et al.48, uma lâmina seqüencial também foi corada com a mancha tripla tmem previamente estabelecida e alinhada com o slide If correspondente. Usando essa abordagem, confirmou-se que os vasos sanguíneos altamente permeáveis dentro do tecido tumoral de mama têm pelo menos uma entrada TMEM associada (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1 . Resumo do procedimento. (A) dendra-2 rotulado carcinoma invasivo da mama (verde) retirado de um animal transgênico [FVB/N-TG (MMTV-pymt) Mul-TG (MMTV-Icre) JWP-TG (loxp-Stop-Loxp-Pdendra2) JWP] e cortado em pedaços pequenos. Uma peça é então ortotópica transplantada em outro animal transgênico cujos macrófagos foram rotulados por proteína fluorescente ciano (ciano) [FVB/N-TG (CFMs-GAL4-VP16)-(uas-ecfp)]. O ortotópica transplantado ao tumor é permitido então crescer, depois do qual o rato é alocado ao braço apropriado do tratamento. (B) uma vez que o tratamento é terminado, o rato é tomado então para a imagem latente intravital. Uma vez anestesiado, uma cirurgia de retalho de pele é realizada, em seguida, estabilizada com um revestimento protetor de borracha. Uma janela rasa da imagem latente é afixada então sobre o tumor. Finalmente, o rato é coloc então na fase do microscópio onde a janela cabe na placa feito-à-medida do estágio e as imagens podem então ser adquiridas. (C) alternativamente, o rato de a é administrado dextrano de alto peso molecular e sacrificado após 1 hora. O tumor é então removido, fixo, e processado para a incorporação de parafina. Secções do tecido são cortadas, manchadas para TMEM em IHC e dextrano e vasos em se, e digitalizados em um scanner de slides digitais inteiras. Finalmente, as imagens das duas varreduras são alinhadas e os campos de visão individuais são escolhidos para análise e quantificação do vazamento vascular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Visualização de TMR-Dextran etiquetou o vasculatura em tecidos saudáveis e doentes. (A) imagem de uma glândula mamária em desenvolvimento saudável dentro de um animal transgênico cuja vasculatura é rotulada por TMR-Dextran (vermelho), epitélio ductal mamário rotulado pela proteína fluorescente dendra-2 (verde) e macrófagos rotulados por um ciano proteína fluorescente (azul) [FVB/N-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP-TG (CFMs-GAL4-VP16)-(UAS-eCFP)]. (B) tecido pulmonar saudável visualizado através de uma janela de imagem pulmonar dentro de um rato cuja vasculatura é rotulada por TMR-Dextran (vermelho). Azul = SHG de fibras colágenas. (C) Dendra2 carcinoma ductal invasivo, retirado de um animal transgênico [FVB/N-TG (MMTV-pymt) MULXTG (MMTV-Icre) JWP-TG (loxp-Stop-Loxp-Pdendra2) JWP] e transplantado orthotopicamente em outro animal transgênico cujo os macrófagos são rotulados por proteína fluorescente ciano (azul) [FVB/N-TG (CFMs-GAL4-VP16)-(UAS-eCFP) e vasos rotulados com TMR-Dextran (vermelho). (D) metástases pulmonares oito dias após a injeção intravenosa de células tumorais (E0771; rotuladas pelo trevo da proteína fluorescente) em um animal transgênico cujos macrófagos são rotulados por proteína fluorescente ciano (ciano) [FVB/N-TG (CFMs-GAL4-VP16)-(uas-ecfp) ] e vasculatura rotulada por TMR-Dextran (vermelho). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Visualização da permeabilidade vascular mediada por TMEM usando imagem intravital e análise de tecido fixo. (A) Stills de um filme intravital da imagem latente do tempo-lapsed da rotulagem do TMR-Dextran de 155-kDa de embarcações neo-Angiogenic (vermelhas) dentro de um dendra-2 etiquetado carcinoma invasor do peito (verde) tomado de um animal transgênicas [FVB/N-TG (MMTV-pymt) Mul- (MMTV-iCre) JWP-TG (loxp-Stop-loxp-Pdendra2) JWP] e ortotópica transplantado em outro animal transgênico onde os macrófagos foram rotulados por proteína fluorescente ciano (ciano) [FVB/N-TG (CFMs-GAL4-VP16)-(uas-ecfp)]. A linha amarela pontilhada denota o esboço da área vascular transiente do escapamento antes (t = 0 '), durante (t = 17 ') e após (t = 52 ') o evento do escapamento (estourando). O círculo branco tracejado aponta para uma entrada TMEM, como capturado em imagens ao vivo. (B) imunofluorescência multicanal de endomucin (primeira coluna), 155-kDa dextrano-TMR (segunda coluna), sua imagem mesclada junto com DAPI (terceira coluna), o vaso sanguíneo limitados e as máscaras extravascular dextrano (quarta coluna), e o seção sequencial correspondente do TMEM IHC (quinta coluna) em camundongos MMTV-PyMT. Linha superior: perfil vascular afastado de TMEM, aparecendo como um perfil vascular "não-Leaky". Linha inferior: perfil vascular associado a TMEM, aparecendo como um perfil vascular "Leaky". Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, nós esboçamos dois protocolos que podem ser aplicados para visualizar e quantificar um tipo específico de permeabilidade vascular que esteja atual em entradas de TMEM e esteja associado com o rompimento de junções vasculares apertadas e dos aderens. Este tipo de permeabilidade vascular é transiente e controlado pelo complexo tripartida da pilha de tmem, como explicado acima de5. A capacidade de identificar e quantificar a permeabilidade vascular associada à TMEM é crucial para a avaliação de um microambiente de células cancerosas pró-metastáticas, bem como para estudos pré-clínicos que examinem o efeito das terapias citotóxicas convencionais no tumor microambiente, bem como o potencial antimetastático de terapias direcionadas e não direcionadas. Importante, Nós demonstramos aqui que esta avaliação pode ser feita pela imagem latente intravital ou pela imunofluorescência em tecidos fixos. Ambas as abordagens têm suas vantagens e desvantagens. A imagem latente intravital permite a visualização direta do processo dinâmico da permeabilidade vascular, mas exige o equipamento especializado e o treinamento. Por outro lado, a imunofluorescência realizada em tecidos fixos oferece apenas uma imagem estática, mas pode ser rotineiramente realizada na maioria dos laboratórios.

Os pacientes com câncer são comumente tratados com alguma forma de terapia sistêmica, e o sucesso do tratamento sistêmico geralmente é avaliado pela avaliação dos parâmetros relacionados à sobrevida de células cancerosas, como apoptose, proliferação ou tamanho bruto do tumor. No entanto, é igualmente importante compreender como essas terapias sistêmicas afetam a disseminação de células cancerosas, uma vez que a maior parte da mortalidade relacionada ao câncer ocorre devido à metástase, um processo que envolve tanto a proliferação de células cancerosas como as células cancerosas disseminação1. Por exemplo, estudos recentes demonstraram que a quimioterapia pode induzir um aumento significativo na densidade de portas de tmem em camundongo e câncer de mama humano48,49. Além disso, foi demonstrado que a quimioterapia induz a atividade de TMEM e resulta na disseminação hematógena de células cancerosas, aumento das células cancerosas circulantes e aumento da metástase pulmonar48. O aumento induzido pela quimioterapia na atividade de tmem pode ser bloqueado pela administração sistêmica da medicina que inibe a função TIE2 e, portanto, a atividade de tmem, chamada rebastinib14,48. Assim, os protocolos descritos aqui podem oferecer medidas valiosas do valor-limite para o efeito de vários tratamentos sistemáticos na atividade de TMEM com a comparação de tratados às coortes não-tratadas dos ratos.

Nos últimos anos, o conceito de terapia antiangiogênica no câncer foi revisitado, sugerindo que uma estratégia de "normalização" vascular (ou seja, a reconstituição transitória da estrutura anormal e função dos vasos sanguíneos), pode ser preferível à segmentação vasos sanguíneos para a destruição, como faz o neovasculature mais eficaz para a entrega da droga50,51,52,53,54. Em vista dessa hipótese emergente, outros grupos também desenvolveram ensaios para avaliar a permeabilidade vascular e para testar a eficiência das estratégias de normalização vascular55. Deve-se mencionar que, em princípio, esses métodos são utilizados para avaliar os modos independentes de permeabilidade vascular de TMEM. Portanto, a seleção do ensaio de permeabilidade vascular mais adequada depende do escopo de um estudo, e os pesquisadores devem garantir que compreendam a aplicabilidade de cada um dos ensaios de permeabilidade vascular publicados, antes de aplicá-los à sua Estudos.

Como mencionado acima, cada um dos dois métodos descritos aqui tem algumas vantagens sobre o outro. Por exemplo, a medição da "permeabilidade à ruptura" in vivo oferece informações cinéticas valiosas, mas como o estouro é um evento raro, sessões de imagens prolongadas de várias horas podem ser necessárias para que sejam capazes de obter dados suficientes. Além, a imagem latente intravital exige o equipamento especializado que não pode disponível a todos os investigadores. Por outro lado, a avaliação da atividade de TMEM em tecidos fixos é relativamente fácil de executar e requer apenas equipamento de laboratório padrão. Além disso, a análise da atividade de TMEM em tecidos fixos é mais fácil de interpretar, mas carece de informações cinéticas. Além disso, a análise fixa do tecido é menos específica, uma vez que pode capturar vazamento cumulativo de dextrano ao longo do tempo de permeabilidade vascular transcelular e paracelular de endothelia intacta, ou mesmo um evento de vazamento súbita devido a lesão vascular espontânea. Assim, a utilização sinergística dos dois métodos tornaria a interpretação da permeabilidade vascular mediada por TMEM mais específica e mais sensível. Embora não tenhamos testado explicitamente outras aplicações das técnicas aqui apresentadas, elas podem revelar-se úteis para investigar a permeabilidade induzida por vasos, por exemplo, por infecção ou por terapias farmacêuticas.

Em síntese, a mensuração da permeabilidade vascular associada à TMEM, descrita por duas metodologias independentes, fornece ferramentas úteis para a avaliação do microambiente tumoral pró-metastático e sua atividade associada à TMEM, podendo ser usada para alguns medida por qualquer laboratório. Estes métodos são particularmente úteis na avaliação pré-clínica do efeito de terapias sistêmicas na disseminação de células cancerosas. Além, podem ser usados para avaliar o efeito dos agentes que podem obstruir a atividade quimioterapia-induzida de TMEM, e por último, estes métodos podem ser usados para avaliar a melhor terapia de combinação que precede a fase mim testes pacientes.

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Disclosures

Os autores não divulgam conflitos de interesse.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à unidade de imagem analítica (AIF) no Albert Einstein College of Medicine para suporte de imagem. Este trabalho foi apoiado por subsídios do NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 e CA216248), o SIG 1S10OD019961-01, o centro de Biophotonics Gruss-Lipper e seu programa de imagem integrada, e Ruth L. Kirschstein de Montefiore T32 capacitação de cirurgiões para o estudo do microambiente tumoral (CA200561).

A GSK co-escreveu o manuscrito, realizou imagens para a figura 1C e 3B, desenvolveu protocolo de análise de tecido fixo, analisou e interpretou todos os dados; O JMP co-escreveu o manuscrito e realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 1B, 2C e 3a; LB & AC realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 2B; O RJ realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 2a; JSC co-escreveu o manuscrito e analisou e interpretou todos os dados; Mho co-escreveu o manuscrito e analisou e interpretou todos os dados; e de executou a cirurgia e a imagem latente intravital para a Figura 2D, co-escreveu o manuscrito, desenvolveu a análise fixa do tecido e os protocolos intravital da imagem latente, e analisou e interpretou todos os dados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

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