Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Bedömning tumör mikromiljö av metastaser Doorway-medierad vaskulär permeabilitet i samband med Cancer Cell spridning med Intravital avbildning och fast vävnads analys

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59633
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Summary

Vi beskriver två metoder för att bedöma övergående vaskulär permeabilitet i samband med tumör mikromiljö av metastaser (TMEM) dörröppning funktion och cancer cell intravasation med hjälp av intravenös injektion av hög molekylvikt (155 kDa) dextran hos möss. Metoderna omfattar intravital avbildning i levande djur och fast vävnads analys med hjälp av immunofluorescens.

Abstract

Den vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet är metastaser, en process som kräver spridning av cancerceller från den primära tumören till sekundära platser. Nyligen, vi fastställt att Cancer Cell spridning i primär bröstcancer och vid metastaserande platser i lungorna sker endast vid dörröppningar kallas tumör mikromiljö av metastaser (TMEM). Tmem dörröppningen numrerar är prognostiska för avlägsen upprepning av metastaserad sjukdom i bröstcancer tålmodig. TMEM dörröppningar består av en cancer cell som över-uttrycker aktin reglerande proteinet Mena i direkt kontakt med en perivaskulär, proangiogen makrofage som uttrycker höga halter av TIE2 och VEGF, där båda dessa celler är tätt bundna till en blod kärl endotelcell. Cancerceller kan intravasate genom TMEM dörröppningar på grund av övergående vaskulär permeabilitet orkestreras av den gemensamma aktiviteten av TMEM-associerade makrofage och TMEM-associerade Mena-uttrycker cancer cell. I detta manuskript beskriver vi två metoder för bedömning av TMEM-medierad övergående vaskulär permeabilitet: intravital avbildning och fast vävnads immunofluorescens. Även om båda metoderna har sina fördelar och nackdelar, kombinera de två kan ge den mest kompletta analyser av tmem-medierad vaskulär permeabilitet samt kontrollerade förutsättningar för tmem funktion. Eftersom metastaserande process i bröstcancer, och möjligen andra typer av cancer, innebär Cancer Cell spridning via TMEM dörröppningar, är det viktigt att anställa väl etablerade metoder för analys av TMEM dörröppningen verksamhet. De två metoder som beskrivs här ger en övergripande strategi för analys av TMEM dörröppning aktivitet, antingen i naiva eller farmakologiskt behandlade djur, vilket är av största vikt för prekliniska prövningar av agenter som förhindrar cancer cell spridning via TMEM.

Introduction

Senaste framstegen i vår förståelse av cancermetastaser har upptäckt att epitelial till mesenkymala övergång (EMT) och induktion av en flytt/invasiv cancer cell subpopulation är inte, i sig, tillräckligt för hematogen spridning 1. faktum är att det tidigare trodde att och målriktad cancerceller intravasate genom hela cancer-associerade endotelet som tumören kärlnybildning kännetecknas ofta av låga pericytbiologi täckning, och som sådan, är mycket permeabel och instabilt2,3,4. Även om mycket suggestiva av defekta funktioner inom tumören, vaskulära modifieringar under carcinogenes ger inte bevis i sig att tumörceller kan tränga igenom blodkärlen lätt och på ett okontrollerat sätt. Insikter från intravital Imaging (IVI) studier, där tumörceller är fluorescerande-märkta och kärlsystemet är märkt via intravenös injektion av fluorescerande sonder (såsom dextran eller kvantprickar), visar att, medan tumör fartyg är jämnt permeabel till låg molekylvikt dextrans (e.g. 70 kD), hög molekylvikt dextrans (155 kD) och tumörceller kan korsa endotelet endast på specialiserade platser för intravasation som företrädesvis ligger vid vaskulär gren punkt5, 6 , 7. immunohistokemiska (IHC) analyser med hjälp av djurmodeller och Human patient-härledda material har visat att dessa platser är "dörröppningar" som specialiserat sig på att reglera vaskulär permeabilitet, lokalt och transitivt, vilket ger ett kort fönster av möjlighet för flyttande/invasiva cancerceller att komma in i cirkulationen. Dessa dörröppningar kallas "tumör mikromiljö av metastaser" eller "tmem", och, ganska Expectedly, korrelerar deras densitet med en ökad risk att utveckla metastaserad sjukdom hos patienter med bröstcancer8,9, 10.

Varje TMEM dörröppning består av tre olika typer av celler: en perivaskulär makrofage, en tumör cell över-uttrycker aktin-reglerande protein däggdjur aktiverat (MENA), och en endotelcell, alla i direkt fysisk kontakt med varandra1, 5,9,10,11,12,13. Den viktigaste händelsen för funktionen av TMEM som en intravasation dörröppning är lokaliserad frisättning av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) på det underliggande kärlet av perivaskulär makrofage14. VEGF kan störa homotypiska korsningar mellan endotelceller15,16,17,18,19, ett fenomen som resulterar i övergående vaskulära läckage, även känd som "sprängning" permeabilitet enligt IVI-studierna 5. Tmem makrofager har visat sig uttrycka tyrosinkinasreceptorn TIE2, vilket krävs för VEGF-medierad tmem funktion och homing av dessa makrofager till perivaskulär nisch5,20,21 , 22. Förutom att reglera spridningen av cancerceller och metastaser har TIE2+ makrofager visats vara centrala regulatorer av tumör angiogenes21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Som sådan, TIE2+ makrofager representerar en kritisk beståndsdel i tumören mikromiljö och huvud regulator av metastaserad kaskad.

För att bättre konceptualisera tmem-medierad vaskulär permeabilitet (dvs "sprängning"), är det mycket viktigt att skilja den från andra former av vaskulär permeabilitet som inte är förknippade med upplösningen av endotelceller cell-cell korsningar. I en intakt endotel (en vars snäva och anhängare korsningar inte störs), det finns tre huvudsakliga typer av vaskulär permeabilitet: (a) pinocytosis, som kan, eller inte kan, kopplas till transcytosis av det intagna materialet; b) transport av material genom endotelfenestrae. och (c) transport av material genom den paracellulära vägen, som regleras av endoteliala täta korsningar15,16,17,18,19,32 , 33 , 34även avreglerad i många tumörer, de ovan nämnda lägena av vaskulär permeabilitet har beskrivits främst i samband med normal vävnadfysiologi och homeostas, vars ytterligheter är vävnader med antingen begränsad permeabilitet ( t. ex., blod-hjärnbarriären, blod-testis barriär), eller riklig permeabilitet (t. ex., Fenestrated kapillärer av njure glomerulär apparat)34,35,36,37.

Använda multiphoton intravital avbildning och multiplexade immunofluorescensmikroskopi, kan vi skilja mellan tmem-medierad vaskulär permeabilitet ("sprängning") och andra former av vaskulär permeabilitet i brösttumörer. För att uppnå detta, vi utför en enda intravenös injektion av en hög molekylvikt, Fluorescent-märkt sond i möss. Spontana sprängnings händelser kan sedan fångas med intravital avbildning i levande möss; Alternativt kan extravasering av sonden kvantifieras genom samtidig lokalisering studier med blodkärl (t. ex. CD31+ eller Endomucin+) och tmem dörröppningar med immunofluorescensmikroskopi. De protokoll som presenteras här beskriver båda dessa tekniker, som kan användas antingen självständigt eller tillsammans med varandra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment som använder levande djur måste utföras i enlighet med djur användnings-och skötsel riktlinjer och föreskrifter. De förfaranden som beskrivs i denna studie genomfördes i enlighet med National Institutes of Health förordningar om vård och användning av försöksdjur och med godkännande av Albert Einstein College of Medicine djuromsorg och användning Kommittén (IACUC).

1. utvärdering av "sprudlande permeabilitet" med levande djur avbildning

  1. Transplantation av uterustransplantat brösttumörer till mus värdar med fluorescerande makrofager
    1. Generera bitar av tumör vävnad som lämpar sig för transplantation.
      1. Generera fluorescently-märkta tumörer i mus bröstcancer modeller genom att korsa den spontana, autoktona, genetiskt modifierade mus bröstcancer modell MMTV-PyMT möss med transgena möss uttrycker fluorescerande reportrar38, 39 [t. ex., förstärkt grönt fluorescerande protein (egfp), förstärkt Cyan fluorescerande protein (ecfp), eller Dendra2].
      2. Låt MMTV-PyMT-möss med fluorescerande märkta tumörer växa till en storlek som inte är större än 2 cm (cirka 10-12 veckors ålder).
      3. Euthanize tumören bär MMTV-PyMT möss genom att placera dem i en kammare med 5% isofluran tills 30 sekunder efter alla respirationer stopp.
      4. Utför en cervikal dislokation.
      5. Ta bort hår från den euthanized musens buk med hjälp av en topikal hårborttagnings kräm.
      6. Placera en petriskål med DMEM/F12 cellodlingsmedium på isen.
      7. Placera musen och petriskål på is i rök huven.
      8. Sanitize musens buk med 70% etylalkohol.
      9. Använda sterila handskar och kirurgiska verktyg (steriliserad sax, tång, och blad) ta bort tumörer och placera dem i petriskål.
      10. Skär upp tumören i små bitar (~ 2 mm x 2 mm x 2mm i storlek), kasta alla nekrotiska portioner, medan de är i petriskål.
    2. Transplantera tumör bitarna i mottagar värdar.
      1. Höj möss med genetiskt modifierade fluorescently-märkta makrofager, t. ex., MacGreen40 eller macblue 41 möss (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ecfp)
      2. Låt FVB-möss med fluorescerande märkta makrofager växa till en ålder av ~ 4-6 veckor).
      3. Anesthetize FVB-möss med fluorescerande märkta makrofager i en kammare med 5% isofluran med syre som bärar gas.
      4. Minska anestesi till ~ 3% isofluran och tillämpa oftalmisk salva till ögonen på musen för att förhindra torkning.
      5. Ta bort hår från över 4th bröstkörteln av musen.
      6. Rengör huden med Betadine. Det är viktigt att bibehålla sterila förhållanden under resten av förfarandet. Detta inkluderar användning av steriliserade instrument och reagenser.
      7. Gör ett litet snitt ~ 2-3 mm bara sämre än 4: e nippel.
      8. Dissekera tills bröst fettet pad är utsatt.
      9. Ta en tumör bit från petriskål och päls i konstgjord extracellulär matris.
      10. Transplantations tumörer under 4: e mjölkfett pad.
      11. Stäng snittet med hjälp av cyanoakrylatlim.
      12. Kontinuerligt övervaka djuret tills det helt återhämtar sig från anestesi och kan upprätthålla sternala recumbency. Också, inte att återvända djuret till företaget av andra djur tills full återhämtning.
      13. För att minimera infektioner, tillsätt 1 mL 100 mg/mL enrofloxacin antibiotikum till djurets dricksvatten flaska (8 fl oz).
      14. Tillåt tumörer att växa tills påtaglig (~ 5 mm; ~ 4 veckor).
      15. Beroende på experimentet, fördela möss i behandlingsgrupper, och utföra motsvarande behandlingar, om tillämpligt.
  2. Inställning för intravital avbildning
    1. Slå på mikroskopet två-Photon laser och detektorer.
    2. Slå på värmelådan och förvärmning mikroskopet x-y skede.
    3. Placera den skräddarsydda etappen infoga42 i x-y scenen.
  3. Beredning av bildbehandlings fönster
    1. Innan du ställer in för avbildning, Autoklavera den skräddarsydda cirkulär Imaging fönsterram42.
    2. Använd en pipett eller en insulinspruta för att placera ett tunt lager cyanoakrylatlim till fönsterramen och fästa på plats ett 8 mm cirkulärt täckglas.
      Anmärkning: 1) det är viktigt att undvika att få rester på den genomskinliga bländaren på omslags glaset. 2) det är viktigt att fästa täckglaset på fönsterramen minst 1 h före användning för avbildning.
    3. Torka försiktigt rent överflödigt cyanoakrylat på täckglasets genomskinliga bländare med hjälp av ett laboratorium torka fuktat med en liten mängd aceton.
  4. Beredning av svans venkateter för administrering av vätskor och fluorescerande färgämnen vid avbildning
    1. Skär en 30 cm bit polyeten slangar för att konstruera en svans venkateter.
    2. Ta loss nåldelen av en 30 G nål från dess Luerkona genom att försiktigt böja nålen fram och tillbaka tills den bryts.
      Obs: nålen ska hållas nära Luerkona och inte nålspetsen. Detta kan utföras med tång eller pinps för att greppa nålen för att förhindra nålstick skada.
    3. Sätt in den trubbiga änden av nålen i ena änden av polyeten slangen.
    4. Sätt i den vassa änden av en annan 30 G nål, hålla sin Luer Kona fäst, till den motsatta änden av slangen.
    5. Fyll en 1 cc spruta med fosfatbuffrad saltlösning, bifoga den till Luer taper av den monterade katetern, och spola svansen venkateter att se till att det inte finns några luftbubblor i systemet.
    6. För vaskulär märkning, Fyll en 1 cc spruta med 100 μL av 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) eller kvantprickar.
  5. Beredning av mus för avbildning
    1. Anesthetize musen i en bur under (~ 1 fot nedan) en värmelampa med 4%-5% isofluran blandat med 100% syre inställd på ett flöde av 1,5-2 L per minut.
    2. Slå på värmelampa över kirurgisk arbetsområde. Detta steg är avgörande för att bibehålla den centrala fysiologisk kroppstemperaturen hos musen under operationen.
    3. Placera musen under värmelampan och sänk anestesi till 2%-3% för varaktigheten av operationen.
      Obs: se till att hålla värmelampan på ett säkert avstånd (~ 1 fot) bort från musen för att undvika överhettning.
    4. Placera oftalmisk salva på musens ögon för att förhindra uttorkning av ögon och blindhet.
    5. Testa att musen är sövda genom att utföra tå-nypa test. Om djur drar tillbaka, öka dosen av isofluran med 1% och testa igen i 1-2 min.
    6. Sätt in svans venen kateter i den mest distala punkten på svansen möjligt.
    7. Anbringa svans venen kateter till svansen med en liten bit av Lab tejp som sveper runt svansen och pinnar till nålen för att försäkra att det inte blir disinges.
    8. Injicera 50 μL per timme PBS genom svans venen kateter för att ge adekvat hydrering. Det är viktigt att undvika att injicera för mycket vätska (inte mer än 200 μL per h) eller eventuella bubblor i katetern eftersom detta kan vara dödlig för musen.
    9. Ta bort hår på buken över 4: e och 5th mjölkkörtlar med hjälp av hårborttagnings kräm.
    10. Rengör huden med Betadine och låt huden torka.
    11. Gör en längsgående mittlinjen snitt börjar omedelbart överlägsen könsorganen och bära snittet upp till nivån på den överlägsna aspekten av 4: e bröstkörteln.
    12. Bär snittet tvärgående till den överlägsna aspekten av 4: e bröstkörteln. Det är viktigt att undvika att kompromissa med blodtillförseln på denna punkt.
    13. Dissekera mjölkfett pad från bukhinnan skapa en vävnad flik med hjälp av sterila Pink och sax.
      Anmärkning: hud flik Imaging är mottagliga för betydande rörelse artefakter och vävnad uttorkning. Dessa undviks, som beskrivits tidigare43,44, genom att fästa en styv bit gummi bakom huden sidan av luckan (för att stelna den mjuka vävnaden och isolera den från resten av kroppen) och sedan placera tumören i en grund avbildning för att bevara vätskebalansen. Detta är avgörande för stabil avbildning som tumören och omgivande vävnad i denna inställning är mycket kompatibla.
    14. Stabilisera huden luckan genom att fästa (med cyanoakrylat lim) en liten bit av styv gummi som mäter 2 cm x 2 cm till huden sidan av luckan. Tumören bör vara i mitten av området som stabiliseras av gummit.
    15. Håll exponerad vävnad hydrerad med droppar PBS.
    16. Applicera en liten film av cyanoakrylat till den yttre kanten av den skräddarsydda Imaging fönsterramen.
    17. Applicera en liten droppe PBS (~ 10 – 20 μL) i mitten av täckglaset.
    18. Torka omgivande flik vävnad med en laboratorie torka. Det är viktigt att se till att cyanoakrylat på fönsterramen inte kommer i kontakt med PBS på glaset, eftersom detta kan orsaka att cyanoakrylat att polymerisera och ställa i förtid.
    19. Fäst det lilla bildfönstret på vävnads luckan med tumören i mitten av den genomskinliga bländaren.
    20. Ta bort värmelådan från scenen.
    21. Överför den sövda musen och svans venen kateter till Mikroskop stadiet. Använd extrem försiktighet för att säkerställa att svans venen kateter inte faller ut.
    22. Placera musen på scenen i liggande läge.
    23. Placera näsan konen av isofluran över nos för att säkerställa underhåll av anestesi.
    24. Sätt in fönstret i hålet på den anpassade x-y-scenplattan.
    25. Placera värmelådan tillbaka på scenen för att bibehålla en fysiologisk temperatur.
    26. Övervaka djurets vitala tecken genom att fästa en pulsoximetersond via Clip sensor till baktass.
    27. Långsamt minska isofluran till 0.5%-1% för att bibehålla adekvat blodflöde och undvika över anesthetizing musen.
  6. Intravital avbildning
    Anmärkning: den avbildning som vi beskriver i detta avsnitt utfördes på ett specialbyggt tvålasermultifotonmikroskop som tidigare beskrivits5,39,45. Kortfattat, en femtosecondlaser laser används för att generera 90 femtosecondlaser pulsad laserljus centrerad vid 880 nm. Fluorescens ljus detekteras med tre av de fyra samtidigt förvärva detektorer (blå = 447/60, grön = 520/65, och röd 580/60; Central våglängd/bandbredd) efter separation från excitation ljuset av en Dichroic (Chroma, Z720DCXXR). Mikroskopstativet innehåller en 25x, 1,05 NA (numerisk bländare) lång arbetsavstånd (2 mm) objektiv. Det är viktigt att notera att även om vi har använt ett specialbyggt Mikroskop, kan protokollet som beskrivs nedan åstadkommas på alla kommersiellt tillgängliga multiphoton Mikroskop samt.
    1. Placera en droppe destillerat vatten mellan 25x, 1,05 NA Mikroskop mål och fönstrets täckglas för att göra optisk kontakt.
    2. Använd mikroskopet okular för att fokusera på områden med fluorescerande tumörceller nära ytan av fönstret.
    3. Hitta flödande blodkärl och märkta makrofager. Det är viktigt att ha flödande blodkärl för att bedöma dynamiken i vaskulaturen.
    4. Växla mikroskopet till multiphoton-läge.
    5. Ställ in de övre och undre gränserna för en z-serie, som mäter ca 50 μm.
      1. Ställ in den övre gränsen för z-serien med hjälp av fokuserings justeraren för att flytta målet till önskad startplats, på den mest ytliga positionen, och markera denna position som noll i programvaran genom att klicka på Z-positionen upptill .
      2. Ställ in den nedre gränsen för z-serien flytta målet till det djupaste skiktet (typiskt 50-70 μm från toppen för mindre tumörer) och klicka på Z position botten knappen.
      3. Ställ in z-stegstorleken på 5 μm.
    6. Klicka på tids fördröjnings panelens knapp och Ställ in tidsintervallet mellan förvärven till minst 10 s för att ge tillräckligt med tid för att fylla på vattnet ovanför objektivlinsen. Detta görs manuellt med en klämma pipett på målet under lång tid förflutit.
    7. Ta bort sprutan med PBS i svans venen kateter och ersätt den med en annan spruta som innehåller 155 kDa dextran-TMR (tetrametylrhodamine).
    8. Injicera 100 μL av 155 kDa dextran-TMR via svans venen kateter.
    9. Efter injektion, Byt ut TMR-sprutan mot PBS-sprutan.
    10. Förvärva en z-stack Time-lapse Imaging genom att klicka på Z-stacken och tid-lapse knappar, sedan klicka på inspelningsknappen.
    11. Injicera 50 μL PBS varje 30-45 min för att bibehålla adekvat hydrering av djuret. Undvik att injicera mer än 200 μL i tid eftersom detta kan orsaka vätskeöverbelastning.
  7. Dödshjälp
    1. Öka isofluran till 5% och hålla djuret under 5% isofluran med näsan kon på plats tills 30 s efter respirationer upphöra.
    2. Ta bort musen från scenen.
    3. Utför cervikal dislokation.
  8. Bildbehandling
    1. Ladda alla bilder i ImageJ och formatera dem till en 5 dimensionell hyperstack (x, y, z, t, och färgkanal).
    2. Utföra separation av spektralöverlappning (dvs.: GFP och CFP) och eliminering av x-y drift från hyperstackar med hjälp av etablerade metoder38.
    3. Använd justeringen ljusstyrka och kontrast för att öka den vita nivån i blod kanalen så att bakgrunds signalen blir synlig.
    4. För varje z-segment, inspektera varje film noggrant för tecken på övergående vaskulära läckage (en "explosion"). Köra filmer på snabb bildrutehastigheter (40 fps) kan hjälpa denna identifiering.
    5. När en burst har identifierats, returnera ljusstyrkan för den här kanalen till en normal nivå och beskär hyperstacken till den här regionen och z-slice.

2. utvärdering av extravaskulär dextran med hjälp av fast vävnads analys

  1. Tumör-och provberedning
    Obs: den 2nd del av detta protokoll förutsätter att brösttumörer har skördats från en ortotopisk transplantation musmodell av bröstcancer (dvs. mmtv-pymt). Denna modell kan vara densamma som den som beskrivs i den 1St del av protokollet, även fluorescerande-märkta tumörer är inte nödvändigt på denna punkt.
    1. Efter avslutad försöks ledning (dvs. läkemedelsbehandlingar, etc.), utför en svans-fåfäng injektion av 100 μL av 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetrametyrodamin, 1 h innan offra möss.
    2. Offra möss och skörda brösttumörer.
    3. Fix tumörer i 10% formalin för 48-72 h och gå vidare till paraffin-inbäddning.
    4. Med hjälp av en mikrotom, skär två 5 μm-tjocka sekventiella bilder från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnader. En bild används för färgning av dextran, medan den andra kommer att användas för att utföra TMEM Triple-IHC, för referens.
      Anmärkning: TMEM Triple-immunohistokemi protokollet har beskrivits någon annanstans 10.
  2. OM färgning och skanning för den första av de två sekventiella avsnitten
    1. Skicka bilder till ett standardprotokoll för de-paraffinisering. Detta inkluderar två efterföljande fördjupningar i xylen (10 min vardera), följt av uttorkning i seriellt utspädda alkohollösningar (100%, 95%, 70%, och 50% EtOH i H2O för 2 min varje nedsänkning).
    2. Utför antigen hämtning genom upphettning (nära kokpunkt) sektionerna nedsänkt i citrat (pH 6,0-justerat) under 20 min.
    3. Låt proverna svalna till rumstemperatur för 15-20 min och tvätta sedan i PBS 3x för 2 min varje tvätt.
    4. Block för 60-90 min i blockeringsbuffert (10% FBS; 1% BSA; 0,0025% Fish Skin gelatin; 0,05% PBST, dvs PBS med 0,05% Tween-20).
    5. Inkubera prover med en blandning av primär råtta och kanin antikroppar som riktar Endomucin respektive TMR, och sedan tvätta i PBST 3x, 2 min vardera.
    6. Inkubera prover med en blandning av sekundära åsnor antikroppar mot råtta IgG (konjugerat till Alexa-647) och kanin IgG (konjugerat till Alexa-488), och sedan tvätta i PBST 3x 2 min vardera.
    7. Utför en rutinmässig DAPI-färgning (dvs. nedsänkning i DAPI-lösning för 5-6 min), montera bilderna med hjälp av en glycerolfri "hård" monteringsmedium, och förvara på en mörk plats tills skanning.
    8. Om du vill uppnå optimala resultat skannar du bilderna på en digital hel bild skanner.
  3. Bildanalys
    1. Capture 10 High Power Fields (HPFs) per fall, med hjälp av någon programvara som lämpar sig för Digital patologi.
    2. Spara Endomucin (röd) och TMR (grön) kanaler separat som TIFF.
    3. Med ImageJ laddar du upp TIFF-filerna och omvandlar dem till 8-bitarsbilder.
    4. Tröskelvärde 8-bitars bilder till nivån för den negativa kontrollen och generera två binarized bilder, som visar Endomucin och TMR "masker".
    5. Från de binära verktygen väljer du Fyllnings hål på endomucin-masken.
    6. Generera och spara följande fem regioner av intresse: 1) den thresholded dextran bilden som "dextran ROI" (ROI1), 2) den thresholded endomucin bilden som "vaskulär ROI" (ROI2), 3) den inverterade endomucin bilden som "extravaskulär ROI" (ROI3), 4) den intersekerade " Extravaskulär ROI "och" dextran ROI "bild (ROI1 ∩ ROI3) som" extravaskulär dextran ROI "(ROI4), och 5) hela bilden som" tumör ROI "(ROI5).
    7. Dividera ROI4 området med ROI5 området och multiplicera med 100 att generera den procentuella område som extravaskulära dextran täcker i hela tumören.
    8. Upprepa processen för 10-20 HPFs per fall (beroende på vävnads tillgänglighet) och generera en genomsnittlig extravaskulär dextran (% område) för varje fall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De experimentella procedurer som beskrivs i denna protokolls artikel sammanfattas kortfattat och illustreras i figur 1A-C.

För att mäta TMEM-medierad vaskulär permeabilitet ("sprängning aktivitet") och för att minska experimentella buller från andra former av vaskulär permeabilitet (dvs. transcellulära och paracellulära, som förklaras i inledningen), vi utfört intravenös (i.v.) injektion av högmolekylära sonder, såsom 155 kDa dextran, konjugerat till tetrametyrodamin. Lägre molekylvikt dextrans inte skilja de tre lägena av vaskulär permeabilitet. Vår tidigare erfarenhet har visat att den systemiska cirkulationen av 155 kDa TMR-dextran effektivt märkt kärl av både normala vävnader, såsom bröstkörteln och lungorna (figur 2A, B), samt av neoplastiska vävnader, såsom primär bröstcancer och bröstcancermetastaser i lungorna (figur 2C, D). Som också bekräftats av tidigare studier5,46, 155 kDa TMR-dextran är därför en lämplig sond för att mäta "sprängning" i både primära och sekundära tumör platser. Ett karakteristiskt exempel på topp sprängning aktivitet (prickat gult område), med hjälp av multiphoton intravital avbildning i en primär MMTV-PYMT brösttumör illustreras som en serie stillbilder (figur 3a). Sprängning aktivitet noterades alltid i samband med en tmem dörröppning (Prickig vit cirkel), som kännetecknas av den rumsliga sammanställning av en Dendra2+ tumör cell en CFP+ makrofager och endotel (figur 3a). Som nämnts, varje TMEM dörröppningen består av en perivaskulär makrofage, en Mena överuttrycker tumör cell, och en endotelcell, alla i direkt fysisk kontakt med varandra. Även Mena har inte uttryckligen märkt i musmodeller som används i dessa experiment, det har tidigare visat sig bli överuttryckt i slutet av skedet PyMT carcinoma47. Detta förenklar identifieringen av TMEM dörröppningar och eliminerar behovet av att explicit märka Mena i tumörcellerna.

För att bedöma TMEM-beroende vaskulär permeabilitet i fasta vävnads analys, utförde vi det förfarande som beskrivs i detta protokoll i möss som transplanterades med tumör bitar tas från 14-veckors gamla MMTV-PyMT givare möss. När möss nådde en lämplig tumörstorlek, de fick en enda i.v. dos av 155-kDa TMR-dextran, som beskrivs i del 2 av detta protokoll, och offrades efter 1 timme. Tumörvävnaderna samlades in och utsattes för om analys. Endomucin fluorescerande signal användes som en uteslutnings mask till dextran fluorescerande signal, vilket möjliggör diskriminering mellan högpermeabla och låg, eller icke-permeabla, blodkärl (figur 3B). Som tidigare beskrivits i Karagiannis et al.48, en sekventiell Slide var också färgas med den tidigare etablerade tmem Triple fläcken och i linje med motsvarande IF Slide. Med hjälp av denna metod bekräftade vi att de mycket permeabla blodkärlen i brösttumör vävnad har minst en associerad TMEM dörröppning (figur 3B).

Figure 1
Figur 1 . Sammanfattning av förfarandet. (A) Dendra-2 märkt invasiv cancer i bröstet (grön) tagen från ett transgent djur [fvb/N-TG (Mmtv-pymt) mul-TG (Mmtv-Icre) JWP-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP] och skuren i små bitar. Ett stycke är då ortotopiskt transplanterade till ett annat transgena djur vars makrofager var märkta med Cyan fluorescerande protein (cyan) [fvb/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. Den ortotopiskt transplanterade till tumör tillåts sedan växa, varefter musen fördelas till lämplig behandlingsarmen. (B) när behandlingen är avslutad tas musen för intravital avbildning. En gång sövda, en hud klaffen kirurgi utförs sedan stabiliserats med en gummibaksida. Ett grunt bildbehandlings fönster fästs sedan över tumören. Slutligen är musen sedan placeras på mikroskopet skede där fönstret passar in i skräddarsydda scenen plattan och bilderna kan sedan förvärvas. (C) alternativt, musen från A administreras hög molekylvikt dextran och offras efter 1 timme. Tumören avlägsnas sedan, fast, och bearbetas för paraffin inbäddning. Delar av vävnaden skärs, färgas för TMEM i IHC och dextran och fartyg i IF, och skannas på en digital hel bild skanner. Slutligen, bilder från de två skanningar är inriktade och enskilda områden av vyn väljs för analys och kvantifiering av vaskulär läckage. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Visualisering av TMR-dextran märkt kärlsystemet i friska och sjuka vävnader. A) en bild av en hälsosam utveckling av bröstkörteln inom ett transgent djur vars kärl är märkt med TMR-dextran (rött), bröst duktal epitel märkt av fluorescerande protein Dendra-2 (grön), och makrofager märkta med en Cyan fluorescerande protein (blått) [fvb/N-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. (B) friska lungvävnad visualiseras genom ett lungröntgen fönster inom en mus vars kärl är märkt av TMR-dextran (röd). Blå = SHG från kollagenfibrer. C) Dendra2 märkt invasiv duktal carcinoma tagen från ett transgent djur [fvb/N-TG (mmtv-pymt) mulxtg (mmtv-icre) JWP-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP] och ortotopiskt transplanterade till ett annat transgena djur vars makrofager är märkta med Cyan fluorescerande protein (blå) [fvb/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) och fartyg märkta med TMR-dextran (röd). (D) lungmetastaser åtta dagar efter IV injektion av tumörceller (E0771; märkt av fluorescerande protein klöver) till ett transgent djur vars makrofager är märkta med Cyan fluorescerande protein (cyan) [fvb/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-ecfp) ] och kärlsystemet märkta med TMR-dextran (röd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Visualisering av TMEM-medierad vaskulär permeabilitet med intravital avbildning och fast vävnads analys. (A) stillbilder från en tidsförfallen intravital avbildning av 155-kDa TMR-dextran märkning av Neo-angiogena kärl (röd) inom en Dendra-2-märkt invasiv cancer i bröstet (grön) tagen från ett transgent djur [fvb/N-TG (Mmtv-pymt) mul-TG (MMTV-iCre) JWP-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP] och ortotopiskt transplanterade till ett annat transgena djur där makrofager var märkta med Cyan fluorescerande protein (cyan) [fvb/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-ecfp)]. Den streckade gula linjen betecknar konturen av det övergående vaskulära läckageområdet före (t = 0 '), under (t = 17 ') och efter (t = 52 ') läckage (sprängning) händelse. Den streckade vita cirkeln pekar på en TMEM dörröppning, som fångas i Live Imaging. (B) flerkanals immunofluorescens av Endomucin (första kolumnen), 155-kDa dextran-TMR (andra kolumnen), deras sammanslagna bild tillsammans med DAPI (tredje kolumnen), thresholded blodkärl och extravaskulära dextran masker (fjärde kolumnen), och den motsvarande sekventiell sektion av TMEM IHC (femte kolumnen) i MMTV-PyMT-möss. Översta raden: vaskulär profil bort från TMEM, visas som en "icke-läckande" vaskulär profil. Nedersta raden: TMEM-associerad vaskulär profil, visas som en "läckande" vaskulär profil. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här skisserar vi två protokoll som kan tillämpas för att visualisera och kvantifiera en viss typ av vaskulär permeabilitet som finns på TMEM dörröppningar och är förknippad med störningar av vaskulära snäva och anhängare korsningar. Denna typ av vaskulär permeabilitet är övergående och kontrolleras av trepartsgruppen TMEM cell Complex, som förklaras ovan5. Förmågan att identifiera och kvantifiera TMEM-associerad vaskulär permeabilitet är avgörande för bedömningen av en Pro-metastaserande cancer cell mikromiljö, samt för prekliniska studier som undersöker effekten av konventionella cytotoxiska terapier på tumör mikromiljö samt anti-metastaserande potential hos riktade och icke-riktade terapier. Viktigt, vi visade här att denna bedömning kan göras genom antingen intravital avbildning eller immunofluorescens i fasta vävnader. Båda metoderna har sina fördelar och nackdelar. Intravital Imaging möjliggör direkt visualisering av den dynamiska processen av vaskulär permeabilitet, men kräver specialiserad utrustning och utbildning. Å andra sidan, immunofluorescens utförs i fasta vävnader erbjuder endast en statisk bild, men kan rutinmässigt utföras i de flesta laboratorier.

Cancer patienter behandlas vanligen med någon form av systemisk behandling, och framgången för systemisk behandling är vanligtvis bedöms av utvärderingen av parametrar relaterade till cancer cellöverlevnad såsom apoptos, proliferation, eller grov tumörstorlek. Emellertid, det är lika viktigt att förstå hur dessa systemiska terapier påverkar Cancer Cell spridning med tanke på att de flesta cancerrelaterad dödlighet uppstår på grund av metastaser, en process som involverar både cancer cell proliferation och cancer cell spridning1. Till exempel, nyare studier har visat att kemoterapi kan inducera en signifikant ökning av tätheten av tmem dörröppningar i mus och Human bröstcancer48,49. Dessutom, det visades att kemoterapi inducerar TMEM aktivitet och resulterar i hematogen spridning av cancerceller, ökad cirkulerande cancerceller, och ökad lungmetastaser48. Den kemoterapi-inducerad ökning av tmem aktivitet kan blockeras av systemisk administrering av läkemedel som hämmar TIE2 funktion och därför tmem aktivitet, kallas rebastinib14,48. Således kan de protokoll som beskrivs här erbjuda värdefulla Endpoint mätningar för effekten av olika systemiska behandlingar på TMEM aktivitet genom jämförelsen av behandlade till icke-behandlade kohorter av möss.

Under de senaste åren, begreppet antiangiogen terapi i cancer har Revisited, vilket tyder på att en vaskulär "normalisering" strategi (dvs. den övergående rekonstituering av onormal struktur och funktion av blodkärlen), kan vara bättre att rikta blodkärl för destruktion, eftersom det gör kärlnybildning mer effektivt för läkemedelsleverans50,51,52,53,54. Med anledning av denna framväxande hypotes, andra grupper har också utvecklat analyser för att bedöma vaskulär permeabilitet och för att testa effektiviteten i vaskulär normalisering strategier55. Det bör nämnas att dessa metoder i princip används för att bedöma TMEM-oberoende former av vaskulär permeabilitet. Därför, valet av de lämpligaste vaskulär permeabilitet analysen beror på omfattningen av en studie, och forskare måste se till att de förstår tillämpligheten av varje publicerad vaskulär permeabilitet analyser, innan de tillämpas på deras Studier.

Som nämnts ovan, var och en av de två metoder som beskrivs här har vissa fördelar jämfört med den andra. Till exempel, mätning "sprudlande permeabilitet" in vivo erbjuder värdefull kinetisk information, men eftersom sprängning är en sällsynt händelse, kan långvarig bildbehandlings sessioner av flera timmar varje krävas för att kunna få tillräckligt med data. Dessutom kräver intravital avbildning specialiserad utrustning som kanske inte är tillgänglig för alla utredare. Å andra sidan, utvärdering av TMEM verksamhet i fasta vävnader är relativt lätt att utföra och kräver endast standard laboratorieutrustning. Dessutom är analysen av TMEM aktivitet i fasta vävnader lättare att tolka, men saknar kinetisk information. Dessutom är den fasta vävnads analys mindre specifik, eftersom det kan fånga kumulativa läckage av dextran över tiden från transcellulära och paracellulära vaskulär permeabilitet av intakt endothelia, eller till och med en plötslig läcka händelse på grund av spontan vaskulär skada. Således skulle den synergistiska användningen av de två metoderna göra tolkningen av TMEM-medierad vaskulär permeabilitet mer specifika och känsligare. Även om vi inte uttryckligen har testat andra tillämpningar av de tekniker som presenteras här, kan de visa sig användbara för att undersöka inducerad fartygets permeabilitet, till exempel genom infektion eller farmaceutiska terapier.

Sammanfattnings, mätningen av TMEM-associerad vaskulär permeabilitet, som beskrivs av två oberoende metoder här, tillhandahålla användbara verktyg för att bedöma den Pro-metastaserande tumör mikromiljö och dess associerade TMEM aktivitet, och kan användas för att vissa utsträckning av något laboratorium. Dessa metoder är särskilt användbara i den prekliniska bedömningen av effekten av systemiska terapier på spridning av cancerceller. Dessutom, de kan användas för att bedöma effekten av agenter som kan blockera kemoterapi-inducerad TMEM aktivitet, och slutligen, dessa metoder kan användas för att bedöma den bästa kombinationsbehandling före fas I patienter prövningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna avslöjar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka analytisk Imaging Facility (AIF) i Albert Einstein College of Medicine för Imaging support. Detta arbete stöddes av bidrag från NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 och CA216248), SIG 1S10OD019961-01, den Gruss-Lipper Biophotonics Center och dess integrerade Imaging program, och Montefiore ' s Ruth L. Kirschstein T32 utbildning beviljande av kirurger för studiet av tumören mikromiljö (CA200561).

GSK skrev manuskriptet, utförde Imaging för figur 1c och 3b, utvecklade fast vävnads analysprotokoll och analyserade och tolkade alla data; JMP skrev manuskriptet och utförde operationen och intravital avbildning för figur 1b, 2C och 3a; LB & AC utförde operationen och intravital avbildning för figur 2b; RJ utförde operationen och intravital avbildning för figur 2A; JSC skrev manuskriptet och analyserade och tolkade alla data; MHO co-skrev manuskriptet och analyserade och tolkade alla data; och de utförde operationen och intravital avbildning för figur 2D, co-skrev manuskriptet, utvecklat fast vävnad analys och intravital Imaging protokoll, och analyserade och tolkade alla data.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Tags

Retraktion intravital avbildning immunofluorescens blodets permeabilitet tumör mikromiljö av metastaser (TMEM) hög molekylvikt dextran immunofluorescens metastaser
Bedömning tumör mikromiljö av metastaser Doorway-medierad vaskulär permeabilitet i samband med Cancer Cell spridning med Intravital avbildning och fast vävnads analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J.… More

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter