Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Vurdere tumor Mikromiljøet av metastasering døråpning-mediert vaskulær permeabilitet forbundet med kreft Cell formidling bruker Intravital Imaging og fast vev analyse

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59633
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Summary

Vi beskriver to metoder for å vurdere forbigående vaskulær permeabilitet assosiert med tumor mikromiljøet av metastasering (TMEM) dør åpningsfunksjon og kreftcelle intravasation ved hjelp av intravenøs injeksjon av høy molekylvekt (155 kDa) dextran i mus. Metodene omfatter intravital avbildning i levende dyr og fast vevs analyse ved hjelp av immunofluorescence.

Abstract

Den vanligste årsaken til kreft relaterte dødelighet er metastasering, en prosess som krever formidling av kreftceller fra den primære svulst til sekundære områder. Nylig etablerte vi at kreftcelle formidling i primær brystkreft og metastatisk steder i lungene oppstår bare på døråpninger kalt tumor Mikromiljøet av metastasering (TMEM). TMEM dør åpningsnummer er Prognostisk for Fjern gjentakelse av metastatisk sykdom hos brystkreftpasienter. TMEM døråpninger er sammensatt av en kreftcelle som over-uttrykker utgangen regulatoriske proteinet Mena i direkte kontakt med en inflammasjon, proangiogenic macrophage som uttrykker høye nivåer av TIE2 og VEGF, hvor begge disse cellene er tett bundet til et blod fartøy endothelial celle. Kreftceller kan intravasate gjennom TMEM døråpninger på grunn av forbigående vaskulær permeabilitet orkestrert av felles aktivitet av TMEM-assosiert macrophage og TMEM-Associated Mena-uttrykker kreftcelle. I dette manuskriptet beskriver vi to metoder for vurdering av TMEM-mediert transient vaskulær permeabilitet: intravital Imaging og fast vev immunofluorescence. Selv om begge metodene har sine fordeler og ulemper, kombinere de to kan gi den mest komplette analyser av TMEM-mediert vaskulær permeabilitet og microenvironmental forutsetninger for TMEM funksjon. Siden metastatisk prosess i brystkreft, og muligens andre typer kreft, innebærer kreftcelle formidling via TMEM døråpninger, er det viktig å ansette godt etablerte metoder for analyse av TMEM døråpning aktivitet. De to metodene som er beskrevet her gir en helhetlig tilnærming til analyse av TMEM døråpning aktivitet, enten i naive eller farmakologisk behandlede dyr, som er av største betydning for pre-kliniske studier av agenter som hindrer kreftcelle formidling via TMEM.

Introduction

Nylige fremskritt i vår forståelse av kreft metastasering har avdekket at epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) og induksjon av en trekk/invasiv kreftcelle pasientpopulasjonen er ikke, av seg selv, tilstrekkelig for hematogenous formidling 1. faktisk, det var tidligere antatt at metastasizing kreftceller intravasate gjennom helheten av kreft-assosiert endotelet som tumor neovasculature er ofte karakterisert ved lav pericyte dekning, og som sådan, er svært gjennomtrengelig og ustabil2,3,4. Selv om det er svært tankevekkende for defekte funksjoner i svulsten, gir ikke vaskulær modifikasjoner under kreft bevis per se at tumorceller kan trenge gjennom blodkar lett og i en ukontrollert måte. Innsikter fra intravital Imaging (IVI) studier, der tumorceller er fluorescensmerkete og blodkar er merket via intravenøs injeksjon av fluorescerende sonder (for eksempel dextran eller Quantum prikker), viser at, mens tumor fartøy er jevnt gjennomtrengelig for lav molekylvekt dextrans (f. eks 70 kD), høy molekylvekt dextrans (155 kD) og tumorceller kan krysse endotelet bare på spesialiserte områder av intravasation som er fortrinnsvis plassert på vaskulær gren punkt5, 6 andre priser , 7. IMMUNHISTOKJEMISKE (IHC) analyser ved hjelp av dyremodeller og menneskelig pasient-avledet materiale har vist at disse nettstedene er "døråpninger" som spesialiserer seg på å regulere vaskulær permeabilitet, lokalt og midlertidig, og gir et kort vindu av mulighet for trekk/invasive kreftceller å gå inn i sirkulasjon. Disse døråpninger kalles "tumor mikromiljøet av metastasering" eller "TMEM", og ganske ventet, deres tetthet samsvarer med en økt risiko for å utvikle metastatisk sykdom hos brystkreftpasienter8,9, 10i.

Hver TMEM døråpning består av tre forskjellige typer celler: en inflammasjon macrophage, en svulst celle over-uttrykker utgangen-regulerende protein pattedyr aktivert (Mena), og en endothelial celle, alt i direkte fysisk kontakt med hverandre1, 5,9,10,11,12,13. Nøkkelen begivenhet for funksjonen av TMEM idet en intravasation døren er det lokalisere løslate av vaskulær endothelial oppblomstringen faktoren (VEGF) onto det underliggende fartøy av det inflammasjon macrophage14. VEGF kan forstyrre homotypic veikryss mellom endothelial celler15,16,17,18,19, et fenomen som resulterer i forbigående vaskulær lekkasje, også kjent som "sprengning" permeabilitet som beskrevet i IVI studier 5. TMEM makrofager har vist å uttrykke tyrosin kinase reseptor TIE2, som er nødvendig for VEGF-mediert TMEM funksjon og homing av disse makrofager til inflammasjon nisje5,20,21 , 22. i tillegg til å regulere kreftcelle formidling og metastasering, TIE2+ makrofager har vist å være sentrale regulatorer av tumor angiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Som sådan, TIE2+ makrofager representerer en kritisk bestanddel av tumor mikromiljøet og den viktigste regulator av metastatisk Cascade.

For å bedre conceptualize TMEM-mediert vaskulær permeabilitet (dvs. "sprengning"), er det svært viktig å skille det fra andre moduser av vaskulær permeabilitet som ikke er forbundet med oppløsning av endothelial celle-celle veikryss. I en intakt endotelet (en hvis stramt og adherens veikryss ikke forstyrres), er det tre hovedtyper av vaskulær permeabilitet: (a) pinocytosis, som kan, eller ikke kan, være koplet til transcytosis av svelget materiale; (b) transport av materiale gjennom endothelial fenestrae; og (c) transport av materiale gjennom paracellular veien, som er regulert av endothelial tette veikryss15,16,17,18,19,32 , 33 for alle , 34. selv om deregulerte i mange svulster, de nevnte moduser vaskulær permeabilitet har blitt beskrevet hovedsakelig i sammenheng med normal vev fysiologi og homeostase, det ekstreme som er vev med enten begrenset permeabilitet ( f. eks, blod-hjerne barriere, blod-testikkel barriere), eller rikelig permeabilitet (f. eks, fenestrated blodkar av nyre glomerulær apparat)34,35,36,37.

Ved hjelp av multiphoton intravital Imaging og multiplekset immunofluorescence mikroskopi, er vi i stand til å skille mellom TMEM-mediert vaskulær permeabilitet ("sprengning") og andre moduser av vaskulær permeabilitet i brystkreft svulster. For å oppnå dette, utfører vi en enkel intravenøs injeksjon av en høy molekylvekt, fluorescensmerkete sonde i mus. Spontane sprengning hendelser kan deretter fanges ved hjelp av intravital Imaging i levende mus; eller alternativt kan Ekstravasasjon av sonden bli kvantifisert av co-lokalisering studier med blod blodkar (f. eks CD31+ eller Endomucin+) og TMEM døråpninger ved hjelp av immunofluorescence mikroskopi. Protokollene som presenteres her beskriver begge disse teknikkene, som kan brukes enten uavhengig eller sammen med hverandre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter med levende dyr må gjennomføres i samsvar med dyre bruk og omsorg retningslinjer og forskrifter. Prosedyrene beskrevet i denne studien ble utført i samsvar med National Institutes of Health forskrifter om omsorg og bruk av forsøksdyr og med godkjennelse av Albert Einstein College of Medicine Animal Care og bruk Komiteen (IACUC).

1. evaluering av "sprengning permeabilitet" ved hjelp av levende dyr Imaging

  1. Transplantasjon av syngeneic brystkreft svulster i musen verter med fluorescerende makrofager
    1. Generere biter av tumor vev egnet for transplantasjon.
      1. Generer fluorescensmerkete-merkede svulster i mus melke kreft modeller ved å krysse spontane, autochtonous, genetisk konstruert mus brystkreft modell MMTV-PyMT mus med transgene mus uttrykke fluorescerende journalister38, 39 [f.eks. forbedret grønt FLUORESCERENDE protein (EGFP), forbedret cyan FLUORESCERENDE protein (ECFP) eller Dendra2].
      2. La MMTV-PyMT mus med fluorescensmerkete merket svulster å vokse til en størrelse på ikke større enn 2 cm (ca 10-12 ukers alder).
      3. Euthanize svulsten peiling MMTV-PyMT mus ved å plassere dem i et kammer med 5% isoflurane til 30 sekunder etter at alle respirations stoppe.
      4. Utfør en cervical forvridning.
      5. Fjern hår fra euthanized mus magen ved hjelp av en aktuell riktige krem.
      6. Plasser en Petri parabolen med DMEM/F12 cellekultur medium på isen.
      7. Plasser musen og Petri rett på isen inn i avtrekks panseret.
      8. Rense magen med 70% etanol.
      9. Ved hjelp av sterile hansker og kirurgiske verktøy (sterilisert saks, tang og blad) fjerne svulster og plassere dem i Petri parabolen.
      10. Skjær opp svulsten i små biter (~ 2 mm x 2 mm x 2mm i størrelse), forkaster eventuelle nekrotisk porsjoner, mens de er i Petri parabolen.
    2. Transplant svulsten brikkene til mottakeren verter.
      1. Hev mus med genetisk konstruerte fluorescensmerkete-merkede makrofager, for eksempel MacGreen40 eller MacBlue 41 mus (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. La FVB mus med fluorescensmerkete merket makrofager å vokse til en alder av ~ 4-6 uker).
      3. Bedøve FVB mus med fluorescensmerkete merket makrofager i et kammer med 5% isoflurane med oksygen som transportør gass.
      4. Reduser anestesi til ~ 3% isoflurane og påfør øye salve til øynene av musen for å hindre tørking.
      5. Fjern hår fra over den 4th melke kjertel av musen.
      6. Rengjør huden med Betadine. Det er viktig å opprettholde sterile forhold gjennom resten av prosedyren. Dette inkluderer bruk av sterilisert instrumenter og reagenser.
      7. Lag et lite snitt ~ 2-3 mm bare dårligere enn de 4th brystvorten.
      8. Analysere til melke fettet puten er utsatt.
      9. Ta en svulst stykke fra Petri parabolen og pels i kunstige ekstracellulære matrise.
      10. Transplant svulster under 4th melkefett pad.
      11. Lukk snittet ved hjelp av Cyanoacrylate klebemiddel.
      12. Kontinuerlig overvåke dyret til det fullt ut gjenoppretter fra anestesi og er i stand til å opprettholde sternal recumbency. Også, ikke å returnere dyret til selskap med andre dyr før full gjenoppretting.
      13. For å minimere infeksjoner, tilsett 1 mL 100 mg/mL enrofloksacin antibiotika til dyrets drikkevann flaske (8 fl oz).
      14. Tillat svulster å vokse til håndgripelig (~ 5 mm; ~ 4 uker).
      15. Avhengig av eksperimentet, tildeler du musene til behandlingsgrupper og utfører de tilsvarende behandlingene, hvis det er aktuelt.
  2. Oppsett for intravital avbildning
    1. Slå på mikroskopet to-Foton laser og detektorer.
    2. Slå på varme boksen og pre-varme mikroskopet er x-y scenen.
    3. Plasser den skreddersydde scenen innsats42 i x-y scenen.
  3. Utarbeidelse av bilde vindu
    1. Før du setter opp for bildebehandling, autoklav du den skreddersydde sirkulære bildebehandlings vindusrammen42.
    2. Bruk en pipette eller en insulinsprøyte for å plassere et tynt lag med Cyanoacrylate klebemiddel i vinduskarmen, og fest på plass en 8 mm sirkulær deksel glass.
      Merk: 1) det er viktig å unngå å få rester på den klare blenderåpningen på dekkglasset. 2) det er viktig å feste dekkglasset til vindusrammen minst 1 time før bruk til bildebehandling.
    3. Tørk forsiktig av overflødig Cyanoacrylate på den klare blenderåpningen på dekkglasset ved hjelp av en laboratorie tørke fuktet med en liten mengde aceton.
  4. Utarbeidelse av hale venekateter for administrasjon av væsker og fluorescerende fargestoffer under bildebehandling
    1. Skjær en 30 cm stykke polyetylen slange å konstruere en hale venekateter.
    2. Løsne nåle delen av en 30 G-nål fra luer taper ved å bøye kanylen forsiktig frem og tilbake til den knekker.
      Merk: nålen skal holdes nær luer taper og ikke nålespissen. Dette kan utføres med tang eller tang for å ta tak i nålen for å hindre nål Stick skade.
    3. Sett den butte enden av nålen inn i den ene enden av polyetylen slangen.
    4. Sett den skarpe enden av en annen 30 G nål, holde sin luer taper festet, til den motsatte enden av slangen.
    5. Fyll en 1 cc sprøyte med fosfat bufret saltvann, fest den til luer taper av det sammensatte kateteret, og skyll halen vene kateteret slik at det ikke er noen luftbobler i systemet.
    6. For vaskulær merking, Fyll en 1 cc sprøyte med 100 μL av 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) eller Quantum prikker.
  5. Utarbeidelse av mus for bildebehandling
    1. Bedøve musen i et bur under (~ 1 fot nedenfor) en varmelampe med 4%-5% isoflurane blandet med 100% oksygen satt til en strøm på 1,5-2 L per min.
    2. Slå på varmelampe over kirurgisk arbeidsområde. Dette trinnet er avgjørende for å opprettholde kjernen fysiologiske kroppstemperatur av musen under operasjonen.
    3. Plasser musen under varme lampen og senk anestesi til 2%-3% for varigheten av operasjonen.
      Merk: Sørg for å holde varme lampen på trygg avstand (~ 1 fot) bort fra musen for å unngå overoppheting.
    4. Plasser øye og salve på musen for å hindre uttørking av øyne og blindhet.
    5. Test at musen er anesthetized ved å utføre toe-klype test. Hvis dyret trekker, øke dosen av isoflurane med 1% og test på igjen i 1-2 min.
    6. Sett hale vene kateteret inn i det mest mulige punktet på halen.
    7. Fest halen vene kateteret til halen med et lite stykke Lab tape som brytes rundt halen og holder seg til nålen for å sikre at den ikke får forskyves.
    8. Injiser 50 μL per time i PBS gjennom et venekateter for å gi tilstrekkelig hydrering. Det er viktig å unngå å injisere for mye væske (ikke mer enn 200 μL per h) eller noen bobler inn i kateteret, da dette kan være dødelig for musen.
    9. Fjern hår på magen over 4th og 5th melkekjertlene bruker riktige krem.
    10. Rengjør huden med Betadine og la huden tørke.
    11. Lag en langsgående midtlinjen snitt starter umiddelbart overlegen til kjønnsorganene og bære snittet opp til nivået av den overlegne aspektet av 4th bryst kjertel.
    12. Carry snittet tverrgående til den overlegne aspektet av 4th melke kjertel. Det er viktig å unngå å kompromittere blodtilførselen på dette punktet.
    13. Analysere bryst fett puten av peritoneum skape et vev klaff ved hjelp av sterile tang og saks.
      Merk: hud klaff bildebehandling er mottakelig for betydelige bevegelser gjenstander og vev dehydrering. Disse unngås, som beskrevet tidligere43,44, av påføring en rigid stykke gummi bak til huden siden av klaffen (for å stive bløtvevet og isolere den fra resten av kroppen) og deretter plassere svulsten i en grunne Imaging vinduet for å bevare hydrering. Dette er avgjørende for stabil avbildning som tumor og omgivende vev i denne innstillingen er svært kompatibel.
    14. Stabilisere huden klaff ved påføring (med Cyanoacrylate lim) et lite stykke stiv gummi som måler 2 cm x 2 cm til hudens side av klaffen. Svulsten bør være i midten av området som stabiliseres av gummien.
    15. Hold eksponert vev hydrert med dråper PBS.
    16. Påfør en liten film av Cyanoacrylate til ytterkanten av skreddersydde Imaging vinduskarmen.
    17. Påfør en liten dråpe PBS (~ 10 – 20 μL) til midten av dekkglasset.
    18. Tørk det omliggende klaff vevet med et laboratorie tørke. Det er viktig å sørge for at Cyanoacrylate på vinduskarmen ikke kommer i kontakt med PBS på glasset, da dette kan føre til at Cyanoacrylate polymeres og stilles for tidlig.
    19. Fest den lille Imaging vindu til vevet klaff med tumor i sentrum av den klare blenderåpning.
    20. Fjernvarme boksen fra scenen.
    21. Overfør den anesthetized musen og hale vene kateteret til mikroskopet scenen. Bruk ekstrem forsiktighet for å sikre at hale vene kateteret ikke faller ut.
    22. Plasser musen på scenen i liggende posisjon.
    23. Plasser nesen kjegle isoflurane over snuten for å sikre vedlikehold av anestesi.
    24. Sett vinduet inn i diameter på den egendefinerte x-y scenen plate.
    25. Plasser varme boksen tilbake på scenen for å opprettholde en fysiologisk temperatur.
    26. Dataskjerm det dyr ' livsviktig underskriver av tilknytte en impuls oximeter sonde via hefte sensor å baksiden pote.
    27. Sakte redusere isoflurane til 0,5%-1% for å opprettholde tilstrekkelig blodstrøm og unngå over anesthetizing musen.
  6. Intravital avbildning
    Merk: bildebehandling vi beskriver i dette avsnittet, ble utført på et spesialbygd to-laser multiphoton mikroskop som tidligere er beskrevet5,39,45. Kort, en femtosecond laser brukes til å generere 90 femtosecond pulserende laser lys sentrert på 880 NM. Fluorescens lys oppdages med tre av de fire samtidig anskaffe detektorer (blå = 447/60, grønn = 520/65, og rød 580/60; sentral bølgelengde/båndbredde) etter separasjon fra eksitasjon lys av en dichroic (Chroma, Z720DCXXR). Mikroskopet stativet inneholder en 25x, 1,05 NA (numerisk blenderåpning) lang arbeidsavstand (2 mm) objektiv linse. Det er viktig å merke seg at selv om vi har brukt et spesialbygd mikroskop, kan protokollen som beskrives nedenfor, også utføres på alle kommersielt tilgjengelige multiphoton mikroskop.
    1. Plasser en dråpe destillert vann mellom 25x, 1,05 NA mikroskop objektiv og vinduet dekke glass for å gjøre optisk kontakt.
    2. Bruk mikroskopet okularet til å fokusere på områder med fluorescerende tumorceller nær til overflaten av vinduet.
    3. Finn rennende blodkar og merkede makrofager. Det er avgjørende å ha flytende blodkar for å vurdere dynamikken i blodkar.
    4. Sett mikroskopet i multiphoton modus.
    5. Angi øvre og nedre grense for en z-serie, som måler omtrent 50 μm.
      1. Angi den øvre grensen for z-serien ved å bruke fokus justeringen til å flytte målsettingen til ønsket startsted, i den mest overfladiske posisjonen og markere denne posisjonen som null i programvaren ved å klikke på knappen Z-posisjon .
      2. Sett den nedre grensen for z-serien flytte målet til den dypeste lag (vanligvis 50-70 μm fra toppen for mindre svulster) og klikke på Z-posisjon nederst knappen.
      3. Angi z-trinn-størrelsen til 5 μm.
    6. Klikk på knappen for tidsforløp og angi tidsintervallet mellom anskaffelser til minst 10 s for å gi tilstrekkelig tid til å etterfylle vannet over objektivlinsen. Dette gjøres manuelt med en klemme pipette på målet i lang tid forfalle.
    7. Fjern sprøyten med PBS i hale vene kateteret og Bytt den ut med en annen sprøyte som inneholder 155 kDa dextran-TMR (tetramethyl rhodamine).
    8. Injiser 100 μL av 155 kDa dextran-TMR via hale vene kateteret.
    9. Etter injeksjon, Bytt ut TMR sprøyten med PBS sprøyten.
    10. Skaff deg en z-stack time-lapse Imaging ved å klikke på Z-stack og time-lapse knapper, og deretter klikke på opptaksknappen.
    11. Injiser 50 μL av PBS hver 30-45 min for å opprettholde tilstrekkelig hydrering av dyret. Unngå å injisere mer enn 200 μL i tide, da dette kan forårsake væske overbelastning.
  7. Euthanasia
    1. Forhøye det isoflurane å 5% og oppbevare det dyr under 5% isoflurane med nese kjegle på plass til 30 s etter respirations opphøre.
    2. Fjern musen fra scenen.
    3. Utfør cervical forvridning.
  8. Bildebehandling
    1. Belaste alle profilen i ImageJ og formatter seg i en 5 dimensjonale hyperstack (x, y, z, t, og fargen kanalen).
    2. Utfør separasjon av Spectral overlapping (dvs.: GFP og CFP) og eliminering av x-y drift fra hyperstacks ved hjelp av etablerte metoder38.
    3. Bruk justering av lysstyrke og kontrast for å øke det hvite nivået i blod kanalen slik at bakgrunns signalet blir synlig.
    4. For hver z Slice, nøye inspisere hver film for tegn på forbigående vaskulær lekkasje (en "burst"). Kjører filmene på raske bildefrekvenser (40 fps) kan hjelpe denne identifikasjonen.
    5. Når et utbrudd er identifisert, returner lysstyrken for denne kanalen til et normalt nivå og beskjære hyperstack til denne regionen og z-Slice.

2. evaluering av ekstravaskulær dextran ved hjelp av fast vevs analyse

  1. Tumor og sample forberedelse
    Merk: 2nd del av denne protokollen forutsetter at brystkreft svulster har blitt høstet fra en orthotopic transplantasjon mus modell av brystkreft (dvs. MMTV-PyMT). Denne modellen kan være den samme som den som er beskrevet i 1St -delen av protokollen, selv om fluorescensmerkete-merkede svulster ikke er nødvendig på dette punktet.
    1. Etter avslutningen av den eksperimentelle rørledningen (dvs. medikament behandling, etc.), Utfør en "tail-forgjeves" injeksjon på 100 μL av 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetramethyl rhodamine, 1 h før de ofrer musene.
    2. Ofre musene og høste bryst tumorer.
    3. Fix svulster i 10% formalin for 48-72 h og gå videre til parafin-embedding.
    4. Bruk en mikrotomen til å kutte to 5 μm-tykke sekvensielle lysbilder fra det formalin parafin-embedded (FFPE)-vevet. Ett lysbilde brukes til farging av dextran, mens den andre vil bli brukt til å utføre TMEM Triple-IHC, som referanse.
      Merk: TMEM trippel-immunhistokjemi protokoll har blitt beskrevet andre steder 10.
  2. Hvis farging og skanning for den første av de to sekvensielle avsnittene
    1. Send inn lysbilder til en standard paraffinization protokoll. Dette inkluderer to påfølgende immersions i xylen (10 min hver), etterfulgt av dehydrering i serielt fortynnede alkohol løsninger (100%, 95%, 70%, og 50% EtOH i H2O for 2 min hver nedsenking).
    2. Utfør antigen henting ved oppvarming (nær kokepunktet) delene neddykket i citrate (pH 6,0-justert) i 20 min.
    3. La prøvene avkjøles til romtemperatur i 15-20 min og vask deretter i PBS 3x for 2 min hver vask.
    4. Blokk for 60-90 min i blokkerings buffer (10% FBS; 1% BSA; 0,0025% fiske hud gelatin; 0,05% PBST, dvs. PBS med 0,05% mellom-20).
    5. Ruge prøver med en blanding av primær rotte og kanin antistoffer som mål Endomucin og TMR, henholdsvis, og deretter vaske i PBST 3x, 2 min hver.
    6. Ruge prøver med en blanding av sekundære esel antistoffer mot rotte IgG (bøyd til Alexa-647) og kanin IgG (bøyd til Alexa-488), og deretter vaske i PBST 3x 2 min hver.
    7. Utfør en rutine DAPI farging (dvs. nedsenking i DAPI løsning for 5-6 min), montere lysbildene ved hjelp av en glyserol-Free "hard" montering medium, og lagre i et mørkt sted til skanning.
    8. Du oppnår optimale resultater ved å skanne lysbildene på en digital hel lysbilde skanner.
  3. Image analyse
    1. Capture 10 High Power Fields (HPFs) per sak, ved hjelp av noen programvare som passer for digital patologi.
    2. Lagre Endomucin (rød) og TMR (grønn) kanaler separat som TIFF.
    3. Bruke ImageJ, laste opp TIFF-filer og konvertere dem til 8-bits bilder.
    4. Terskel 8-bits bilder til nivået av den negative kontrollen, og generere to binarized bilder, viser Endomucin og TMR "masker".
    5. Fra binær verktøyene velger du Fyll hull på Endomucin-masken.
    6. Generer og lagre følgende fem områder av interesse: 1) den thresholded dextran bildet som "Dextran ROI" (ROI1), 2) den thresholded endomucin bildet som "vaskulær ROI" (ROI2), 3) den invertert endomucin bildet som "ekstravaskulær ROI" (ROI3), 4) den krysses " Ekstravaskulær ROI "og" Dextran ROI "Image (ROI1 ∩ ROI3) som" ekstravaskulær Dextran ROI "(ROI4), og 5) hele bildet som" tumor ROI "(ROI5).
    7. Dividere det ROI4 område av det ROI5 område og multiplisere av 100 å utvikle det prosenten område det det ekstravaskulær dextran dekker inne det hel svulst.
    8. Gjenta prosessen for 10-20 HPFs per tilfelle (avhengig av vevs tilgjengelighet) og Generer en gjennomsnittlig ekstravaskulær Dextran (% Area) for hvert tilfelle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen artikkelen er kort oppsummert og illustrert i figur 1A-C.

For å måle TMEM-mediert vaskulær permeabilitet ("sprengning aktivitet") og for å redusere eksperimentell støy fra andre moduser av vaskulær permeabilitet (dvs. transcellular og paracellular, som forklart i innledningen), vi utførte intravenøs (IV) injeksjon av høy molekylvekt sonder, slik som 155 kDa Dextran, som bøyes likt til tetramethyl rhodamine. Lavere molekylvekt dextrans ikke skille de tre moduser av vaskulær permeabilitet. Vår tidligere erfaring har indikert at den systemiske sirkulasjonen av 155 kDa TMR-Dextran effektivt merket blodkar av både normalt vev, slik som bryst kjertel og lunger (figur 2A, B), så vel som av neoplastic vev, slik som brystkreft og brystkreft metastaser i lungene (figur 2C, D). Som også bekreftes av tidligere studier5,46, 155 KDA TMR-Dextran er således en passende sonde for å måle "sprengning" i både primære og sekundære tumor nettsteder. Et karakteristisk eksempel på peak sprengning aktivitet (prikkete gult område), bruker multiphoton intravital Imaging i en primær MMTV-PYMT bryst tumor er illustrert som en serie av stillbilder (Figur 3a). Sprengning aktivitet var alltid bemerket i samarbeid med en TMEM døråpning (prikkete hvit sirkel), karakterisert ved den romlige sidestilling av en Dendra2+ tumor celle en CFP+ macrophage og endotelet (Figur 3a). Som nevnt, hver TMEM døråpning består av en inflammasjon macrophage, en Mena overexpressing tumor celle, og en endothelial celle, alt i direkte fysisk kontakt med hverandre. Mens Mena ikke har vært eksplisitt merket i musemodeller som brukes i disse eksperimentene, har det tidligere vist seg å bli overexpressed i slutten av stadiet PyMT kreft47. Dette forenkler identifisering av TMEM døråpninger og eliminerer behovet for å eksplisitt merke Mena i tumorceller.

For å vurdere TMEM-avhengige vaskulær permeabilitet i fast vev analyse, utførte vi prosedyren beskrevet i denne protokollen i mus som ble transplantert med tumor biter Hentet fra 14-ukers gamle MMTV-PyMT donor mus. Når mus nådde en passende tumor størrelse, fikk de en enkelt IV dose av 155-kDa TMR-Dextran, som beskrevet i del 2 av denne protokollen, og ble ofret etter 1 time. Tumorvevet ble samlet og utsatt for IF analyse. Det endomucin fluorescerende signalet ble brukt som en ekskluderings maske til det dextran fluorescerende signalet, noe som åpner for diskriminering mellom svært gjennomtrengelig og lav, eller ikke-gjennomtrengelig, blodkar (Figur 3B). Som tidligere beskrevet i Karagiannis et al.48, ble et sekvensielt lysbilde også farget med den tidligere etablerte TMEM trippel flekken og justert med det tilsvarende IF-lysbildet. Ved hjelp av denne tilnærmingen, bekreftet vi at svært gjennomtrengelig blodkar i brystet tumor vev har minst én tilknyttet TMEM døråpning (Figur 3B).

Figure 1
Figur 1 . Sammendrag av prosedyren. (A) Dendra-2 merket invasiv kreft i brystet (grønn) tatt fra et transgene dyr [FVB/N-TG (MMTV-PyMT) mul-TG (MMTV-iCre) JWP-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP] og skåret i små biter. En brikke blir deretter orthotopically transplantert inn i en annen transgene dyr som makrofager ble merket med cyan fluorescerende protein (cyan) [FVB/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. Den orthotopically transplantert til tumor er da lov til å vokse, hvoretter musen er allokert til riktig behandling arm. (B) når behandlingen er ferdig, blir musen tatt for intravital bildebehandling. Når anesthetized, en hud klaff kirurgi utføres deretter stabilisert med en gummi bakside. En grunne Imaging vindu er så festet over svulsten. Til slutt blir musen deretter plassert på mikroskopet scenen der vinduet passer inn i skreddersydde scenen plate og bildene kan da bli ervervet. (C) Alternativt, musen fra A administreres høy molekylvekt dextran og ofret etter 1 time. Svulsten blir deretter fjernet, reparert og behandlet for para fin innebygging. Deler av vevet er kuttet, beiset for TMEM i IHC og dextran og fartøy i IF, og skannes på en digital hele lysbilde scanner. Endelig er bilder fra de to skanninger justert og individuelle visningsfelt er valgt for analyse og kvantifisering av vaskulær lekkasje. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Visualisering av TMR-Dextran merket blodkar i friske og syke vev. (A) bilde av en sunn bryst kjertel i et transgene dyr hvis blodkar er merket av TMR-Dextran (rød), bryst ductal epitel merket av fluorescerende protein Dendra-2 (grønn), og makrofager merket med en cyan fluorescerende proteiner (blå) [FVB/N-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. (B) sunt lunge vev kan visualisere gjennom et lunge bilde vindu innenfor en mus som blodkar er merket med TMR-Dextran (rød). Blå = SHG fra kollagen fibre. (C) Dendra2 merket invasiv ductal kreft tatt fra et transgene dyr [FVB/N-TG (MMTV-PyMT) mulxTg (MMTV-iCre) JWP-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP] og orthotopically transplantert inn i en annen transgene dyr hvis makrofager er merket med cyan fluorescerende protein (blå) [FVB/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) og fartøy merket med TMR-Dextran (rød). (D) lunge metastaser åtte dager etter intravenøs injeksjon av tumorceller (E0771; merket av fluorescerende protein kløver) til et transgene dyr der makrofager er merket med cyan fluorescerende protein (cyan) [FVB/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) ] og blodkar merket med TMR-Dextran (rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Visualisering av TMEM-mediert vaskulær permeabilitet bruker intravital Imaging og fast vev analyse. (A) stillbilder fra en tid-bortfalt intravital Imaging film av 155-KDA TMR-Dextran merking av neo-angiogenic fartøy (Red) innenfor en Dendra-2 merket invasiv kreft av brystet (grønn) tatt fra et transgene dyr [FVB/N-TG (MMTV-PyMT) mul-TG (MMTV-iCre) JWP-TG (loxP-Stop-loxP-Pdendra2) JWP] og orthotopically transplantert inn i et annet transgene dyr der makrofager ble merket av cyan fluorescerende protein (cyan) [FVB/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. Den stiplede gule linjen betegner omrisset av det forbigående vaskulære lekkasje området før (t = 0 '), under (t = 17) og etter (t = 52 ') lekkasje (sprengning) hendelsen. Den stiplede hvite sirkelen peker på en TMEM døråpning, som fanget i live Imaging. (B) flerkanals Immunofluorescence av Endomucin (første kolonne), 155-KDA DEXTRAN-TMR (andre kolonne), deres sammenslåtte bilde sammen med DAPI (tredje kolonne), thresholded blodkar og ekstravaskulær dextran masker (fjerde kolonne), og tilsvarende sekvensielle delen av TMEM IHC (femte kolonne) i MMTV-PyMT mus. Øverste rad: vaskulær profil vekk fra TMEM, vises som en "ikke-lekk" vaskulær profil. Nederste rad: TMEM-assosiert vaskulær profil, vises som en "lekk" vaskulær profil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her skisserer vi to protokoller som kan brukes til å visualisere og kvantifisere en bestemt type vaskulær permeabilitet som er til stede ved TMEM døråpninger og er forbundet med avbrudd av vaskulær stramt og adherens veikryss. Denne type vaskulær permeabilitet er forbigående og kontrollert av tre parts TMEM celle kompleks, som forklart over5. Evnen til å identifisere og kvantifisere TMEM-assosiert vaskulær permeabilitet er avgjørende for vurderingen av en Pro-metastatisk kreftcelle mikromiljøet, så vel som for pre-kliniske studier som undersøker effekten av konvensjonelle cytotoksisk terapier på tumor mikromiljøet, så vel som anti-metastatisk potensiale for målrettede og ikke-målrettede terapier. Viktigere, demonstrerte vi her at denne vurderingen kan gjøres ved enten intravital Imaging eller immunofluorescence i fast vev. Begge tilnærminger har sine fordeler og ulemper. Intravital Imaging tillater direkte visualisering av den dynamiske prosessen med vaskulær permeabilitet, men krever spesialisert utstyr og trening. På den annen side, immunofluorescence utført i faste vev tilbyr bare et statisk bilde, men kan rutinemessig utføres i de fleste laboratorier.

Kreftpasienter er ofte behandlet med noen form for systemisk terapi, og suksessen til systemisk behandling er vanligvis vurdert av evalueringen av parametre knyttet til kreftcelle overlevelse som apoptose, spredning, eller brutto tumor størrelse. Det er imidlertid like viktig å forstå hvordan disse systemiske behandlingene påvirker kreftcelle formidling gitt at de fleste kreft relaterte dødelighet oppstår på grunn av metastasering, en prosess som innebærer både kreftcelle spredning samt kreftcelle formidling1. For eksempel har nyere studier vist at kjemoterapi kan indusere en betydelig økning i tettheten av TMEM døråpninger i mus og menneskelig brystkreft48,49. Videre ble det vist at kjemoterapi induserer TMEM aktivitet og resultater i hematogenous formidling av kreftceller, økt sirkulerende kreftceller, og økt lunge metastasering48. Kjemoterapi-indusert økning i TMEM aktivitet kan blokkeres ved systemisk administrasjon av stoffet som hemmer TIE2 funksjon og derfor TMEM aktivitet, kalt rebastinib14,48. Dermed kan protokollene som er beskrevet her, tilby verdifulle ende punkts målinger for effekten av ulike systemiske behandlinger på TMEM aktivitet gjennom sammenligningen av behandlet til ikke-behandlede kohorter av mus.

I de senere årene, begrepet antiangiogen terapi i kreft har vært Revisited, noe som tyder på at en vaskulær "normalisering" strategi (dvs. forbigående rekonstituering av unormal struktur og funksjon av blodkar), kan være å foretrekke å målrette blodkar for ødeleggelse, da det gjør neovasculature mer effektivt for legemiddellevering50,51,52,53,54. I lys av denne nye hypotesen, har andre grupper også utviklet analyser for å vurdere vaskulær permeabilitet og for å teste effektiviteten av vaskulær normalisering strategier55. Det bør nevnes at i prinsippet er disse metodene benyttes for å vurdere TMEM-uavhengige moduser av vaskulær permeabilitet. Derfor, valg av de mest hensiktsmessige vaskulær permeabilitet analysen avhenger av omfanget av en studie, og forskere må sørge for at de forstår anvendelsen av hver av de publiserte vaskulær permeabilitet analyser, før du bruker dem til deres Studier.

Som nevnt ovenfor, hver av de to metodene som er beskrevet her har visse fordeler over den andre. For eksempel, å måle "sprengning permeabilitet" in vivo gir verdifull kinetisk informasjon, men siden sprengning er en sjelden hendelse, langvarig bildebehandling økter på flere timer hver kan være nødvendig for å kunne skaffe tilstrekkelige data. I tillegg krever intravital avbildning spesialisert utstyr som kanskje ikke er tilgjengelig for alle undersøkere. På den annen side er evaluering av TMEM aktivitet i fast vev relativt enkel å utføre og krever bare standard laboratorieutstyr. I tillegg er analysen av TMEM aktivitet i fast vev lettere å tolke, men mangler kinetisk informasjon. Videre er den faste vev analysen mindre spesifikk, siden det kan fange kumulativ lekkasje av dextran over tid fra transcellular og paracellular vaskulær permeabilitet av intakt endothelia, eller til og med en plutselig lekkasje hendelse på grunn av spontan vaskulær skade. Dermed vil synergi bruken av de to metodene gjøre tolkningen av TMEM-mediert vaskulær permeabilitet mer spesifikk og mer følsom. Selv om vi ikke har eksplisitt testet andre anvendelser av teknikkene som presenteres her, kan de vise seg nyttig for å undersøke indusert fartøy permeabilitet, for eksempel ved infeksjon eller ved farmasøytiske terapier.

Oppsummert måling av TMEM-assosiert vaskulær permeabilitet, som skissert av to uavhengige metoder her, gir nyttig verktøy for å vurdere Pro-metastatisk tumor mikromiljøet og tilhørende TMEM aktivitet, og kan brukes til noen grad av et laboratorium. Disse metodene er spesielt nyttig i den pre-klinisk vurdering av effekten av systemiske behandlinger på kreftcelle formidling. I tillegg kan de brukes til å vurdere effekten av agenter som kan blokkere kjemoterapi-indusert TMEM aktivitet, og til slutt, kan disse metodene brukes til å vurdere den beste kombinasjonen terapi foregående fase I pasient prøvelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne avslører ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Analytical Imaging Facility (AIF) i Albert Einstein College of Medicine for Imaging støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 og CA216248), den SIG 1S10OD019961-01, den Gruss-Lipper Biofotonikk Center og integrert Imaging program, og Montefiore ' s Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant av kirurger for studiet av tumor Mikromiljøet (CA200561).

GSK co-skrev manuskriptet, utført Imaging for figur 1C og 3b, utviklet fast vev analyse protokoll, og analysert og tolket alle data; Jmp co-skrev manuskriptet, og utførte kirurgi og intravital Imaging for figur 1B, 2C og 3a; LB & AC utførte kirurgi og intravital Imaging for figur 2b; RJ utførte operasjonen og intravital avbildning for figur 2a; JSC co-skrev manuskriptet og analysert og tolket alle data; MHO co-skrev manuskriptet og analysert og tolket alle data; og de utførte kirurgi og intravital Imaging for figur 2D, co-skrev manuskriptet, utviklet fast vev analyse og intravital Imaging protokoller, og analysert og tolket alle data.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Tags

Tilbaketrekking intravital Imaging immunofluorescence blod fartøy permeabilitet tumor mikromiljøet av metastasering (TMEM) høy molekylvekt dextran immunofluorescence metastasering
Vurdere tumor Mikromiljøet av metastasering døråpning-mediert vaskulær permeabilitet forbundet med kreft Cell formidling bruker Intravital Imaging og fast vev analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J.… More

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter