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Cancer Research

Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59633
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Summary

Descriviamo due metodi per valutare la permeabilità vascolare transitoria associata al microambiente tumorale della funzione di metastasi (TMEM) e all'intravasazione delle cellule tumorali utilizzando l'iniezione endovenosa di peso molecolare elevato (155 kDa) dextran nei topi. I metodi includono l'imaging intravitale in animali vivi e l'analisi dei tessuti fissi utilizzando l'immunofluorescenza.

Abstract

La causa più comune della mortalità correlata al cancro è la metastasi, un processo che richiede la diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario ai siti secondari. Recentemente, abbiamo stabilito che la diffusione delle cellule tumorali nel cancro mammario primario e nei siti metastatici nel polmone si verifica solo nelle porte chiamate Microambiente tumorale di Metastasi (TMEM). Il numero di porta TMEM è prognostico per una recidiva a distanza di malattia metastatica nei pazienti affetti da cancro al seno. Le porte del TMEM sono composte da una cellula tumorale che esprime eccessivamente la proteina regolatore di actina Mena a diretto contatto con un macrofago perivascolare e proangiogenico che esprime alti livelli di TIE2 e VEGF, dove entrambe le cellule sono strettamente legate a un sangue cellula endoteliale della nave. Le cellule tumorali possono invadere attraverso le porte TMEM a causa della permeabilità vascolare transitoria orchestrata dall'attività congiunta del macrofagio associato al TMEM e della cellula tumorale che esprime Mena associata al TMEM. In questo manoscritto vengono descritti due metodi per la valutazione della permeabilità vascolare transitoria mediata tramite TMEM: l'imaging intravitale e l'immunofluorescenza dei tessuti fissi. Anche se entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e svantaggi, la combinazione dei due può fornire le analisi più complete della permeabilità vascolare mediata da TMEM e dei prerequisiti microambientali per la funzione TMEM. Poiché il processo metastatico nel cancro al seno, e possibilmente altri tipi di cancro, coinvolge la diffusione delle cellule tumorali attraverso porte TMEM, è essenziale impiegare metodi ben consolidati per l'analisi dell'attività delle porte TMEM. I due metodi qui descritti forniscono un approccio globale all'analisi dell'attività della porta TMEM, sia in animali ingenui che farmacologicamente trattati, il che è di fondamentale importanza per le sperimentazioni precliniche di agenti che prevengono le cellule tumorali diffusione tramite TMEM.

Introduction

I recenti progressi nella nostra comprensione della metastasi tumorale hanno scoperto che la transizione epiteliale-mesenchy (EMT) e l'induzione di una sottopopolazione di cellule tumorali migratorie/invasive non sono, di per sé, sufficienti per la diffusione ematogena 1. Infatti, in precedenza si pensava che metastasizzare le cellule tumorali intravasi attraverso l'intero endotelio associato al cancro, poiché la neovasculatura tumorale è spesso caratterizzata da una bassa copertura pericita, e come tale, è altamente permeabile e instabile2,3,4. Anche se altamente suggestivo di funzioni difettose all'interno del tumore, le modifiche vascolari durante la carcinogenesi non forniscono la prova di per sé che le cellule tumorali possono penetrare i vasi sanguigni facilmente e in modo incontrollato. Gli studi sull'imaging intravitale (IVI), in cui le cellule tumorali sono etichettate fluorescenti e la vascoliera è etichettata tramite l'iniezione endovenosa di sonde fluorescenti (come dextran o punti quantici), mostrano che, mentre i vasi tumorali sono uniformemente permeabile a basso peso molecolare dextrans (ad es. 70 kD), dextrans ad alto peso molecolare (155 kD) e le cellule tumorali possono attraversare l'endotelio solo in siti specializzati di intravasazione che sono preferibilmente situati al punto di diramazione vascolare5, 6 È possibile: , 7.Le analisi immunoistochimiche (IHC) utilizzando modelli animali e materiale di origine del paziente umano hanno dimostrato che questi siti sono "porte" specializzate nella regolazione della permeabilità vascolare, localmente e transitoriamente, fornendo una breve finestra di l'opportunità per le cellule tumorali migratorie/invasive di entrare nella circolazione. Queste porte sono chiamate "Microambiente tumorale di Metastasi" o "TMEM" e, molto a quanto pare, la loro densità è correlata a un aumento del rischio di sviluppare malattie metastatiche nei pazienti con cancro al seno8,9, 10.

Ogni porta TMEM è costituita da tre tipi distinti di cellule: un macrofago perivascolare, una cellula tumorale che sovraesprime il mammifero proteico actin-regulatory abilitato (Mena) e una cellula endoteliale, il tutto in contatto fisico diretto tra loro1, 5,9,10,11,12,13. L'evento chiave per la funzione del TMEM come porta d'intravasamento è il rilascio localizzato del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sulla nave sottostante dal macrofaage perivascolare14. VEGF può interrompere le giunzioni omotipiche tra le cellule endoteliali15,16,17,18,19, un fenomeno che si traduce in perdite vascolari transitorie, anche noto come "bursting" permeabilità come descritto negli studi IVI 5. I macrofagi TMEM hanno dimostrato di esprimere il recettore della chinasi tirosina TIE2, che è necessario per la funzione TMEM mediata dal VEGF e l'homing di questi macrofagi alla nicchia perivascolare5,20,21 , 22.Oltre a regolare la diffusione e la metastasi delle cellule tumorali, è stato dimostrato che i macrofagi TIE2sono stati regolatori centrali dell'angiogenesi tumorale21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Come tale, i macrofagi TIE2 rappresentano un costituente critico del microambiente tumorale e il principale regolatore della cascata metastatica.

Per concettualizzare meglio la permeabilità vascolare mediata da TMEM (cioè "bursting"), è molto importante distinguerla da altre modalità di permeabilità vascolare che non sono associate alla dissoluzione delle giunzioni endoteliali cellula-cellula. In un endotelio intatto (uno le cui giunzioni strette e aderenti non sono interrotte), ci sono tre tipi principali di permeabilità vascolare: (a) pinocytosi, che può, o non può, essere accoppiato alla transcitosi del materiale ingerito; b) trasporto di materiale attraverso fenestrae endoteliali; e (c) trasporto di materiale attraverso il percorso paracellulare, che è regolato da giunzioni strette endote15,16,17,18,19,32 , 33 Mi lasa , 34.Sebbene deregolamentati in molti tumori, i suddetti modi di permeabilità vascolare sono stati descritti principalmente nel contesto della normale fisiologia tissutale e dell'omeostasi, i cui estremi sono tessuti con permeabilità limitata ( ad esempio, barriera emato-encefalica, barriera emato-prova), o abbondante permeabilità (ad esempio, capillari fenestrated dell'apparato glomerare renale)34,35,36,37.

Utilizzando l'imaging intravitale multifotone e la microscopia a immunofluorescenza multiplexata, siamo in grado di distinguere tra permeabilità vascolare mediata da TMEM ("bursting") e altre modalità di permeabilità vascolare nei tumori al seno. Per raggiungere questo obiettivo, eseguiamo una singola iniezione endovenosa di una sonda ad alto peso molecolare, con etichetta fluorescente nei topi. Gli eventi di scoppio spontaneo possono quindi essere catturati utilizzando l'imaging intravitale nei topi vivi; o, in alternativa, l'stravaganza della sonda può essere quantificata mediante studi di co-localizzazione convascolarizzazione del sangue (ad es. porte CD31 o Endomucin ) e TMEM utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. I protocolli qui presentati descrivono entrambe queste tecniche, che potrebbero essere utilizzate in modo indipendente o in combinazione tra loro.

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Protocol

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali vivi devono essere condotti in conformità con le linee guida e le normative sull'uso degli animali e per la cura. Le procedure descritte in questo studio sono state eseguite in conformità con le normative nazionali di salute riguardanti la cura e l'uso di animali sperimentali e con l'approvazione dell'Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use (IACUC).

1. Valutazione della "permeabilità" utilizzando l'imaging animale vivo

  1. Trapianto di tumori sinogenici al seno in host di topi con macrofagi fluorescenti
    1. Generare pezzi di tessuto tumorale adatti per il trapianto.
      1. Generare tumori fluorescenti in modelli di cancro mammario dei topi incrociando i spontanei, autoctonosi, modello di cancro della mamma geneticamente ingegnerizzata MMTV-PyMT topi con topi transgenici che esprimono reporter fluorescenti38, 39 [ad esempio, proteina fluorescente verde potenziata (EGFP), proteina fluorescente ciana learizza migliorata (ECFP) o Dendra2].
      2. Lasciare che i topi MMTV-PyMT con tumori fluorescenti etichettati crescano fino a una dimensione non superiore a 2 cm (circa 10-12 settimane di età).
      3. Eutanasia il tumore recante topi MMTV-PyMT mettendoli in una camera con 5% isoflurane fino a 30 secondi dopo tutte le respirazioni si fermano.
      4. Eseguire una lussazione cervicale.
      5. Rimuovere i capelli dall'addome del topo eutanasia utilizzando una crema depilatoria topica.
      6. Posizionare un piatto Petri con un mezzo di coltura cellulare DMEM/F12 sul ghiaccio.
      7. Posizionare il mouse e il piatto Petri sul ghiaccio nella cappa dei fumi.
      8. Sanificare l'addome del topo con il 70% di alcool etilico.
      9. Utilizzando guanti sterili e strumenti chirurgici (forbici sterilizzate, pinze e lama) rimuovere i tumori e metterli nel piatto Petri.
      10. Tagliare il tumore a pezzettini (2 mm x 2 mm x 2 mm), scartando tutte le porzioni necrotiche, mentre sono nel piatto Petri.
    2. Trapianto i pezzi di tumore in host ricandanti.
      1. Sollevare i topi con macrofagi geneticamente progettati con etichettafluere, ad esempio i topi MacGreen40 o MacBlue 41 (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Lasciare che i topi FVB con macrofagi etichettati fluorescentmente crescano fino a un'età di 4-6 settimane).
      3. Anestesizzai i topi FVB con macrofagi fluorescenti etichettati in una camera utilizzando il 5% di isoflurane con ossigeno come gas trasportatore.
      4. Riduci l'anestesia al 3% di isoflurane e applica unguento oftalmico agli occhi del topo per evitare l'essiccazione.
      5. Rimuovere i capelli da sopra la ghiandola mammaria 4th del mouse.
      6. Pulire la pelle con betadine. È importante mantenere condizioni sterili per tutto il resto della procedura. Ciò include l'utilizzo di strumenti sterilizzati e reagenti.
      7. Fare una piccola incisione 2-3 mm appena inferiore al 4th capezzolo.
      8. Disseta fino a quando il cuscinetto di grasso mammario è esposto.
      9. Prendi un pezzo di tumore dalla parabola Petri e cappotto in matrice extracellulare artificiale.
      10. Tumori trapiantati sotto il cuscinetto di grasso mammario 4 th.
      11. Chiudere l'incisione con adesivo cianoacrilato.
      12. Monitorare continuamente l'animale fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia ed è in grado di mantenere la recumbency sternale. Inoltre, non riportare l'animale alla compagnia di altri animali fino al pieno recupero.
      13. Per ridurre al minimo le infezioni, aggiungere 1 mL di 100 mg/mL di enrofloxacin antibiotico alla bottiglia di acqua potabile dell'animale (8 fl oz).
      14. Permettere ai tumori di crescere fino palpabile (5 mm; 4 settimane).
      15. A seconda dell'esperimento, allocare i topi in gruppi di trattamento ed eseguire i trattamenti corrispondenti, se applicabile.
  2. Configurazione per l'imaging intravitale
    1. Accendi il laser e i rilevatori a due fotoni del microscopio.
    2. Accendere la scatola di riscaldamento e preriscaldare lo stadio x-y del microscopio.
    3. Posizionare l'inserto dello stage su misura42 nello stage x-y.
  3. Preparazione della finestra di imaging
    1. Prima di eseguire la configurazione per la creazione di immagini, autoclave la cornice42della finestra di imaging circolare su misura.
    2. Utilizzare una pipetta o una siringa di insulina per posizionare un sottile strato di adesivo cianoacrilato al telaio della finestra e all'affisso in posizione un vetro di copertura circolare di 8 mm.
      NOTA: 1) È importante evitare di ottenere residui sull'apertura chiara del vetro di copertura. 2) È importante aderire il vetro di copertura al telaio della finestra almeno 1 h prima dell'uso per l'imaging.
    3. Pulire con attenzione l'eccesso di cianoacrilato sulla chiara apertura del vetro di copertura utilizzando una salvietta da laboratorio bagnata con una piccola quantità di acetone.
  4. Preparazione del catetere della vena della coda per la somministrazione di fluidi e coloranti fluorescenti durante l'imaging
    1. Tagliare un pezzo di tubo di polietilene di 30 cm per costruire un catetere della vena della coda.
    2. Staccare la porzione dell'ago di un ago da 30 G dal suo cono Luer piegando delicatamente l'ago avanti e indietro fino a rompersi.
      NOTA: L'ago deve essere tenuto vicino al cono Luer e non alla punta dell'ago. Questo può essere eseguito con pinze o pinze per afferrare l'ago al fine di prevenire la lesione del bastone dell'ago.
    3. Inserire l'estremità smussata dell'ago in un'estremità del tubo in polietilene.
    4. Inserire l'estremità affilata di un altro ago da 30 G, mantenendo il suo cono Luer attaccato, all'estremità opposta del tubo.
    5. Riempire una siringa da 1 cc con una salina tamponata di fosfato, collegarla al cono Luer del catetere assemblato e lavare il catetere della vena posteriore assicurandosi che non ci siano bolle d'aria nel sistema.
    6. Per l'etichettatura vascolare, riempire una siringa da 1 cc con 100 litri da 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) o punti quantici.
  5. Preparazione del mouse per l'imaging
    1. Anestesizzail topo in una gabbia sotto (1 piede sotto) una lampada termica utilizzando il 4%-5% di isoflurane mescolato con il 100% di ossigeno impostato su un flusso di 1,5-2 L al min.
    2. Accendere la lampada termica sull'area di lavoro chirurgica. Questo passaggio è fondamentale per mantenere la temperatura corporea fisiologica del topo durante l'intervento chirurgico.
    3. Posizionare il mouse sotto la lampada termica e abbassare l'anestesia al 2%-3% per tutta la durata dell'intervento.
      NOTA: Assicurarsi di tenere la lampada termica a distanza di sicurezza (1 piede) lontano dal mouse per evitare il surriscaldamento.
    4. Posizionare unguento oftalmico sugli occhi del mouse per evitare l'essiccazione degli occhi e la cecità.
    5. Verificare che il mouse sia anetizzato eseguendo il test del ditadei alla toe. Se l'animale si ritira, aumentare il dosaggio di isoflurane dell'1% e riprovare in 1-2 min.
    6. Inserire il catetere della vena posteriore nel punto più disfatto possibile sulla coda.
    7. Apporre il catetere della vena posteriore alla coda con un piccolo pezzo di nastro da laboratorio che avvolge intorno alla coda e si attacca all'ago per assicurare che non venga sloggiato.
    8. Iniettare 50 L per h di PBS attraverso il catetere della vena posteriore per fornire un'adeguata idratazione. È fondamentale evitare di iniettare troppo fluido (non più di 200 l per h) o di eventuali bolle nel catetere in quanto questo può essere fatale per il mouse.
    9. Rimuovere i capelli sull'addome sopra le ghiandole mammarie 4th e 5th con crema depilatoria.
    10. Pulire la pelle con betadine e lasciare asciugare la pelle.
    11. Fare un'incisione longitudinale della linea mediana partendo immediatamente superiore ai genitali e portare l'incisione fino al livello dell'aspetto superiore della ghiandola mammaria 4th.
    12. Portare l'incisione trasversale all'aspetto superiore della ghiandola mammaria 4th. È fondamentale evitare di compromettere l'afflusso di sangue a questo punto.
    13. Dissezionare il tampone di grasso mammario dal peritoneo creando un lembo di tessuto utilizzando pinze sterili e forbici.
      NOTA: l'imaging del lembo della pelle è suscettibile a significativi artefatti di movimento e disidratazione dei tessuti. Questi sono evitati, come descritto in precedenza43,44, da apposto un pezzo rigido di gomma dietro al lato della pelle del lembo (per irrigidire il tessuto molle e isolarlo dal resto del corpo) e quindi mettendo il tumore in un imaging superficiale per preservare l'idratazione. Questo è fondamentale per l'imaging stabile come il tumore e tessuto circostante in questo ambiente sono molto conformi.
    14. Stabilizzare il lembo della pelle apponendo (con colla cianoacrilata) un piccolo pezzo di gomma rigida che misura 2 cm x 2 cm sul lato della pelle del lembo. Il tumore dovrebbe essere al centro dell'area in fase di stabilizzazione dalla gomma.
    15. Mantenere i tessuti esposti idratati con gocce di PBS.
    16. Applicare una piccola pellicola di cianoacrilato sul bordo esterno del telaio della finestra di imaging su misura.
    17. Applicare una piccola goccia di PBS (10-20 dollari) al centro del vetro di copertura.
    18. Asciugare il tessuto lembo circostante con una salvietta di laboratorio. È fondamentale assicurarsi che il cianoacrilato sul telaio della finestra non entri in contatto con il PBS sul vetro, in quanto ciò può causare il cianoapplicando al polimerizzare e impostare prematuramente.
    19. Apporre la piccola finestra di imaging al lembo del tessuto con il tumore al centro dell'apertura chiara.
    20. Rimuovere la scatola di riscaldamento dallo stage.
    21. Trasferire il catetere della vena del topo e della coda a cui è anpitizzato allo stadio del microscopio. Prestare estrema cautela per garantire che il catetere della vena della coda non cada.
    22. Posizionare il mouse sullo stage nella posizione prona.
    23. Posizionare il cono naso di isoflurane sopra il muso per garantire il mantenimento dell'anestesia.
    24. Inserire la finestra nel foro sulla piastra personalizzata x-y.
    25. Riposizionare la scatola di riscaldamento sullo stage per mantenere una temperatura fisiologica.
    26. Monitora i segni vitali dell'animale collegando una sonda ossimetrica a impulsi tramite sensore di clip alla zampa posteriore.
    27. Lentamente diminuire isoflurane a 0.5%-1% per mantenere un adeguato flusso sanguigno ed evitare oltre l'anestesizzazione del mouse.
  6. Immagini intravitali
    NOTA: L'imaging che descriviamo in questa sezione è stato eseguito su un microscopio multifotoino a due laser personalizzato, precedentemente descritto5,39,45. In breve, un laser a femtosecondi viene utilizzato per generare 90 luce laser pulsata a femtosecondo centrata a 880 nm. La luce della fluorescenza viene rilevata con tre dei quattro rilevatori che acquisiscono simultaneamente (Blu - 447/60, Verde 520/65 e Rosso 580/60; lunghezza d'onda/larghezza di banda centrale) dopo la separazione dalla luce di eccitazione da parte di un dichroico (Chroma, 720DCXXR). Il supporto per il microscopio contiene una lente obiettivo da 25x, 1,05 NA (apertura numerica) a lunga distanza di lavoro (2 mm). È importante notare che, mentre abbiamo usato un microscopio personalizzato, il protocollo descritto di seguito può essere realizzato anche su qualsiasi microscopio multifoton disponibile in commercio.
    1. Posizionare una goccia di acqua distillata tra l'obiettivo del microscopio 25x, 1,05 NA e il vetro di copertura della finestra per effettuare un contatto ottico.
    2. Utilizzare l'oculare al microscopio per mettere a fuoco le aree con cellule tumorali fluorescenti vicino alla superficie della finestra.
    3. Trova vasi sanguigni che scorrono ed etichettati macrofagi. È fondamentale avere vasi sanguigni che scorrono per valutare la dinamica della vascolatura.
    4. Cambia il microscopio in modalità multifotone.
    5. Impostare i limiti superiore e inferiore di una serie z, che misura circa 50 m.
      1. Impostare il limite superiore della serie z utilizzando il regolatore di messa a fuoco per spostare l'obiettivo nella posizione di partenza desiderata, nella posizione più superficiale, e contrassegnando questa posizione come zero all'interno del software facendo clic sul pulsante In alto della posizione.
      2. Impostare il limite inferiore della serie z spostando l'obiettivo verso lo strato più profondo (in genere 50-70 m dall'alto per i tumori più piccoli) e facendo clic sul pulsante In basso della posizione di posizione.
      3. Impostare la dimensione del passo z su 5 m.
    6. Fare clic sul pulsante del pannello Time-Lapse e impostare l'intervallo di tempo tra le acquisizioni ad almeno 10 s per fornire un tempo adeguato per ricostituire l'acqua sopra l'obiettivo. Questo viene fatto manualmente con una pipetta di compressione sull'obiettivo durante il lungo lasso di tempo.
    7. Rimuovere la siringa con PBS nel catetere della vena posteriore e sostituirla con un'altra siringa contenente il 155 kDa dextran-TMR (rhodamina tetrametile).
    8. Iniettare 100 luna di 155 kDa dextran-TMR attraverso la vena posteriore.
    9. Dopo l'iniezione, sostituire la siringa TMR con la siringa PBS.
    10. Acquisire un'immagine time-lapse z-stack facendo clic sui pulsanti z-Stack e Time-Lapse, quindi facendo clic sul pulsante di registrazione.
    11. Iniettare 50 l di PBS ogni 30-45 min per mantenere un'adeguata idratazione dell'animale. Evitare di iniettare più di 200 l al momento in quanto ciò può causare sovraccarico di liquidi.
  7. eutanasia
    1. Aumentare l'isoflurane al 5% e mantenere l'animale al di sotto del 5% dell'isoflurane con il cono naso in posizione fino a 30 s dopo che le respirazioni cessano.
    2. Rimuovere il mouse dallo stage.
    3. Eseguire lussazione cervicale.
  8. Elaborazione delle immagini
    1. Caricare tutte le immagini in ImageJ e formattarle in un hyperstack bidimensionale (x, y, z, t e canale di colore).
    2. Eseguire la separazione della sovrapposizione spettrale (ad esempio: GFP e CFP) e l'eliminazione della deriva x-y dagli iperstack utilizzando i metodi stabiliti38.
    3. Utilizzare la regolazione della luminosità e del contrasto per aumentare il livello bianco del canale sanguigno in modo che il segnale di sfondo diventi visibile.
    4. Per ogni fetta z, ispezionare attentamente ogni film per i segni di perdita vascolare transitoria (una "burst"). L'esecuzione dei filmati a frame rate veloce (40 fps) può aiutare questa identificazione.
    5. Una volta identificato un burst, riportare la luminosità di questo canale a un livello normale e ritagliare l'iperpilato in questa regione e z-slice.

2. Valutazione del dextran extravascolare mediante l'analisi dei tessuti fissi

  1. Preparazione del tumore e del campione
    NOTA: La seconda parte di questo protocollo presuppone che i tumori al seno siano stati raccolti da un modello di topo di trapianto ortotopico di carcinoma mammario (cioè il MMTV-PyMT). Questo modello potrebbe essere lo stesso descritto nella parte 1st del protocollo, anche se i tumori fluorescenti non sono necessari a questo punto.
    1. Dopo la cessazione della conduttura sperimentale (cioè trattamenti farmacologici, ecc.), eseguire un'iniezione di coda-vain di 100 - L di 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetramethyl rhodamine, 1 h prima di sacrificare i topi.
    2. Sacrificare i topi e raccogliere i tumori al seno.
    3. Fissare i tumori in formalina 10% per 48-72 h e procedere all'incorporamento della paraffina.
    4. Utilizzando un microtome, tagliare due vetrini sequenziali spessi 5 m dai tessuti incorporati in paraffina (FFPE) fissi in formalina. Una diapositiva viene utilizzata per colorare il dextran, mentre l'altra verrà utilizzata per eseguire Il triplo IHC TMEM, come riferimento.
      NOTA: Il protocollo TMEM triplo immunohistochimico è stato descritto altrove 10.
  2. IF colorazione e scansione per la prima delle due sezioni sequenziali
    1. Inviare le diapositive a un protocollo di de-paraffinazione standard. Questo include due immersioni successive nello xilene (10 min ciascuno), seguite dalla disidratazione nelle soluzioni alcoliche diluite in serie (100%, 95%, 70% e 50% EtOH in H2O per 2 min ogni immersione).
    2. Eseguire il recupero dell'antigene riscaldando (vicino al punto di ebollizione) le sezioni sommerse nel citrato (pH 6.0-regolato) per 20 min.
    3. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 15-20 min e poi lavare in PBS 3x per 2 min ogni lavaggio.
    4. Blocco per 60-90 min nel buffer di blocco (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% gelatina di pelle di pesce; 0.05% PBST, vale a dire PBS con 0.05% Tween-20).
    5. Incubare campioni con una miscela di anticorpi primari di ratto e coniglio che colpiscono endomucina e TMR, rispettivamente, e poi lavare in PBST 3x, 2 min ciascuno.
    6. Incubare campioni con una miscela di anticorpi secondari dell'asino contro ratto IgG (coniugato ad Alexa-647) e coniglio IgG (coniugato ad Alexa-488), quindi lavare in PBST 3x 2 min ciascuno.
    7. Eseguire una colorazione DAPI di routine (cioè immersione nella soluzione DAPI per 5-6 min), montare i vetrini utilizzando un supporto di montaggio "duro" senza glicerolo e conservare in un luogo buio fino alla scansione.
    8. Per ottenere risultati ottimali, eseguire la scansione delle diapositive su uno scanner digitale per diapositive intero.
  3. Analisi dell'immagine
    1. Cattura 10 campi ad alta potenza (HPF) per caso, utilizzando qualsiasi software adatto per la patologia digitale.
    2. Salvare i canali Endomucin (rosso) e TMR (verde) separatamente come TIFF.
    3. Utilizzando ImageJ, caricare i file TIFF e convertirli in immagini a 8 bit.
    4. Soglia le immagini a 8 bit al livello del controllo negativo e genera due immagini binarizzate, mostrando le "maschere" Endomucin e TMR.
    5. Dagli strumenti binari, selezionare Fori di riempimento sulla maschera Endomucina.
    6. Generare e salvare le seguenti cinque aree di interesse: 1) L'immagine dextran con soglia come "Dextran ROI" (ROI1), 2) l'immagine endomucina con soglia come "ROI vascolare" (ROI2), 3) l'immagine endomcina invertita come "ROI extravascolare" (ROI3), 4) l'intersezione " ROI extravascolare" e "ROI Dextran" (ROI1 e ROI3) come "ROI Dextran extravascolare" (ROI4) e 5) l'intera immagine come "ROI tumorale" (ROI5).
    7. Dividere l'area ROI4 per l'area ROI5 e moltiplicare per 100 per generare l'area percentuale che il dextran extravascolare copre nell'intero tumore.
    8. Ripetere il processo per 10-20 HPF per caso (a seconda della disponibilità dei tessuti) e generare un Dextran extravascolare medio (% area) per ogni caso.

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Representative Results

Le procedure sperimentali descritte in questo articolo di protocollo sono brevemente riassunte e illustrate nella Figura 1A-C.

Per misurare la permeabilità vascolare mediata da TMEM ("attività di scoppio") e ridurre il rumore sperimentale da altri modi di permeabilità vascolare (cioè transcellulare e paracellulare, come spiegato nell'introduzione), abbiamo eseguito permeno (i.v.) iniezione di sonde ad alto peso molecolare, come 155 kDa Dextran, coniugata alla rhodamina tetrametile. Il peso molecolare inferiore dextrans non distingueva le tre modalità di permeabilità vascolare. La nostra esperienza precedente ha indicato che la circolazione sistemica di 155 kDa TMR-Dextran ha etichettato in modo efficiente la vascolatura di entrambi i tessuti normali, come la ghiandola mammaria e i polmoni (Figura 2A,B),così come dei tessuti neoplastici, come metastasi primarie del cancro al seno e al seno nei polmoni (Figura2C,D). Come confermato anche da studi precedenti5,46, 155 kDa TMR-Dextran è quindi una sonda adatta per misurare "bursting" in siti tumorali primari e secondari. Un esempio caratteristico di attività di picco di scoppio (zona gialla tratteggiata), utilizzando l'imaging intravitale multifotone in un tumore primario mmTV-PYMT al seno è illustrato come una serie di immagini fisse (Figura 3A). L'attività di scoppio è sempre stata notata in associazione con una porta TMEM (cerchio bianco punteggiato), caratterizzata dalla giustapposizione spaziale di una Dendra2: cellula tumorale, un CFP, macrofagio ed endotelio (Figura 3A). Come accennato, ogni porta TMEM è costituita da un macrofago perivascolare, una cellula tumorale Mena che esperia e da una cellula endoteliale, il tutto in contatto fisico diretto tra loro. Mentre Mena non è stato esplicitamente etichettato nei modelli murini utilizzati in questi esperimenti, in precedenza è stato dimostrato di diventare sovraespresso nel tardo stadio PyMT carcinoma47. Ciò semplifica l'identificazione delle porte TMEM ed elimina la necessità di etichettare esplicitamente Mena nelle cellule tumorali.

Per valutare la permeabilità vascolare dipendente da TMEM nell'analisi dei tessuti fissi, abbiamo eseguito la procedura descritta in questo protocollo nei topi che sono stati trapiantati con pezzi tumorali prelevati da topi donatori MMTV-PyMT di 14 settimane. Quando i topi hanno raggiunto una dimensione del tumore appropriata, hanno ricevuto una singola dose i.v. di 155-kDa TMR-Dextran, come descritto nella parte 2 di questo protocollo, e sono stati sacrificati dopo 1 ora. I tessuti tumorali sono stati raccolti e sottoposti all'analisi IF. Il segnale fluorescente endomucina è stato utilizzato come maschera di esclusione al segnale fluorescente dextran, consentendo una discriminazione tra vasi sanguigni altamente permeabili e bassi, o non permeabili (Figura 3B). Come descritto in precedenza in Karagiannis et al.48, una diapositiva sequenziale è stata anche macchiata con la tripla macchia TMEM stabilita in precedenza e allineata con la diapositiva IF corrispondente. Utilizzando questo approccio, abbiamo confermato che i vasi sanguigni altamente permeabili all'interno del tessuto del tumore al seno hanno almeno una porta TMEM associata (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1 . Sintesi della procedura. (A) Dendra-2 etichettato come carcinoma invasivo del seno (verde) prelevato da un animale transgenico [FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)mul-Tg(MMTV-iCre)Jwp-Tg(loxP-stop-loxP-Pdendra2)J)e tagliato in piccoli pezzi. Un pezzo viene poi trapiatoato a tema in un altro animale transgenico i cui macrofagi sono stati etichettati da proteine cianescenti (ciano) [FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. L'ortotopicamente trapiantato nel tumore è quindi permesso di crescere, dopo di che il topo viene assegnato al braccio di trattamento appropriato. (B) Una volta terminato il trattamento, il mouse viene quindi assunto per l'imaging intravitale. Una volta anetizzato, viene eseguita un intervento chirurgico di lembo della pelle poi stabilizzato con un dorso di gomma. Una finestra di imaging poco profonda viene quindi apposto sopra il tumore. Infine, il mouse viene quindi posizionato sullo stadio del microscopio dove la finestra si inserisce nella piastra dello stadio su misura e le immagini possono quindi essere acquisite. (C) In alternativa, al topo di A viene somministrato un elevato peso molecolare e viene sacrificato dopo 1 ora. Il tumore viene quindi rimosso, fissato ed elaborato per l'incorporamento della paraffina. Sezioni del tessuto sono tagliate, macchiate per TMEM in IHC e dextran e navi in IF, e scansionate su uno scanner digitale intero diapositiva. Infine, le immagini delle due scansioni sono allineate e singoli campi visivi vengono scelti per l'analisi e la quantificazione delle perdite vascolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Visualizzazione della vascolatura etichettata TMR-Dextran in tessuti sani e malati. (A) Immagine di una ghiandola mammaria sana in via di sviluppo all'interno di un animale transgenico la cui vascolarizzazione è etichettata da TMR-Dextran (rosso), epitelio dutdutico mammario etichettato dalla proteina fluorescente Dendra-2 (verde) e macrofagi etichettati da un ciano proteina fluorescente (blu) [FVB/N-Tg(loxP-stop-loxP-Pdendra2)Jwp-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. (B) Tessuto polmonare sano visualizzato attraverso una finestra di imaging polmonare all'interno di un topo la cui vascolatura è etichettata da TMR-Dextran (rosso). Blu: SHG da fibre di collagene. (C) Dendra2 etichettato come carcinoma duttale invasivo prelevato da un animale transgenico [FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)mulxTg(MMTV-iCre)Jwp-Tg(loxP-stop-loxP-Pdendra2)Jwp] e trapelato ortotema in un altro animale trans il cui i macrofagi sono etichettati in proteine ciariche (blu) [FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) e vasi etichettati con TMR-Dextran (rosso). (D) Metastasi polmonari otto giorni dopo l'iniezione iv di cellule tumorali (E0771; etichettate dalla proteina fluorescente Clover) in un animale transgenico i cui macrofagi sono etichettati dalla proteina cianescente (ciano) [FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) ] e la vascolatura etichettata da TMR-Dextran (rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Visualizzazione della permeabilità vascolare mediata tramite imaging intravitale e analisi dei tessutifissi. (A) Stills da un film di imaging intravitale time-lapsed di 155-kDa TMR-Dextran etichettatura di vasi neo-angiogenici (rosso) all'interno di un dendra-2 etichettato carcinoma invasivo del seno (verde) preso da animale transgenico [FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)mul-Tg (MMTV-iCre) Jwp-Tg(loxP-stop-loxP-Pdendra2)Jwp] e ortotopicamente trapiantato in un altro animale transgenico dove i macrofagi sono stati etichettati da proteine fluorescenti cian (cian) [FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. La linea gialla tratteggiata indica il contorno dell'area di perdita vascolare transitoria prima (t - 0'), durante (t - 17') e dopo (t - 52') l'evento di perdita (bursting). Il cerchio bianco tratteggiato indica una porta TMEM, come catturato nell'imaging dal vivo. (B) Immunofluorescenza multicanale dell'Endomucin (prima colonna), 155-kDa dextran-TMR (seconda colonna), la loro immagine unita insieme a DAPI (terza colonna), il vaso sanguigno sogliato e le maschere dextran extravascolari (quarta colonna) e il corrispondente sezione sequenziale di TMEM IHC (quinta colonna) nei topi MMTV-PyMT. Riga superiore: Profilo vascolare lontano da TMEM, che appare come un profilo vascolare "non perdente". Riga inferiore: profilo vascolare associato al TMEM, che appare come un profilo vascolare "perdente". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, dedichiamo due protocolli che possono essere applicati per visualizzare e quantificare un tipo specifico di permeabilità vascolare che è presente alle porte TMEM ed è associato all'interruzione della stretta vascolare e aderisce giunzioni. Questo tipo di permeabilità vascolare è transitoria e controllata dal complesso cellulare TMEM tripartito, come spiegato sopra5. La capacità di identificare e quantificare la permeabilità vascolare associata al TMEM è fondamentale per la valutazione di un microambiente pro-metastatico delle cellule tumorali, nonché per studi preclinici che esaminino l'effetto delle terapie citotossiche convenzionali sul tumore potenziale antimetastatico di terapie mirate e non mirate. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato qui che questa valutazione può essere fatta mediante l'imaging intravitale o l'immunofluorescenza nei tessuti fissi. Entrambi gli approcci hanno i loro vantaggi e svantaggi. L'imaging intravitale consente la visualizzazione diretta del processo dinamico di permeabilità vascolare, ma richiede attrezzature e formazione specializzati. D'altra parte, l'immunofluorescenza eseguita nei tessuti fissi offre solo un'immagine statica, ma può essere eseguita regolarmente nella maggior parte dei laboratori.

I pazienti oncologici sono comunemente trattati con una qualche forma di terapia sistemica, e il successo del trattamento sistemico è di solito valutato dalla valutazione dei parametri relativi alla sopravvivenza delle cellule tumorali come l'apoptosi, la proliferazione o la dimensione lorda del tumore. Tuttavia, è altrettanto importante capire come queste terapie sistemiche influenzino la diffusione delle cellule tumorali, dato che la maggior parte della mortalità correlata al cancro si verifica a causa della metastasi, un processo che coinvolge sia la proliferazione delle cellule tumorali che le cellule tumorali diffusione1. Ad esempio, studi recenti hanno dimostrato che la chemioterapia può indurre un aumento significativo della densità delle porte TMEM nel cancro al seno del topo e dell'uomo48,49. Inoltre, è stato dimostrato che la chemioterapia induce attività TMEM e si traduce nella diffusione ematogena delle cellule tumorali, aumento delle cellule tumorali circolanti, e aumento della metastasi polmonare48. L'aumento indotto dalla chemioterapia nell'attività TMEM può essere bloccato dalla somministrazione sistemica del farmaco che inibisce la funzione TIE2 e quindi l'attività TMEM, chiamata rebastinb14,48. Pertanto, i protocolli qui descritti possono offrire preziose misurazioni endpoint per l'effetto di vari trattamenti sistemici sull'attività TMEM attraverso il confronto tra coorti di topi trattate e non trattate.

Negli ultimi anni, il concetto di terapia antiangiogenica nel cancro è stato rivisitato, suggerendo che una strategia vascolare di "normalizzazione" (cioè la ricostituzione transitoria della struttura anomala e della funzione dei vasi sanguigni), può essere preferibile al targeting vasi sanguigni per la distruzione, in quanto rende la neovasculatura più efficace per la somministrazione di farmaci50,51,52,53,54. Alla luce di questa ipotesi emergente, altri gruppi hanno anche sviluppato saggi per valutare la permeabilità vascolare e per testare l'efficienza delle strategie di normalizzazione vascolare55. Va ricordato che, in linea di principio, questi metodi sono utilizzati per valutare le modalità indipendenti DalMEM di permeabilità vascolare. Pertanto, la scelta del saggio di permeabilità vascolare più appropriato dipende dalla portata di uno studio, e i ricercatori devono garantire che essi comprendino l'applicabilità di ciascuno dei saggi di permeabilità vascolare pubblicati, prima di applicarli ai loro Studi.

Come accennato in precedenza, ciascuno dei due metodi qui descritti ha alcuni vantaggi rispetto all'altro. Ad esempio, la misurazione della "permeabilità in fiore" in vivo offre preziose informazioni cinetiche, ma poiché lo scoppio è un evento raro, possono essere necessarie sessioni di imaging prolungate di diverse ore ciascuna per poter ottenere dati sufficienti. Inoltre, l'imaging intravitale richiede apparecchiature specializzate che potrebbero non essere disponibili per tutti gli investigatori. D'altra parte, la valutazione dell'attività TMEM nei tessuti fissi è relativamente facile da eseguire e richiede solo apparecchiature di laboratorio standard. Inoltre, l'analisi dell'attività tMEM nei tessuti fissi è più facile da interpretare, ma manca di informazioni cinetiche. Inoltre, l'analisi dei tessuti fissi è meno specifica, poiché può catturare perdite cumulative di dextran nel tempo dalla permeabilità vascolare transcellulare e paracellulare di endotelio intatto, o anche un evento di perdita improvviso a causa di lesioni vascolari spontanee. Pertanto, l'uso sinergico dei due metodi renderebbe più specifica e più sensibile l'interpretazione della permeabilità vascolare mediata da TMEM. Anche se non abbiamo testato esplicitamente altre applicazioni delle tecniche qui presentate, esse possono rivelarsi utili per studiare la permeabilità indotta della nave, ad esempio mediante infezione o da terapie farmaceutiche.

In sintesi, la misurazione della permeabilità vascolare associata al TMEM, come descritto qui da due metodologie indipendenti, fornisce strumenti utili per valutare il microambiente tumorale pro-metastatico e l'attività TMEM associata, e può essere utilizzata per alcuni misura da qualsiasi laboratorio. Questi metodi sono particolarmente utili nella valutazione pre-clinica dell'effetto delle terapie sistemiche sulla diffusione delle cellule tumorali. Inoltre, possono essere utilizzati per valutare l'effetto degli agenti che possono bloccare l'attività TMEM indotta dalla chemioterapia e, infine, questi metodi possono essere utilizzati per valutare la migliore terapia di combinazione che precede le sperimentazioni del paziente di fase I.

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Disclosures

Gli autori non rivelano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Ringraziamo l'Analytical Imaging Facility (AIF) dell'Albert Einstein College of Medicine per il supporto dell'imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 e CA216248), il SIG 1S10OD019961-01, il Gruss-Lipper Biophotonics Center e il suo programma Integrated Imaging, e Ruth L. Kirschstein T32 per lo studio del microambiente tumorale (CA200561).

GSK ha co-scritto il manoscritto, ha eseguito l'imaging per le figure 1C e 3B, ha sviluppato un protocollo di analisi dei tessuti fissi e ha analizzato e interpretato tutti i dati; JMP ha co-scritto il manoscritto, ed eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 1B,2C e 3A; LB & AC ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la figura 2B; RJ ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 2A; JSC co-scrisse il manoscritto e analizzò e interpretò tutti i dati; MHO ha co-scritto il manoscritto e analizzato e interpretato tutti i dati; e DE ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 2D, ha co-scritto il manoscritto, sviluppato l'analisi dei tessuti fissi e protocolli di imaging intravitale e analizzato e interpretato tutti i dati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

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References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

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Retrazione numero 148 imaging intravitale immunofluorescenza permeabilità dei vasi sanguigni microambiente tumorale di metastasi (TMEM) dextran ad alto peso molecolare immunofluorescenza metastasi
Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi
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