Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Vurdering tumor mikromiljø af metastase døråbning-medieret vaskulær permeabilitet forbundet med kræft celle udbredelse ved hjælp af Intravital Imaging og fast vævsanalyse

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59633
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Summary

Vi beskriver to metoder til vurdering af forbigående vaskulær permeabilitet forbundet med tumor mikromiljø af metastase (TMEM) døråbning funktion og cancer celle intravasation ved hjælp af intravenøs injektion af høj molekylvægt (155 kDa) dextran i mus. Metoderne omfatter intravital billeddannelse i levende dyr og fast vævsanalyse ved hjælp af immunofluorescens.

Abstract

Den mest almindeligt årsag til kræft relateret dødelighed er metastase, en proces, der kræver udbredelse af kræftceller fra den primære tumor til sekundære steder. For nylig konstaterede vi, at kræft celle udbredelse i primær brystkræft og på metastatiske steder i lungerne kun sker ved døråbninger kaldet tumor mikromiljø af metastase (TMEM). TMEM dørnummer er prognostisk for fjern recidiv af metastatisk sygdom hos brystkræftpatienter. TMEM døråbninger er sammensat af en cancer celle, som over-udtrykker actin Regulatory protein Mena i direkte kontakt med en perivaskulær, proangiogen makrofag, som udtrykker høje niveauer af TIE2 og VEGF, hvor begge af disse celler er tæt bundet til en blod beholderen endotel celle. Kræftceller kan intravasere gennem tmem døråbninger på grund af forbigående vaskulær permeabilitet orkestrieret af den fælles aktivitet af tmem-associerede makrofag og den tmem-associerede Mena-udtrykker kræft celle. I dette manuskript beskriver vi to metoder til vurdering af TMEM-medieret forbigående vaskulær permeabilitet: intravital billeddannelse og fast vævs immunofluorescens. Selv om begge metoder har deres fordele og ulemper, kan kombinationen af de to give de mest komplette analyser af TMEM-medieret vaskulær permeabilitet samt mikromiljømæssige forudsætninger for TMEM funktion. Da den metastatiske proces i brystkræft, og eventuelt andre former for kræft, involverer kræft celle udbredelse via TMEM døråbninger, er det vigtigt at anvende veletablerede metoder til analyse af TMEM døråbning aktivitet. De to metoder, der beskrives her, giver en omfattende tilgang til analysen af TMEM-dørens aktivitet, enten i naive eller farmakologisk behandlede dyr, hvilket er af afgørende betydning for prækliniske forsøg med agenser, der forebygger kræft celle formidling via TMEM.

Introduction

Nylige fremskridt i vores forståelse af kræft metastaser har afsløret, at epitelial-til-mesenchymal overgang (EMT) og induktion af en migrerende/invasiv cancer celle delpopulation er ikke i sig selv tilstrækkelig til hæmatogen udbredelse 1. faktisk var det tidligere antaget, at metastadimensionerende kræftceller intravasat gennem hele kræft-associeret endotelet som tumor neovaskulatur er ofte karakteriseret ved lav pericyte dækning, og som sådan, er meget permeabel og ustabil2,3,4. Selv om meget suggestive af defekte funktioner inden for tumoren, vaskulære modifikationer under carcinogenese ikke giver beviser i det hele, at tumorceller kan trænge ind blodkar let og i en ukontrolleret måde. Indsigter fra intravital Imaging (IVI) undersøgelser, hvor tumorceller fluorescently-Tagged og Vaskulaturen er mærket via intravenøs injektion af lysstofrør (såsom dextran eller kvante prikker), viser, at, mens tumor skibe er ensartet gennemtrængelig til lav molekylvægt dextrans (fx 70 KD), høj molekylvægt dextrans (155 KD) og tumorceller kan krydse endotelet kun på specialiserede steder af intravasation, som fortrinsvis er placeret på vaskulære gren punkt5, 6 , 7. immunohistokemiske (IHC) analyser ved hjælp af dyremodeller og humant patient-afledt materiale har vist, at disse steder er "døråbninger", der specialiserer sig i at regulere vaskulær permeabilitet, lokalt og transitivt, hvilket giver et kort vindue af mulighed for migrerende/invasive kræftceller til at komme ind i omløb. Disse døråbninger kaldes "tumor mikromiljø af metastase" eller "tmem", og helt forventeligt, deres tæthed korrelerer med en øget risiko for at udvikle metastatisk sygdom hos brystkræftpatienter8,9, 10.

Hver tmem døråbning består af tre forskellige typer af celler: en perivaskulær makrofag, en tumor celle over-udtrykker actin-regulatoriske protein pattedyr aktiveret (Mena), og en endotel celle, alle i direkte fysisk kontakt med hinanden1, 5,9,10,11,12,13. Den vigtigste begivenhed for funktionen af tmem som en intravasation døråbning er den lokaliserede frigivelse af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) på det underliggende fartøj af perivaskulære makrofag14. VEGF kan forstyrre Homotypiske vejkryds mellem endotheliale celler15,16,17,18,19, et fænomen, der resulterer i forbigående vaskulær lækage, også kendt som "sprængning" permeabilitet som beskrevet i IVI undersøgelser 5. Det er påvist, at tmem-makrofager udtrykker tyrosinkinasereceptoren TIE2, som er nødvendig for VEGF-medieret tmem-funktion og homing af disse makrofager til den perivaskulære niche5,20,21 , 22. ud over at regulere kræftcellernes udbredelse og metastase har TIE2+ makrofager vist sig at være centrale regulatorer af tumor angiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Som sådan udgør TIE2+ makrofager en kritisk bestanddel af Tumorens mikromiljø og den vigtigste regulator af den metastatiske kaskade.

For bedre at konceptualisere TMEM-medieret vaskulær permeabilitet (dvs. "sprængning"), er det meget vigtigt at skelne det fra andre former for vaskulær permeabilitet, der ikke er forbundet med opløsningen af endotel celle-celle knudepunkter. I en intakt endotelet (en, hvis stramme og klæber kryds ikke forstyrres), er der tre hovedtyper af vaskulær permeabilitet: (a) pinocytose, som kan, eller ikke kan, kobles til transcytose af det indtagne materiale; b) transport af materiale gennem endotel fenestrae og (c) transport af materiale gennem paracellulær pathway, som er reguleret af endotel stramme kryds15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. selv om dereguleret i mange tumorer, de førnævnte former for vaskulær permeabilitet er blevet beskrevet for det meste i forbindelse med normal vævs fysiologi og homøostase, hvis ekstremer er væv med enten begrænset permeabilitet ( f. eks. blod-hjerne-barriere, blod-testis-barriere) eller rigelig permeabilitet (f. eks. fenestreret kapillærer i nyre-glomerulære apparater)34,35,36,37.

Ved hjælp af multiphoton intravital Imaging og multiplexed immunofluorescens mikroskopi, vi er i stand til at skelne mellem TMEM-medieret vaskulære permeabilitet ("sprængning") og andre former for vaskulær permeabilitet i brysttumorer. For at opnå dette, udfører vi en enkelt intravenøs injektion af en høj molekylvægt, fluorescently-mærket sonde i mus. Spontane sprængning begivenheder kan derefter fanges ved hjælp af intravital Imaging i levende mus; Alternativt kan ekstravasation af sonden kvantificeres ved samlokaliserings undersøgelser med blodvaskulaturen (f. eks. CD31+ eller Endomucin+) og tmem-døråbninger ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi. De protokoller, der præsenteres her, beskriver begge disse teknikker, som kan anvendes enten uafhængigt eller sammen med hinanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med levende dyr skal gennemføres i overensstemmelse med retningslinjer og bestemmelser for dyre brug og-pleje. De procedurer, der er beskrevet i denne undersøgelse, blev udført i overensstemmelse med de nationale institutter for sundhedsbestemmelser om pleje og anvendelse af forsøgsdyr og med godkendelse af Albert Einstein College of Medicine Animal Care og use Udvalg (IACUC).

1. evaluering af "sprængning permeabilitet" ved hjælp af levende dyr billeddannelse

  1. Transplantation af syngeneiske brysttumorer i mus værter med fluorescerende makrofager
    1. Generere stykker af tumor væv egnet til transplantation.
      1. Generer fluorescently-mærkede tumorer i mus brystcancer modeller ved at krydse den spontane, autoktont, genetisk manipuleret mus brystcancer model MMTV-pymt mus med Transgene mus udtrykker fluorescerende journalister38, 39 [f. eks. forbedret grønt fluorescerende protein (egfp), forbedret cyan fluorescerende protein (ecfp) eller Dendra2].
      2. Tillad MMTV-PyMT mus med fluorescently mærkede tumorer til at vokse til en størrelse på ikke større end 2 cm (ca. 10-12 uger af alder).
      3. Euthanize tumor bærende MMTV-PyMT mus ved at placere dem i et kammer med 5% isofluran indtil 30 sekunder efter alle respirationer stoppe.
      4. Udføre en livmoderhals dislokation.
      5. Fjern håret fra den aflives musens mave ved hjælp af en aktuel depilatory creme.
      6. Placer en Petri skål med DMEM/F12-cellekulturmedium på is.
      7. Placer musen og Petri skålen på is i røgudemhætten.
      8. Sanitize musens mave med 70% ethylalkohol.
      9. Ved hjælp af sterile handsker og kirurgiske værktøjer (steriliseret saks, pincet, og klinge) fjerne tumorer og placere dem i Petri skålen.
      10. Skær tumoren i små stykker (~ 2 mm x 2 mm x 2mm i størrelse), kassere eventuelle nekrotiske portioner, mens de er i Petri skålen.
    2. Transplantation af tumor brikker i modtager værter.
      1. Hæv mus med genmanipulerede fluorescently-mærkede makrofager, fx MacGreen40 eller macblue 41 mus (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ecfp)
      2. Lad FVB mus med fluorescently mærkede makrofager til at vokse til en alder af ~ 4-6 uger).
      3. Anæstetisere FVB mus med fluorescently mærkede makrofager i et kammer ved hjælp af 5% isofluran med ilt som en bærer gas.
      4. Reducer anæstesi til ~ 3% isofluran og anvende oftalmologiske salve til øjnene af musen for at forhindre tørring.
      5. Fjern håret fra over den 4th Brystkirtel i musen.
      6. Rengør huden med betadin. Det er vigtigt at opretholde sterile forhold i resten af proceduren. Dette omfatter brug af steriliserede instrumenter og reagenser.
      7. Lav et lille snit ~ 2-3 mm lige ringere end 4th nippel.
      8. Dissekere indtil bryst fat pad er eksponeret.
      9. Tag en tumor stykke fra Petri skålen og pels i kunstig ekstracellulær matrix.
      10. Transplantation tumorer nedenunder den 4th bryst fedt pad.
      11. Luk snittet ved hjælp af cyanoacrylat klæbemiddel.
      12. Løbende overvåge dyret, indtil det fuldt ud genopretter fra anæstesi og er i stand til at opretholde brystbenet recumbency. Også, ikke at returnere dyret til selskabet af andre dyr, indtil fuld helbredelse.
      13. For at minimere infektioner, tilsættes 1 mL 100 mg/mL enrofloxacin antibiotikum til dyrets drikkevand flaske (8 fl oz).
      14. Lad tumorer til at vokse indtil håndgribelig (~ 5 mm; ~ 4 uger).
      15. Afhængigt af eksperimentet, tildele musene til behandlingsgrupper, og udføre de tilsvarende behandlinger, hvis det er relevant.
  2. Opsætning til intravital Imaging
    1. Tænd for mikroskopet to-foton laser og detektorer.
    2. Tænd for opvarmnings boksen og Forvarm mikroskopet x-y-stadie.
    3. Placer den specialfremstillede fase INSERT42 i x-y-stadiet.
  3. Klargøring af billedbehandlings vinduet
    1. Før du konfigurerer til billedbehandling, skal du autoklave den specialfremstillede cirkulære billedbehandlings vinduesramme42.
    2. Brug en pipette eller en insulin sprøjte til at anbringe et tyndt lag cyanoacrylatlim på vinduesrammen og anbringe et 8 mm cirkulært dækglas på plads.
      Bemærk: 1) det er vigtigt at undgå at få rester på den klare åbning af dækglasset. 2) det er vigtigt at overholde Cover glasset til vinduesrammen mindst 1 time før brug til billeddannelse.
    3. Rengør forsigtigt overskydende cyanoacrylat på den klare åbning af dækglasset ved hjælp af en serviet af et laboratorium, der er fuvet med en lille mængde acetone.
  4. Fremstilling af hale venekateter til administration af væsker og fluorescerende farvestoffer under billeddannelse
    1. Skær et 30 cm stykke polyethylen slange til at konstruere en hale venekateter.
    2. Afmonter nåle delen af en 30 G nål fra dens luer-koner ved forsigtigt at bøje nålen frem og tilbage, indtil den bryder sammen.
      Bemærk: nålen skal holdes tæt på luer koner og ikke nålens spids. Dette kan udføres med tænger eller pincet til at gribe nålen for at forhindre nålestikskade.
    3. Indsæt den stump ende af nålen i den ene ende af polyethylen slangen.
    4. Indsæt den skarpe ende af en anden 30 G nål, holde dens luer koner fastgjort, til den modsatte ende af slangen.
    5. Fyld en 1 CC sprøjte med fosfat bufferet saltvand, fastgør den til luer taper af det samlede kateter, og skyl hale venekateter og sørg for, at der ikke er luftbobler i systemet.
    6. For vaskulær mærkning, Fyld en 1 CC sprøjte med 100 μL af 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamin (TMR) eller Quantum prikker.
  5. Forberedelse af mus til billeddannelse
    1. Bedøvelse musen i et bur nedenunder (~ 1 fod nedenfor) en varmelampe ved hjælp af 4%-5% isofluran blandet med 100% ilt indstillet til et flow på 1.5-2 L per min.
    2. Tænd for varme lampen over kirurgisk arbejdsområde. Dette trin er afgørende for at opretholde den centrale fysiologisk kropstemperatur af musen under operationen.
    3. Placer musen under varme lampen og sænk anæstesi til 2%-3% for varigheden af operationen.
      Bemærk: Sørg for at holde varme lampen i en sikker afstand (~ 1 fod) væk fra musen for at undgå overophedning.
    4. Placer oftalmisk salve på musens øjne for at forhindre tørring af øjnene og blindhed.
    5. Test, at musen er bedøvet ved at udføre toe-Pinch Test. Hvis dyret trækker, øges dosis af isofluran med 1% og retestes i 1-2 min.
    6. Sæt hale venekateter i det mest distale punkt på halen muligt.
    7. Fastgør hale venekateter til halen med et lille stykke laboratorie tape, der ombrydes rundt om halen og stikker til nålen for at sikre, at det ikke bliver forstillet.
    8. Injicer 50 μL pr. h PBS gennem hale venekateter for at give tilstrækkelig hydrering. Det er vigtigt at undgå at injicere for meget væske (ikke mere end 200 μL pr. time) eller bobler ind i kateteret, da dette kan være fatalt for musen.
    9. Fjern hår på maven over 4th og 5th brystkirtler ved hjælp af depilatory creme.
    10. Rengør huden med betadin, og lad huden tørre.
    11. Lav en langsgående midterlinje indsnit starter umiddelbart overlegen i forhold til kønsorganerne og bære snittet op til niveauet for den overlegne aspekt af 4th brystkirtlen.
    12. Bær snittet tværgående til det overlegne aspekt af den 4th Brystkirtel. Det er vigtigt at undgå at kompromittere blodforsyningen på dette punkt.
    13. Dissekere bryst fat pad off bughinden skabe en vævs klap ved hjælp af sterile pincet og saks.
      Bemærk: hud flap Imaging er modtagelig for betydelige motion artefakter og væv dehydrering. Disse undgås, som beskrevet tidligere43,44, ved at anbringe et stift stykke gummi bag på hudsiden af flappen (for at stivne det bløde væv og isolere det fra resten af kroppen) og derefter placere tumoren i en lavvandet billeddannelse for at bevare hydrationen. Dette er afgørende for stabil billeddannelse som tumoren og omgivende væv i denne indstilling er meget overensstemmende.
    14. Stabiliserer hudklappen ved at anbringe (med cyanoacrylatlim) et lille stykke stift gummi, der måler 2 cm x 2 cm til hudsiden af flappen. Tumoren skal være i midten af det område, der stabiliseres af gummiet.
    15. Hold eksponeret væv hydreret med dråber PBS.
    16. Påfør en lille film af cyanoacrylat til den ydre rand af den specialfremstillede billedbehandlings vinduesramme.
    17. Påfør en lille dråbe PBS (~ 10 – 20 μL) til midten af dækglasset.
    18. Tør det omgivende flap væv af med en laboratorie serviet. Det er afgørende at sikre, at cyanoacrylat på vinduesrammen ikke kommer i kontakt med PBS på glasset, da dette kan få cyanoacrylat til at polymerisere og sat for tidligt.
    19. Fastgør den lille billeddannelse vindue til vævet flap med tumoren i midten af den klare blænde.
    20. Fjernvarme boksen fra scenen.
    21. Overfør det anæstetiserede muse-og hale venekateter til mikroskop stadiet. Brug ekstrem forsigtighed for at sikre, at hale venekateter ikke falder ud.
    22. Placer musen på scenen i udsatte position.
    23. Placer næse keglen af isofluran over snude for at sikre vedligeholdelse af anæstesi.
    24. Indsæt vinduet i borehullet på den brugerdefinerede x-y Stage plade.
    25. Placer varme boksen tilbage på scenen for at opretholde en fysiologisk temperatur.
    26. Overvåge dyrets vitale tegn ved at vedhæfte en puls-pulsoximeter sonde via Clip sensor til rygpoten.
    27. Langsomt nedsætte isofluran til 0,5%-1% for at opretholde tilstrækkelig blodgennemstrømning og undgå over bedøvelse af musen.
  6. Intravital Imaging
    Bemærk: den billedbehandling, vi beskriver i dette afsnit, blev udført på et specialbygget to-laser multifoton mikroskop, der tidligere er beskrevet5,39,45. Kort, en at laser bruges til at generere 90 at pulserende laser lys centreret ved 880 Nm. Fluorescens lampe detekteres med tre af de fire samtidig erhverve detektorer (blå = 447/60, grøn = 520/65, og rød 580/60; central bølgelængde/båndbredde) efter adskillelse fra excitation lys af en koldtlysreflektorlamper (chroma, Z720DCXXR). Mikroskopet holder indeholder en 25x, 1,05 NA (numerisk blænde) lang arbejdsdistance (2 mm) objektiv linse. Det er vigtigt at bemærke, at mens vi har brugt et specialbygget mikroskop, kan den protokol, der er beskrevet nedenfor, udføres på ethvert kommercielt tilgængeligt multifoton mikroskop.
    1. Placer en dråbe destilleret vand mellem mål 25x, 1,05 NA mikroskopet og vinduets dækglas for at gøre optisk kontakt.
    2. Brug mikroskopet okular til at fokusere på områder med fluorescerende tumorceller tæt på overfladen af vinduet.
    3. Find flydende blodkar og mærkede makrofager. Det er afgørende at have strømmende blodkar til at vurdere dynamikken i Vaskulaturen.
    4. Skift mikroskopet til multiphoton-tilstand.
    5. Indstil øvre og nedre grænser for en z-serie, som måler ca. 50 μm.
      1. Indstil den øvre grænse for z-serien ved at bruge Focus justering til at flytte målet til den ønskede startplacering, på den mest overfladiske position, og markere denne position som nul i softwaren ved at klikke på z position top knappen.
      2. Sæt den nedre grænse for z-serien flytte målet til det dybeste lag (typisk 50-70 μm fra toppen for mindre tumorer) og klikke på knappen Z position nederst .
      3. Indstil z-trins-størrelsen til 5 μm.
    6. Klik på knappen time-lapse panel, og Indstil tidsintervallet mellem anskaffelser til mindst 10 s for at give tilstrækkelig tid til at genopbygge vandet over objektivlinsen. Dette gøres manuelt med en klemme pipette på målet i den lange tid bortfalder.
    7. Fjern sprøjten med PBS i hale venekateter, og Udskift den med en anden sprøjte, der indeholder 155 kDa dextran-TMR (tetramethyl rhodamin).
    8. Injicer 100 μL af 155 kDa dextran-TMR via hale venekateter.
    9. Udskift TMR-sprøjten med PBS-sprøjten efter injektionen.
    10. Få en z-stack time-lapse Imaging ved at klikke på Z-stack og time-lapse-knapperne, og klik derefter på Optag-knappen.
    11. Injicer 50 μL PBS hver 30-45 min for at opretholde tilstrækkelig hydrering af dyret. Undgå at injicere mere end 200 μL på et tidspunkt, da dette kan forårsage væskeophobning.
  7. Eutanasi
    1. Isofluran øges til 5%, og dyret holdes under 5% isofluran med næse kegle på plads indtil 30 s efter lagsomme ophør.
    2. Fjern musen fra scenen.
    3. Udfør livmoderhals dislokation.
  8. Billedbehandling
    1. Indlæs alle billeder i ImageJ, og formater dem i en 5-dimensionel hyperstack (x, y, z, t og Color Channel).
    2. Udfør adskillelse af spektral overlap (dvs.: GFP og CFP) og eliminering af x-y-drift fra hyperstablerne ved hjælp af etablerede metoder38.
    3. Brug justering af lysstyrke og kontrast til at øge det hvide niveau i blod kanalen, så baggrunds signalet bliver synligt.
    4. For hver z skive, omhyggeligt inspicere hver film for tegn på forbigående vaskulær lækage (en "Burst"). At køre filmene ved hurtige billedhastigheder (40 fps) kan hjælpe denne identifikation.
    5. Når en burst er blevet identificeret, skal du returnere lysstyrken for denne kanal til et normalt niveau og beskære hyperstakken til denne region og z-Slice.

2. vurdering af ekstravaskulær dextran ved hjælp af fast vævsanalyse

  1. Tumor og prøveforberedelse
    Bemærk: den 2nd del af denne protokol antager, at brysttumorer er høstet fra en ortotopisk transplantation musemodel af brystkarcinom (dvs. MMTV-PyMT). Denne model kunne være den samme som den, der er beskrevet i den 1St del af protokollen, selv om fluorescently-mærkede tumorer er ikke nødvendige på dette punkt.
    1. Efter afslutningen af den eksperimentelle rørledning (dvs. Drug behandlinger, etc.), udføre en hale-forgæves injektion af 100 μL af 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetramethyl rhodamin, 1 h før ofrer musene.
    2. Ofrer musene og høst brysttumorer.
    3. Fix tumorer i 10% formalin for 48-72 h og Fortsæt til paraffin-indlejring.
    4. Brug en mikrotom, skær to 5 μm-tykke sekventielle slides fra formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv. En slide bruges til farvning af dextran, mens den anden vil blive brugt til at udføre TMEM Triple-IHC, som reference.
      Bemærk: TMEM Triple-immunhistochemistry-protokollen er beskrevet andetsteds 10.
  2. Hvis farvning og scanning for den første af de to sekventielle sektioner
    1. Send dias til en standardprotokol for afparaffinsering. Dette omfatter to efterfølgende fordybninger i xylen (10 min hver), efterfulgt af dehydrering i serielt fortyndede alkohol opløsninger (100%, 95%, 70% og 50% EtOH i H2O i 2 min hver fordybelse).
    2. Udfør antigen udtagning ved opvarmning (tæt på kogepunkt) de sektioner, som er nedsænket i citrat (pH 6,0-justeret) i 20 min.
    3. Lad prøverne afkøles til stuetemperatur i 15-20 min og derefter vaskes i PBS 3x for 2 min hver vask.
    4. Blok til 60-90 min i blokerende buffer (10% FBS; 1% BSA; 0,0025% fisk hudgelatine; 0,05% PBST, dvs. PBS med 0,05% Tween-20).
    5. Der inkubates prøver med en blanding af primære rotte-og kanin antistoffer, som henholdsvis er rettet mod Endomucin og TMR, og derefter vaskes i PBST 3x, 2 min. hver.
    6. Incubate prøver med en blanding af sekundære æsel antistoffer mod rotte IgG (konjugeret til Alexa-647) og kanin IgG (konjugeret til Alexa-488), og derefter vaskes i PBST 3x 2 min hver.
    7. Udfør en rutinemæssig DAPI-farvning (dvs. nedsænkning i DAPI-opløsning til 5-6 min), Monter slidene ved hjælp af et glycerol frit "hårdt" monterings medium, og opbevar det på et mørkt sted indtil scanningen.
    8. Du opnår optimale resultater ved at scanne diasene på en digital hel slide scanner.
  3. Billedanalyse
    1. Optag 10 højspændings felter (HPFs) pr. kasse ved hjælp af software, som er egnet til digital patologi.
    2. Gem Endomucin (rød) og TMR (grøn) kanaler separat som TIFF.
    3. Ved hjælp af ImageJ, uploade TIFF-filer og konvertere dem til 8-bit billeder.
    4. Tærskel 8-bit billeder til niveauet for den negative kontrol, og generere to binarized billeder, der viser Endomucin og TMR "masker".
    5. Vælg Udfyld huller på Endomucin-masken fra de binære værktøjer.
    6. Generer og Gem følgende fem regioner af interesse: 1) det tærskel formede dextran-billede som "dextran ROI" (ROI1), 2) det tærskel formede endomucin-billede som "vaskulær ROI" (ROI2), 3) det inverterede endomucin-billede som "Ekstravaskulær ROI" (ROI3), 4) den tværsnit lige " Ekstravaskulær ROI "og" dextran ROI "-billede (ROI1 ∩ ROI3) som" Ekstravaskulær dextran ROI "(ROI4) og 5) hele billedet som" tumor ROI "(ROI5).
    7. Divider ROI4 området med ROI5 området og Multiplicer med 100 for at generere det procent areal, som den ekstravaskulære dextran dækker i hele tumoren.
    8. Gentag processen for 10-20 HPFs pr. tilfælde (afhængigt af vævs tilgængelighed) og Generer en gennemsnitlig Ekstravaskulær dextran (% område) for hvert tilfælde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eksperimentelle procedurer, der er beskrevet i denne protokol artikel, opsummeres kort og illustreres i figur 1A-C.

For at måle TMEM-medieret vaskulær permeabilitet ("sprængning aktivitet") og for at reducere eksperimentel støj fra andre former for vaskulær permeabilitet (dvs. transcellulære og paracellulære, som forklaret i indledningen), vi udførte intravenøs (i.v.) injektion af sonder med høj molekylvægt, såsom 155 kDa dextran, konjugeret til tetramethylbly rhodamin. Den nedre molekylvægt dextrans skelner ikke mellem de tre former for vaskulær permeabilitet. Vores tidligere erfaring har vist, at den systemiske cirkulation af 155 kDa TMR-dextran effektivt mærkede Vaskulaturen af begge normale væv, såsom brystkirtlen og lungerne (figur 2A, B), samt af neoplastisk væv, såsom primær brystcancer og brystkræft metastaser i lungerne (figur 2C, D). Som også bekræftet af tidligere undersøgelser5,46, 155 kDa TMR-dextran er således en egnet sonde til måling af "sprængning" i både primære og sekundære tumor steder. Et karakteristisk eksempel på Peak sprængning aktivitet (punkteret gult område), ved hjælp af multiphoton intravital Imaging i en primær MMTV-PYMT brysttumor er illustreret som en serie af stillbilleder (figur 3a). Sprængning aktivitet blev altid noteret i forbindelse med en tmem døråbning (punkteret hvid cirkel), karakteriseret ved den rumlige sammenstilling af en Dendra2+ tumor celle en CFP+ makrofag og endotelet (figur 3a). Som nævnt består hver tmem døråbning af en perivaskulær makrofag, en Mena overudtrykker tumor celle, og en endotel celle, alle i direkte fysisk kontakt med hinanden. Mens Mena ikke er blevet eksplicit mærket i de musemodeller, der anvendes i disse eksperimenter, har det tidligere vist sig at blive overudtrykt i sent stadie pymt karcinom47. Dette forenkler identifikationen af TMEM døråbninger og eliminerer behovet for eksplicit at mærke Mena i tumorcellerne.

For at vurdere TMEM-afhængige vaskulære permeabilitet i fast vævsanalyse, vi udførte den procedure, der er beskrevet i denne protokol i mus, som blev transplanteret med tumor bidder taget fra 14-ugers gamle MMTV-PyMT donor mus. Når mus nåede en passende tumorstørrelse, de fik en enkelt i.v. dosis af 155-kDa TMR-dextran, som beskrevet i del 2 af denne protokol, og blev ofret efter 1 time. Tumorvæv blev indsamlet og udsat for hvis analyse. Endomucin-fluorescerende signal blev brugt som en udelukkelses maske til dextran fluorescerende signal, hvilket giver mulighed for diskrimination mellem stærkt gennemtrængelige og lave eller ikke-permeable blodkar (figur 3B). Som tidligere beskrevet i Karagiannis et al.48, blev et sekventielt dias også plettet med den tidligere etablerede tmem Triple Stain og justeret med den tilsvarende IF slide. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi bekræftede, at de meget permeable blodkar i brystet tumor væv har mindst én associeret TMEM døråbning (figur 3B).

Figure 1
Figur 1 . Resumé af proceduren. A) dendra-2 mærket invasiv karcinom i brystet (grøn) taget fra et transgene dyr [Fvb/N-TG (MMTV-pymt) mul-TG (MMTV-Icre) JWP-TG (loxp-stop-Loxp-Pdendra2) JWP] og skæres i små stykker. Et stykke er derefter ortotopisk transplanteret til et andet transgene dyr, hvis makrofager var mærket af cyan fluorescerende protein (cyan) [Fvb/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. Den ortotopisk transplanterede til tumor er derefter lov til at vokse, hvorefter musen er allokeret til den relevante behandling arm. (B) når behandlingen er færdig, musen er derefter taget for intravital Imaging. Når bedøvet, en hud flap kirurgi udføres derefter stabiliseret med en gummi bagside. Et lavvandet billedbehandlings vindue anbringes derefter over tumoren. Endelig er musen placeret på mikroskopet scenen, hvor vinduet passer ind i den specialfremstillede scene plade og billederne kan derefter erhverves. (C) Alternativt, mus fra A administreres høj molekylvægt dextran og ofret efter 1 time. Tumoren fjernes derefter, fastgøres og forarbejdes til paraffin indlejring. Sektioner af vævet skæres, farves for TMEM i IHC og dextran og fartøjer i IF, og scannes på en digital hele slide scanner. Endelig er billeder fra de to scanninger justeret og individuelle synsfelter er valgt til analyse og kvantificering af vaskulær lækage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Visualisering af TMR-dextran mærket Vaskulaturen i sundt og sygt væv. A) billede af en sund udvikling i brystkirtlen inden for et transgene dyr, hvis vaskulatur er mærket med TMR-dextran (rød), bryst duktalt epitel mærket af fluorescerende protein dendra-2 (grøn) og makrofager, der er mærket med en cyan fluorescerende protein (blåt) [Fvb/N-TG (loxP-stop-loxP-Pdendra2) JWP-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. (B) sundt lunge væv visualiseret gennem en lunge billeddannelse vindue i en mus, hvis Vaskulaturen er mærket af TMR-dextran (rød). Blå = SHG fra kollagen fibre. C) Dendra2 mærket invasiv duktalt karcinom taget fra et transgene dyr [fvb/N-TG (MMTV-pymt) mulxtg (MMTV-icre) JWP-TG (loxp-stop-loxp-Pdendra2) JWP] og ortotopisk transplanteret til et andet transgene dyr, hvis makrofager er mærket med cyan fluorescerende protein (blå) [Fvb/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) og fartøjer mærket med TMR-dextran (rød). D) lungemetastaser otte dage efter i.v. injektion af tumorceller (E0771; mærket af fluorescerende Proteinkløver) til et transgene dyr, hvis makrofager er mærket med cyan fluorescerende protein (cyan) [f/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-ecfp) ] og Vaskulaturen mærket af TMR-dextran (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Visualisering af TMEM-medieret vaskulær permeabilitet ved hjælp af intravital Imaging og fast vævsanalyse. (A) Stills fra en tid-bortfaldet intravital Imaging film af 155-KDA TMR-dextran mærkning af neo-angiogene fartøjer (rød) inden for en dendra-2 mærket invasiv karcinom af brystet (grøn) taget fra en transgene dyr [Fvb/N-TG (MMTV-pymt) mul-TG (MMTV-iCre) JWP-TG (loxP-stop-loxP-Pdendra2) JWP] og ortotopisk transplanteret til et andet transgene dyr, hvor makrofager blev mærket med cyan fluorescerende protein (cyan) [Fvb/N-TG (CFMs-gal4-vp16)-(UAS-ecfp)]. Den stiplede gule linje betegner omridset af det forbigående vaskulære lækage område før (t = 0 '), under (t = 17 ') og efter (t = 52 ') lækagen (sprængning) hændelsen. Den stiplede hvide cirkel peger på en TMEM døråbning, som taget i live Imaging. B) multikanals immunofluorescens af Endomucin (første kolonne), 155-kDa dextran-TMR (anden kolonne), deres fusionerede billede sammen med dapi (tredje kolonne), det tærskel formede blodkar og ekstravaskulære dextran masker (fjerde kolonne) og tilsvarende sekventielle del af TMEM IHC (femte kolonne) i MMTV-PyMT-mus. Øverste række: vaskulær profil væk fra TMEM, optræder som en "ikke-utætte" vaskulære profil. Nederste række: TMEM-associeret vaskulær profil, der optræder som en "utætte" vaskulære profil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her skitserer vi to protokoller, der kan anvendes til at visualisere og kvantificere en bestemt type vaskulær permeabilitet, som er til stede ved TMEM døråbninger og er forbundet med afbrydelse af vaskulære stramme og klæber kryds. Denne type vaskulær permeabilitet er forbigående og styres af treparts TMEM-celle komplekset, som forklaret ovenfor5. Evnen til at identificere og kvantificere TMEM-associeret vaskulær permeabilitet er afgørende for vurderingen af en Pro-metastatisk cancer celle mikromiljø, samt for prækliniske undersøgelser, der undersøger effekten af konventionelle cytotoksiske terapier på tumor mikromiljø samt anti-metastatisk potentiale af målrettede og ikke-målrettede terapier. Det er vigtigt, at vi her har demonstreret, at denne vurdering kan foretages ved enten intravital billeddannelse eller immunofluorescens i fast væv. Begge tilgange har deres fordele og ulemper. Intravital Imaging giver mulighed for direkte visualisering af den dynamiske proces med vaskulær permeabilitet, men kræver specialiseret udstyr og træning. På den anden side tilbyder immunofluorescens udført i fast væv kun et statisk billede, men kan rutinemæssigt udføres i de fleste laboratorier.

Kræftpatienter er almindeligt behandlet med en form for systemisk terapi, og succesen med systemisk behandling er normalt vurderes ved evaluering af parametre relateret til kræft celle overlevelse såsom apoptose, proliferation, eller grov tumorstørrelse. Men, det er lige så vigtigt at forstå, hvordan disse systemiske terapier påvirker kræft celle udbredelse i betragtning af, at de fleste kræftrelaterede dødelighed opstår på grund af metastase, en proces, der involverer både kræft celle spredning samt cancer celle udbredelse1. For eksempel, nylige undersøgelser har vist, at kemoterapi kan fremkalde en betydelig stigning i tætheden af tmem døråbninger i mus og human brystkræft48,49. Desuden, det blev påvist, at kemoterapi inducerer TMEM aktivitet og resulterer i hæmatogen udbredelse af kræftceller, øget cirkulerende kræftceller, og øget lungemetastaser48. Den kemoterapi-induceret stigning i tmem aktivitet kan blokeres ved systemisk administration af lægemiddel, der hæmmer TIE2 funktion og derfor tmem aktivitet, kaldet rebastinib14,48. Således kan de protokoller, der er beskrevet her, tilbyde værdifulde slutpunkts målinger for effekten af forskellige systemiske behandlinger på TMEM-aktivitet gennem sammenligningen af behandlede til ikke-behandlede kohorter af mus.

I de seneste år er begrebet antiangiogen kræftbehandling blevet revideret, hvilket tyder på, at en vaskulær "normaliserings strategi" (dvs. den forbigående rekonstitution af blodkar Pens unormale struktur og funktion) kan være at foretrække frem for at målrette blodkar til destruktion, da det gør neovaskulatur mere effektiv til levering af medicin50,51,52,53,54. I lyset af denne nye hypotese har andre grupper også udviklet analyser til vurdering af vaskulær permeabilitet og til afprøvning af effektiviteten af vaskulære normaliserings strategier55. Det bør nævnes, at disse metoder principielt anvendes til at vurdere de TMEM-uafhængige former for vaskulær permeabilitet. Derfor er udvælgelsen af den mest hensigtsmæssige vaskulære permeabilitet analyse afhænger af omfanget af en undersøgelse, og forskerne skal sikre, at de forstår anvendeligheden af hver af de offentliggjorte vaskulære permeabilitet assays, før du anvender dem til deres Undersøgelser.

Som nævnt ovenfor har hver af de to metoder, der er beskrevet her, visse fordele i forhold til den anden. For eksempel, måling "sprængning permeabilitet" in vivo tilbyder værdifuld kinetisk information, men da sprængning er en sjælden begivenhed, forlænget billeddannelse sessioner af flere timer hver kan være forpligtet til at være i stand til at opnå tilstrækkelige data. Derudover kræver intravital Imaging specialiseret udstyr, som ikke kan stilles til rådighed for alle efterforskere. På den anden side er evaluering af TMEM-aktiviteten i faste væv relativt let at udføre og kræver kun Standardlaboratorieudstyr. Desuden er analysen af TMEM-aktiviteten i faste væv lettere at fortolke, men mangler kinetisk information. Desuden er den faste vævsanalyse mindre specifik, da den kan opfange kumulativ lækage af dextran over tid fra transcellulær og paracellulær vaskulær permeabilitet af intakt endothelia eller endda en pludselig lækage hændelse på grund af spontan vaskulær skade. Den synergistiske anvendelse af de to metoder ville således gøre fortolkningen af den TMEM-medierede vaskulære permeabilitet mere specifik og mere følsom. Selv om vi ikke eksplicit har afprøvet andre anvendelser af de teknikker, der præsenteres her, kan de vise sig nyttige til at undersøge induceret fartøjs permeabilitet, for eksempel ved infektion eller ved farmaceutiske terapier.

Kort sagt, måling af TMEM-associeret vaskulær permeabilitet, som skitseret af to uafhængige metoder her, giver nyttige værktøjer til vurdering af den Pro-metastatisk tumor mikromiljø og dens tilknyttede TMEM aktivitet, og kan bruges til nogle i et hvilket som helst laboratorium. Disse metoder er særligt nyttige i den prækliniske vurdering af effekten af systemiske terapier på kræftcellernes udbredelse. Desuden kan de bruges til at vurdere effekten af agenter, der kan blokere kemoterapi-induceret TMEM aktivitet, og endelig, disse metoder kan anvendes til at vurdere den bedste kombinationsbehandling tidligere fase I patient forsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne afslører ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke den analytiske Imaging Facility (AIF) i Albert Einstein College of Medicine for Imaging support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIC (P30CA013330, CA150344, CA 100324 og CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Gruss-Lipper Biophotonics Center og dets integrerede billedbehandlings program, og Montefiore 's Ruth L. Kirschstein T32 uddannelse tilskud af kirurger til studiet af tumor mikromiljø (CA200561).

GSK co-skrev manuskriptet, udførte Imaging for figur 1c og 3b, udviklet fast vævsanalyse protokol, og analyseret og fortolket alle data; JMP co-skrev manuskriptet, og udførte kirurgi og intravital Imaging for figur 1b, 2C og 3A; LB & AC udført operationen og intravital Imaging for figur 2b; RJ udførte operationen og intravital billeddannelse for figur 2a; JSC co-skrev manuskriptet og analyserede og fortolkede alle data; MHO co-skrev manuskriptet og analyserede og fortolkede alle data; og de udførte kirurgi og intravital Imaging for figur 2D, co-skrev manuskriptet, udviklede fast vævsanalyse og intravital Imaging protokoller, og analyseret og fortolket alle data.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Tags

Retraktion intravital billeddannelse immunofluorescens blodkar permeabilitet tumor mikromiljø af metastase (TMEM) høj molekylvægt dextran immunofluorescens metastase
Vurdering tumor mikromiljø af metastase døråbning-medieret vaskulær permeabilitet forbundet med kræft celle udbredelse ved hjælp af Intravital Imaging og fast vævsanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J.… More

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter