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Cancer Research

मेटास्टेसिस डोरवे के ट्यूमर माइक्रोएनेवायरनमेंट का आकलन-मध्यस्थ संवहनी स्थायित्व कैंसर सेल प्रसार के साथ जुड़े इंट्राविटल इमेजिंग और फिक्स्ड ऊतक विश्लेषण का उपयोग कर

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59633
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2,3,4, 1,2,3,5, 1,2,3
1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

Summary

हम मेटास्टेसिस के ट्यूमर microenvironment के साथ जुड़े क्षणिक संवहनी permeability का आकलन करने के लिए दो तरीकों का वर्णन (TMEM) द्वार समारोह और कैंसर सेल intravasation उच्च आणविक वजन के अंतःशिरा इंजेक्शन का उपयोग कर (155 kDa) चूहों में डेक्सट्रान. तरीकों में जीवित जानवरों में इंट्राविटल इमेजिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके निश्चित ऊतक विश्लेषण शामिल हैं।

Abstract

कैंसर से संबंधित मृत्यु का सबसे आम कारण मेटास्टेसिस है, एक प्रक्रिया है कि प्राथमिक ट्यूमर से माध्यमिक साइटों के लिए कैंसर की कोशिकाओं के प्रसार की आवश्यकता है. हाल ही में, हम स्थापित किया है कि प्राथमिक स्तन कैंसर में कैंसर सेल प्रसार और फेफड़ों में metastatic साइटों पर केवल दरवाजे पर होता है Metastasis के ट्यूमर MicroEnvironment बुलाया (TMEM). TMEM द्वार संख्या स्तन कैंसर के रोगियों में मेटास्टैटिक रोग की दूर पुनरावृत्ति के लिए पूर्वानुमान है. TMEM द्वार एक कैंसर सेल से बना है जो actin नियामक प्रोटीन Mena एक perivascular, proangiogenic मैक्रोफेज जो TIE2 और VEGF, जहां इन दोनों कोशिकाओं के दोनों कसकर एक रक्त से बंधे हैं के उच्च स्तर को व्यक्त के साथ सीधे संपर्क में व्यक्त करता है वाहिका अंत:कक्षीय कोशिका. कैंसर कोशिकाओं TMEM दरवाजे के माध्यम से intravasate कर सकते हैं क्षणिक संवहनी पारगम्यता के कारण TMEM-संबद्ध मैक्रोफेज और TMEM संबद्ध Mena-expressing कैंसर सेल की संयुक्त गतिविधि द्वारा आर्केस्ट्रा. इस पांडुलिपि में, हम TMEM के आकलन के लिए दो तरीकों का वर्णन-मध्यस्थ क्षणिक पारगम्यता: intravital इमेजिंग और निश्चित ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसेंस. हालांकि दोनों तरीकों को अपने फायदे और नुकसान है, दोनों के संयोजन TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता का सबसे पूरा विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं और साथ ही TMEM समारोह के लिए सूक्ष्म पर्यावरण ीय वस्तुएँ. स्तन कैंसर में metastatic प्रक्रिया के बाद से, और संभवतः कैंसर के अन्य प्रकार, TMEM द्वार के माध्यम से कैंसर सेल प्रसार शामिल है, यह TMEM द्वार गतिविधि के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीकों को रोजगार के लिए आवश्यक है. यहाँ वर्णित दो तरीकों TMEM द्वार गतिविधि के विश्लेषण के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, या तो भोले या औषधीय इलाज जानवरों में, जो एजेंटों है कि कैंसर सेल को रोकने के पूर्व नैदानिक परीक्षणों के लिए सर्वोपरि महत्व का है TMEM के माध्यम से प्रसार.

Introduction

कैंसर मेटास्टेसिस की हमारी समझ में हाल ही में प्रगति का पर्दाफाश किया है कि उपकला-से-मेसेन्काइमल संक्रमण (ईएमटी) और एक प्रवासी / इनवेसिव कैंसर सेल उप-जनसंख्या को शामिल करने, अपने आप में, हेमेटोजेनसज प्रसार के लिए पर्याप्त नहीं हैं 1.वास्तव में, यह पहले सोचा था कि कैंसर की कोशिकाओं को कैंसर से जुड़े endothelium की संपूर्णता के माध्यम से metastasizing के रूप में ट्यूमर neovasculature अक्सर कम pericyte कवरेज की विशेषता है, और इस तरह के रूप में, अत्यधिक पारगम्य है और अस्थिर2,3,4. हालांकि ट्यूमर के भीतर दोषपूर्ण कार्यों के अत्यधिक विचारोत्तेजक, carcinogenesis के दौरान संवहनी संशोधनों से प्रति सबूत प्रदान नहीं करते हैं कि ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से और एक अनियंत्रित फैशन में रक्त वाहिकाओं घुसना कर सकते हैं. इंट्राविटल इमेजिंग (आईवीआई) अध्ययन से अंतर्दृष्टि, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट-टैग किए गए हैं और वास्कुल्चर को फ्लोरोसेंट जांच (जैसे डेक्सट्रान या क्वांटम डॉट्स) के अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से लेबल किया जाता है, यह दिखाते हैं कि, जबकि ट्यूमर वाहिकाओं समान रूप से होते हैं कम आणविक वजन dextrans करने के लिए पारगम्य (उदा. 70 केडी), उच्च आणविक वजन डेक्सट्रांस (155 केडी) और ट्यूमर कोशिकाओं केवल intravasation के विशेष स्थलों पर endothelium पार कर सकते हैं जो अधिमानी संवहनी शाखा बिंदु5 पर स्थित हैं 6 , 7. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) पशु मॉडल और मानव रोगी व्युत्पन्न सामग्री का उपयोग कर विश्लेषण से पता चला है कि इन साइटों "द्वार" है कि संवहनी पारगम्यता को विनियमित करने में विशेषज्ञ हैं, स्थानीय और क्षणिक, की एक संक्षिप्त खिड़की प्रदान प्रर्कुलित कैंसर कोशिकाओं के संचलन में प्रवेश करने का अवसर। इन दरवाजे कहा जाता है "मेटास्टेसिस के ट्यूमर Microenvironment" या "TMEM", और, काफी उम्मीद है, उनके घनत्व स्तन कैंसर के रोगियों में मेटास्टैटिक रोग के विकास का एक बढ़ा जोखिम के साथ संबंधित8,9, 10|

प्रत्येक TMEM द्वार कोशिकाओं के तीन अलग अलग प्रकार के होते हैं: एक perivascular मैक्रोफेज, एक ट्यूमर सेल अधिक actin-नियामक प्रोटीन स्तनधारी सक्षम (Mena), और एक endothelial सेल, एक दूसरे के साथ प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क में सभी1, 5,9,10,11,12,13. एक intravasation द्वार के रूप में TMEM के समारोह के लिए महत्वपूर्ण घटना परिसंवहनी मैक्रोफेज14द्वारा अंतर्निहित पोत पर संवहनी endothelial विकास कारक (VEGF) के स्थानीयकृत रिलीज है. VEGF endothelial कोशिकाओं के बीच homotypic जंक्शनों को बाधित कर सकते हैं15,16,17 ,18,19, एक घटना है कि क्षणिक संवहनी रिसाव में परिणाम , भी के रूप में जाना जाता है "विस्फोट" पारगम्यता के रूप में IVI अध्ययन में वर्णित 5| TMEM मैक्रोफेज tyrosine kinase रिसेप्टर TIE2 व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है, जो VEGF-मध्यस्थ TMEM समारोह के लिए आवश्यक है और perivascular आला करने के लिए इन मैक्रोफेज के homing5,20,21 , 22. कैंसर कोशिका प्रसार और मेटास्टेसिस को विनियमित करने के अलावा , TIE2+ मैक्रोफेज ट्यूमर एंजियोजेनेसिस21,22,23के केंद्रीय नियामकों के रूप में दिखाया गया है, 24,25,26,27,28,29,30,31. इस तरह के रूप में, TIE2+ मैक्रोफेज ट्यूमर microenvironment के एक महत्वपूर्ण घटक और metastatic झरना के मुख्य नियामक का प्रतिनिधित्व करते हैं.

बेहतर अवधारणा TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता (यानी "विस्फोट"), यह बहुत महत्वपूर्ण है यह संवहनी पारगम्यता के अन्य तरीकों से अलग है कि endothelial सेल सेल जंक्शनों के विघटन के साथ संबद्ध नहीं हैं. एक बरकरार एंडोथेलियम में (जिसके तंग और अनुयायी जंक्शनों को बाधित नहीं किया जाता है), संवहनी पारगम्यता के तीन मुख्य प्रकार हैं: (क) pinocytosis, जो हो सकता है, या नहीं, ingested सामग्री के transcytosis के लिए युग्मित किया जा सकता है; (ख) अंत:प्रर्णोदित फेन्स्स्ट्रा के माध्यम से सामग्री का परिवहन; और (ग) परकोशिकीय मार्ग के माध्यम से सामग्री का परिवहन, जो अंत:मंडलीय तंग जंक्शनों15,16,17,18,19,32 द्वारा विनियमित किया जाता है , 33 , 34. यद्यपि कई ट्यूमरों में अविनियमित, संवहनी पारगम्यता के उपर्युक्त साधनों का वर्णन अधिकांशत सामान्य ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान और होमियोस्टेसिस के संदर्भ में किया गया है, जिनमें से चरम सीमाएं या तो सीमित पारगम्यता के ऊतक हैं ( उदा., रक्त मस्तिष्क बाधा, रक्त-परीक्षण बाधा), या प्रचुर पारगम्यता (उदा., गुर्दे ग्लोमेरुलर उपकरण के fenestrated केशिकाओं)34,35,36,37.

multiphoton intravital इमेजिंग और बहुसंकेतित इम्यूनोफ्लोरेसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, हम TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता ("विस्फोट") और स्तन ट्यूमर में संवहनी पारगम्यता के अन्य तरीकों के बीच अंतर करने में सक्षम हैं। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम चूहों में एक उच्च आणविक वजन, फ्लोरोसेंट-लेबल जांच का एक भी अंतःशिरा इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं। सहज फट घटनाओं तो लाइव चूहों में intravital इमेजिंग का उपयोग कर कब्जा किया जा सकता है; या वैकल्पिक रूप से, जांच के extravasation रक्त vasculature के साथ सह-स्थानीयकरण अध्ययन द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए CD31+ या Endomucin+) और TMEM दरवाजे इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन तकनीकों, जो या तो स्वतंत्र रूप से या एक दूसरे के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों का वर्णन.

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Protocol

जीवित पशुओं का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग पशु उपयोग और देखभाल दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किए जाने चाहिए. इस अध्ययन में वर्णित प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग के विषय में स्वास्थ्य नियमों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार और चिकित्सा पशु देखभाल और उपयोग के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज के अनुमोदन के साथ किया गया समिति (IACUC).

1. लाइव पशु इमेजिंग का उपयोग कर "विस्फोट पारगम्यता" का मूल्यांकन

  1. फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज के साथ माउस मेजबान में syngeneic स्तन ट्यूमर के प्रत्यारोपण
    1. प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त ट्यूमर ऊतक के टुकड़े उत्पन्न.
      1. सहज पार करके माउस स्तन कैंसर मॉडल में फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर उत्पन्न, autochthonous, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस स्तन कैंसर मॉडल MMTV-PyMT चूहों ट्रांसजेनिक चूहों के साथ फ्लोरोसेंट पत्रकारों व्यक्त38, 39 [जैसे, बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP), बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ECFP), या Dendra2].
      2. फ्लोरोसेंट लेबल ट्यूमर के साथ MMTV-PyMT चूहों की अनुमति दें 2 सेमी (लगभग 10-12 उम्र के सप्ताह) से बड़ा नहीं का एक आकार के लिए विकसित करने के लिए.
      3. सभी श्वसन बंद होने के बाद 30 सेकंड तक 5% isoflurane के साथ एक कक्ष में रखकर MMTV-PyMT चूहों असर ट्यूमर Euthanize.
      4. एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन.
      5. एक सामयिक depilatory क्रीम का उपयोग कर इच्छामृत्यु माउस के पेट से बाल निकालें.
      6. बर्फ पर DMEM/F12 सेल संस्कृति माध्यम के साथ एक पेट्री पकवान रखें।
      7. धुएं के हुड में बर्फ पर माउस और पेट्री पकवान रखें।
      8. 70% एथिल अल्कोहल के साथ माउस के पेट को साफ करें।
      9. बाँझ दस्ताने और शल्य चिकित्सा उपकरण का उपयोग करना (स्टीलाइज्ड कैंची, संदंश, और ब्लेड) ट्यूमर को हटाने और उन्हें पेट्री डिश में जगह है.
      10. ट्यूमर को छोटे टुकड़ों में काटें (2 मिमी x 2 मिमी x 2 मिमी आकार में), किसी भी नेक्रोटिक भागों को खारिज करते हुए, जबकि वे पेट्री डिश में हैं।
    2. प्राप्तकर्ता मेजबान में ट्यूमर टुकड़े प्रत्यारोपण.
      1. आनुवंशिक रूप से इंजीनियर फ्लोरोसेंट-लेबल मैक्रोफेज के साथ चूहों उठाएँ, जैसे, MacGreen40 या MacBlue 41 चूहों (Csf1r -GAL4VP16/
      2. फ्लोरोसेंट लेबल मैक्रोफेज के साथ FVB चूहों $ 4-6 सप्ताह की उम्र के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।
      3. एक वाहक गैस के रूप में ऑक्सीजन के साथ 5% isoflurane का उपयोग कर एक कक्ष में फ्लोरोसेंट लेबल मैक्रोफेज के साथ FVB चूहों Anesthetize.
      4. संज्ञाहरण को कम करने के लिए $3% isoflurane और सुखाने को रोकने के लिए माउस की आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं।
      5. माउस के 4वें स्तन ग्रंथि से बाल निकालें.
      6. बीटाडीन के साथ त्वचा को साफ करें। यह प्रक्रिया के बाकी भर में बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. यह बाँझ उपकरणों और अभिकर्मकों का उपयोग भी शामिल है.
      7. एक छोटा सा चीरा $2-3 मिमी सिर्फ 4वें निप्पल से कम करें।
      8. स्तन वसा पैड उजागर किया जाता है जब तक विच्छेदन.
      9. कृत्रिम extracellular मैट्रिक्स में पेट्री डिश और कोट से एक ट्यूमर टुकड़ा ले लो.
      10. 4वें स्तन वसा पैड के नीचे प्रत्यारोपण ट्यूमर.
      11. साइनोक्रिलेट चिपकने वाला का उपयोग कर चीरा बंद करें।
      12. लगातार जानवर की निगरानी जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक हो जाता है और कठोर recumbency बनाए रखने में सक्षम है. इसके अलावा, पूरी वसूली तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए जानवर वापस करने के लिए नहीं है।
      13. संक्रमण को कम करने के लिए, जानवर की पीने के पानी की बोतल (8 fl ऑउंस) के लिए 100 मिलीग्राम/एमएल एनरोफ्लोक्सासिन एंटीबायोटिक का 1 एमएल जोड़ें।
      14. ट्यूमर स्पष्ट जब तक विकसित करने के लिए अनुमति दें ($ 5 मिमी; $ 4 सप्ताह).
      15. प्रयोग के आधार पर, चूहों को उपचार समूहों में आवंटित करें, और यदि लागू हो तो इसी उपचार करें।
  2. इंट्राविटल इमेजिंग के लिए सेटअप करें
    1. माइक्रोस्कोप के दो फोटोलेजर और डिटेक्टर चालू करें।
    2. हीटिंग बॉक्स को चालू करें और माइक्रोस्कोप के एक्स-वाई चरण को पहले से गर्म करें।
    3. कस्टम-निर्मित चरण को x-y चरण में 42 डालें.
  3. इमेजिंग विंडो की तैयारी
    1. इमेजिंग के लिए स्थापित करने से पहले, कस्टम बनाया परिपत्र इमेजिंग खिड़की फ्रेम42autoclave.
    2. खिड़की के फ्रेम के लिए cyanoacrylate चिपकने वाला की एक पतली परत जगह और एक 8 मिमी परिपत्र कवर ग्लास जगह में affix करने के लिए एक पिपेट या एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें।
      नोट: 1) कवर ग्लास के स्पष्ट एपर्चर पर अवशेषों को प्राप्त करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। 2) इमेजिंग के लिए उपयोग करने से पहले कम से कम 1 एच विंडो फ्रेम करने के लिए कवर ग्लास का पालन करना महत्वपूर्ण है।
    3. एसीटोन की एक छोटी राशि के साथ गीला प्रयोगशाला पोंछ का उपयोग कर कवर ग्लास के स्पष्ट एपर्चर पर किसी भी अतिरिक्त cyanoacrylate साफ ध्यान से पोंछें।
  4. इमेजिंग के दौरान तरल पदार्थ और फ्लोरोसेंट रंगों के प्रशासन के लिए पूंछ नस कैथेटर की तैयारी
    1. एक पूंछ नस कैथेटर का निर्माण करने के लिए पॉलीथीन ट्यूबिंग के एक 30 सेमी टुकड़ा काट।
    2. अपने लूर टेपर से 30 जी सुई के सुई भाग को धीरे से सुई को आगे-पीछे झुकाकर जब तक वह टूट न जाए।
      नोट: सुई Luer टेपर और नहीं सुई टिप के करीब आयोजित किया जाना चाहिए. सुई छड़ी चोट को रोकने के क्रम में सुई को समझने के लिए प्लास या संदंश के साथ यह किया जा सकता है।
    3. पॉलीथीन ट्यूबिंग के एक छोर में सुई के कुंद अंत डालें।
    4. एक और 30 जी सुई के तेज अंत डालें, अपने Luer टेपर संलग्न रखते हुए, ट्यूबिंग के विपरीत अंत करने के लिए.
    5. फॉस्फेट बफर्ड नमकीन के साथ एक 1 सीसी सिरिंज भरें, इसे इकट्ठे कैथेटर के लूर टेपर से संलग्न करें, और टेल नस कैथेटर को फ्लश करें जो यह सुनिश्चित करते हैं कि सिस्टम में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
    6. संवहनी लेबलिंग के लिए, 10 मिलीग्राम/किलोग्राम 155 केडीए डेक्सट्रान-टेट्रामेथिलहोडामाइन (टीएमआर) या क्वांटम डॉट्स के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ 1 सीसी सिरिंज भरें।
  5. इमेजिंग के लिए माउस की तैयारी
    1. नीचे एक पिंजरे में माउस Anesthetize ($1 पैर नीचे) एक गर्मी दीपक का उपयोग कर 4%-5% isoflurane 100% ऑक्सीजन के साथ मिश्रित 1.5-2 एल प्रति मिनट के प्रवाह के लिए सेट.
    2. सर्जिकल कार्य क्षेत्र पर गर्मी दीपक चालू करें। यह कदम सर्जरी के दौरान माउस के कोर शारीरिक शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. गर्मी दीपक के नीचे माउस प्लेस और सर्जरी की अवधि के लिए 2%-3% के लिए संज्ञाहरण कम.
      नोट: एक सुरक्षित दूरी पर गर्मी दीपक रखने के लिए सुनिश्चित करें ($ 1 फुट) माउस से दूर overheating से बचने के लिए.
    4. आंखों और अंधापन के सुखाने को रोकने के लिए माउस की आंखों पर नेत्र मलम रखें।
    5. परीक्षण करें कि माउस को टो-पिंच परीक्षण करके एनेस्थेट किया जाता है। यदि जानवर वापस ले लेता है, तो आइसोलुरेन की खुराक में 1% की वृद्धि करें और 1-2 मिनट में फिर से परीक्षण करें।
    6. संभव पूंछ पर सबसे distal बिंदु में पूंछ नस कैथेटर डालें.
    7. पूंछ की नस कैथेटर को प्रयोगशाला टेप के एक छोटे से टुकड़े के साथ जोड़ना जो पूंछ के चारों ओर लपेटता है और सुई से चिपक जाता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह disloged नहीं मिलता है।
    8. पर्याप्त जलयोजन प्रदान करने के लिए पूंछ नस कैथेटर के माध्यम से पीबीएस के प्रति एच 50 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन। यह बहुत अधिक तरल पदार्थ इंजेक्शन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है (कोई अधिक से अधिक 200 $L प्रति एच) या कैथेटर में किसी भी बुलबुले के रूप में यह माउस के लिए घातक हो सकता है.
    9. 4वें और 5वें स्तन ग्रंथियों पर पेट पर बाल निकालें depilatory क्रीम का उपयोग कर.
    10. बीटाडीन के साथ त्वचा को साफ करें और त्वचा को सूखने दें।
    11. एक अनुदैर्घ्य मिडलाइन चीरा तुरंत जननांगों से बेहतर शुरू करने और 4वें स्तन ग्रंथि के बेहतर पहलू के स्तर तक चीरा ले.
    12. 4वें स्तन ग्रंथि के बेहतर पहलू के लिए अनुयुत चीरा ले. यह इस बिंदु पर रक्त की आपूर्ति समझौता से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
    13. बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग कर एक ऊतक फ्लैप बनाने peritoneum बंद स्तन वसा पैड विच्छेदन.
      नोट: त्वचा फ्लैप इमेजिंग महत्वपूर्ण गति कलाकृतियों और ऊतक निर्जलीकरण के लिए अतिसंवेदनशील है. ये बचा रहे हैं, के रूप में पहलेवर्णित 43,44, फ्लैप की त्वचा की ओर पीछे रबर का एक कठोर टुकड़ा affixing द्वारा (मृदु ऊतक कड़ा और यह शरीर के बाकी हिस्सों से अलग करने के लिए) और फिर एक उथले इमेजिंग में ट्यूमर रखने खिड़की जलयोजन को संरक्षित करने के लिए. यह स्थिर इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि इस सेटिंग में ट्यूमर और आसपास के ऊतक बहुत अनुरूप हैं।
    14. affixing द्वारा त्वचा फ्लैप स्थिर (cyanoacrylate गोंद के साथ) फ्लैप की त्वचा की ओर करने के लिए 2 सेमी x 2 सेमी को मापने कठोर रबर का एक छोटा सा टुकड़ा. ट्यूमर रबर द्वारा स्थिर किया जा रहा क्षेत्र के केंद्र में होना चाहिए।
    15. पीबीएस की बूंदों के साथ उजागर ऊतक हाइड्रेटेड रखें।
    16. कस्टम बनाया इमेजिंग विंडो फ्रेम के बाहरी रिम करने के लिए cyanoacrylate की एक छोटी सी फिल्म लागू करें।
    17. कवर कांच के केंद्र पर पीबीएस ($10-20 डिग्री सेल्सियस) की एक छोटी छोटी छोटी छोटी बूंद लागू करें।
    18. एक प्रयोगशाला पोंछे के साथ आसपास के फ्लैप ऊतक सूखी. यह सुनिश्चित करें कि खिड़की के फ्रेम पर cyanoacrylate कांच पर पीबीएस के साथ संपर्क में नहीं आता है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह cyanoacrylate बहुलक और समय से पहले सेट करने के लिए पैदा कर सकता है।
    19. स्पष्ट एपर्चर के केंद्र में ट्यूमर के साथ ऊतक फ्लैप करने के लिए छोटे इमेजिंग खिड़की affix.
    20. मंच से हीटिंग बॉक्स निकालें.
    21. एनेस्थेटाइज्ड माउस और पूंछ नस कैथेटर को माइक्रोस्कोप चरण में स्थानांतरित करें। पूंछ नस कैथेटर बाहर गिर नहीं करता है यह सुनिश्चित करने के लिए अत्यधिक सावधानी का प्रयोग करें।
    22. प्रवण स्थिति में मंच पर माउस रखें.
    23. संज्ञाहरण के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए स्नाउट पर आइसोफ्लुरेन की नाक शंकु रखें।
    24. कस्टम x-y चरण प्लेट पर बोर में विंडो डालें.
    25. एक शारीरिक तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग बॉक्स को वापस मंच पर रखें।
    26. वापस पंजा करने के लिए क्लिप सेंसर के माध्यम से एक पल्स oximeter जांच संलग्न द्वारा पशु के महत्वपूर्ण संकेत की निगरानी.
    27. धीरे-धीरे कमी 0.5%-1% करने के लिए पर्याप्त रक्त प्रवाह बनाए रखने और माउस anesthetizing से बचने के लिए isoflurane है.
  6. अंतःस्त्वीय इमेजिंग
    नोट: इमेजिंग हम इस खंड में वर्णन एक कस्टम निर्मित दो लेजर multiphoton माइक्रोस्कोप है कि पहले5,39,45वर्णित किया गया है पर प्रदर्शन किया गया था. संक्षेप में, एक femtosecond लेजर उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है 90 femtosecond स्पंदित लेजर प्रकाश 880 एनएम पर केंद्रित. एक साथ प्राप्त डिटेक्टरों चार में से तीन के साथ फ्लोरोसेंट प्रकाश का पता चला है (ब्लू $ 447/60, ग्रीन - 520/65, और लाल 580/60; केंद्रीय तरंगदैर्ध्य /बैंडविड्थ) एक dichroic द्वारा उत्तेजना प्रकाश से जुदाई के बाद (क्रोमा, $720DCXXR). माइक्रोस्कोप स्टैंड में 25x, 1.05 एनए (संख्यात्मक एपर्चर) लंबी कार्य दूरी (2 मिमी) परविदृश्य लेंस होता है। यह ध्यान दें कि महत्वपूर्ण है, जबकि हम एक कस्टम निर्मित माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया है, नीचे वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध multiphoton माइक्रोस्कोप पर पूरा किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से.
    1. ऑप्टिकल संपर्क बनाने के लिए 25x, 1.05 एनए माइक्रोस्कोप उद्देश्य और खिड़की के कवर ग्लास के बीच आसुत पानी की एक बूंद रखें।
    2. खिड़की की सतह के पास फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं के साथ क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप नेत्रिका का प्रयोग करें।
    3. बहते रक्त वाहिकाओं का पता लगाएं और मैक्रोफेज लेबल। वाहिकाकी की गतिशीलता का आकलन करने के लिए रक्त वाहिकाओं को बहना महत्वपूर्ण है।
    4. माइक्रोस्कोप को मल्टीफोटोन मोड में स्विच करें।
    5. किसी z-श्रृंखला की ऊपरी और निचली सीमाएँ सेट करें, जो लगभग 50 डिग्री उ मापती है.
      1. सबसे सतही स्थिति पर, इच्छित प्रारंभ स्थान पर, उद्देश्य को स्थानांतरित करने के लिए फोकस समायोजक का उपयोग करके z-श्रृंखला की ऊपरी सीमा निर्धारित करें, और इस स्थिति को $ स्थिति शीर्ष बटन पर क्लिक करके सॉफ़्टवेयर के भीतर शून्य के रूप में चिह्नित करें।
      2. z-श्रृंखला की निचली सीमा निर्धारित करें जो उद्देश्य को सबसे गहरी परत पर ले जाती है (आमतौर पर छोटे ट्यूमर के लिए शीर्ष से 50-70 $m) और $ स्थिति नीचे बटन पर क्लिक करें।
      3. z-चरण आकार को 5 $m पर सेट करें.
    6. समय चूक पैनल बटन पर क्लिक करें और उद्देश्य लेंस के ऊपर पानी की भरपाई करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने के लिए कम से कम 10 s करने के लिए अधिग्रहण के बीच समय अंतराल निर्धारित करें। यह लंबे समय चूक के दौरान उद्देश्य पर एक निचोड़ पिपेट के साथ मैन्युअल रूप से किया जाता है।
    7. पूंछ की नस कैथेटर में पीबीएस के साथ सिरिंज निकालें और इसे 155 केडीए डेक्सट्रान-टीएमआर (टेट्रामेथिल रोडामाइन) युक्त एक और सिरिंज के साथ बदलें।
    8. पूंछ नस कैथेटर के माध्यम से 155 kDa dextran-TMR के 100 $L इंजेक्शन.
    9. इंजेक्शन के बाद, पीबीएस सिरिंज के साथ TMR सिरिंज की जगह।
    10. एक z-स्टैक समय चूक इमेजिंग प्राप्त करें जेड-स्टैक और समय-लैप्स बटन पर क्लिक करके, फिर रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें।
    11. जानवर के पर्याप्त जलयोजन को बनाए रखने के लिए हर 30-45 मिनट में 50 डिग्री पीबीएस का इंजेक्शन लगाएं। समय पर 200 से अधिक $L इंजेक्शन लगाने से बचें क्योंकि इससे तरल पदार्थ अधिभार हो सकता है।
  7. इच्छामृत्यु
    1. isoflurane को 5% तक बढ़ाएँ और 5% के तहत जानवर को नाक शंकु के साथ जगह में 30 s के बाद श्वसन संघर्ष के बाद रखने के लिए.
    2. मंच से माउस निकालें.
    3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं.
  8. छवि संसाधन
    1. ImageJ में सभी छवियों को लोड और उन्हें एक 5 आयामी hyperstack (एक्स, वाई, जी, टी, और रंग चैनल) में प्रारूप.
    2. वर्णक्रमीय ओवरलैप के पृथक्करण प्रदर्शन (यानी: GFP और CFP) और स्थापित तरीकों का उपयोग कर hyperstacks से x-y बहाव के उन्मूलन38.
    3. पृष्ठभूमि संकेत दिखाई हो जाता है ताकि रक्त चैनल के सफेद स्तर को बढ़ाने के लिए चमक और इसके विपरीत समायोजन का प्रयोग करें.
    4. प्रत्येक z टुकड़ा के लिए, ध्यान से क्षणिक संवहनी रिसाव के संकेत के लिए प्रत्येक फिल्म का निरीक्षण (एक फट"). तेजी से फ्रेम दरों (40 एफपीएस) पर फिल्में चल रहा है इस पहचान सहायता कर सकते हैं.
    5. एक बार एक फट की पहचान की गई है, एक सामान्य स्तर पर इस चैनल के लिए चमक वापस और इस क्षेत्र और z टुकड़ा करने के लिए hyperstack फसल.

2. निश्चित ऊतक विश्लेषण का उपयोग कर अतिरिक्त संवहनी डेक्सट्रन का मूल्यांकन

  1. ट्यूमर और नमूना तैयारी
    नोट: इस प्रोटोकॉल के 2एन डी भाग मानता है कि स्तन ट्यूमर स्तन कार्सिनोमा के एक ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण माउस मॉडल से काटा गया है (यानी MMTV-PyMT). इस मॉडल प्रोटोकॉल के 1सेंट भाग में वर्णित एक के रूप में ही हो सकता है, हालांकि fluorcently लेबल ट्यूमर इस बिंदु पर आवश्यक नहीं हैं.
    1. प्रयोगात्मक पाइप लाइन (यानी दवा उपचार, आदि) की समाप्ति के बाद, चूहों का त्याग करने से पहले 10 मिलीग्राम/एमएल 155 केडीडी डेक्सट्रान-टेट्रामेथिल रोडामाइन, 1 एच के 100 डिग्री सेल्सियस का एक टेल-वेन इंजेक्शन करें।
    2. चूहों बलिदान और स्तन ट्यूमर फसल.
    3. 48-72 एच के लिए 10% फॉर्मेलिन में ट्यूमर को ठीक करें और पैराफिन-एम्बेडिंग के लिए आगे बढ़ें।
    4. एक microtome का उपयोग करना, formalin-fixed पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों से दो 5 मीटर मोटी अनुक्रमिक स्लाइड में कटौती. एक स्लाइड dextran धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि अन्य TMEM ट्रिपल-IHC प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, संदर्भ के लिए.
      नोट: TMEM ट्रिपल-इम्युनोमिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल कहीं और वर्णित किया गया है 10.
  2. यदि धुंधला और दो अनुक्रमिक वर्गों के पहले के लिए स्कैनिंग
    1. स्लाइड्स को मानक डी-पैराफिनाइजेशन प्रोटोकॉल पर सबमिट करें. यह xylene में दो बाद में विसर्जन भी शामिल है (10 मिनट प्रत्येक), क्रमिक पतला शराब समाधान में निर्जलीकरण के बाद (100%, 95%, 70%, और 50% EtOH में एच2ओ के लिए 2 मिनट प्रत्येक विसर्जन).
    2. हीटिंग द्वारा प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन (उबलते बिंदु के करीब) 20 मिनट के लिए साइट्रेट (पीएच 6.0-समायोजित) में डूबे वर्गों।
    3. नमूने 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान को ठंडा और फिर 2 मिनट प्रत्येक धोने के लिए PBS 3x में धो दें.
    4. बफर अवरुद्ध करने में 60-90 मिनट के लिए ब्लॉक (10% FBS; 1% बीएसए; 0.0025% मछली त्वचा जिलेटिन; 0.05% PBST, यानी 0.05% ट्वीन-20 के साथ पीबीएस).
    5. प्राथमिक चूहे और खरगोश एंटीबॉडी जो क्रमशः Endomucin और TMR लक्ष्य के मिश्रण के साथ इनक्यूबेट नमूने, और फिर PBST 3x, 2 मिनट प्रत्येक में धो.
    6. चूहा IgG के खिलाफ माध्यमिक गधा एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ इनक्यूबेट नमूने (एलेक्सा-647 के लिए conzuated) और खरगोश IgG (Alexa-488 के लिए conzuated), और फिर PBST 3x 2 मिनट प्रत्येक में धो.
    7. एक नियमित DAPI धुंधला (यानी 5-6 मिनट के लिए DAPI समाधान में विसर्जन) प्रदर्शन, एक ग्लिसरोल मुक्त "हार्ड" बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड माउंट, और स्कैनिंग तक एक अंधेरे जगह में स्टोर करें।
    8. इष्टतम परिणामों के लिए, स्लाइड्स को डिजिटल संपूर्ण स्लाइड स्कैनर पर स्कैन करें.
  3. छवि विश्लेषण
    1. डिजिटल पैथोलॉजी के लिए उपयुक्त किसी भी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, प्रति मामले 10 हाई पावर फील्ड्स (HPFs) पर कब्जा।
    2. Endomucin (लाल) और TMR (ग्रीन) चैनल TIFF के रूप में अलग-अलग सहेजें।
    3. ImageJ का उपयोग करके, TIFF फ़ाइलें अपलोड करें और उन्हें 8-बिट छवियों में कनवर्ट करें।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के स्तर पर 8 बिट छवियों थ्रेसहोल्ड, और दो binarized छवियों उत्पन्न, Endomucin और TMR दिखा "मास्क".
    5. बाइनरी उपकरण से, एंडोम्यूसिन मास्क पर छेद भरें का चयन करें।
    6. निम्न पाँच प्रकार के रुचि क्षेत्र ों को जनरेट करें और सहेजें: 1) थ्रेशोल्ड dextran छवि को "Dextran ROI" (ROI1), 2) थ्रेसहोल्ड एंडोम्यूसिन छवि के रूप में "संवहनी ROI" (ROI2), 3) उल्टे एंडोमयुसिन छवि को "Extravascular ROI" (ROI3), 4) प्रतिच्छेदित " के रूप में सहेजें Extravascular ROI" और "Dextran ROI" छवि (ROI1 $ ROI3) के रूप में "Extravascular Dextran ROI" (ROI4), और 5) संपूर्ण छवि को "Tumor ROI" (ROI5) के रूप में.
    7. ROI5 क्षेत्र द्वारा ROI4 क्षेत्र विभाजित और प्रतिशत क्षेत्र है कि extravascular dextran पूरे ट्यूमर में शामिल किया गया उत्पन्न करने के लिए 100 से गुणा.
    8. मामले प्रति 10-20 HPFs के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ (ऊतक उपलब्धता के आधार पर) और प्रत्येक मामले के लिए एक औसत अतिरिक्त vascular Dextran (% क्षेत्र) उत्पन्न करते हैं.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल आलेख में वर्णित प्रायोगिक प्रक्रियाओं को संक्षेप में संक्षेप में सारांशित किया गया है और चित्र 1ए-गमें सचित्र किया गया है।

TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता को मापने के लिए ("विस्फोट गतिविधि") और संवहनी पारगम्यता के अन्य साधनों से प्रयोगात्मक शोर को कम करने के लिए (यानी transcellular और paracellular, के रूप में परिचय में समझाया), हम अंतःशिरा प्रदर्शन किया (यानी) उच्च आणविक वजन जांच का इंजेक्शन, जैसे 155 केडीए डेक्सट्रान, टेट्रामेथिल रोडामाइन के साथ संयुग्मी। कम आणविक वजन डेक्सट्रांस संवहनी पारगम्यता के तीन तरीकों में अंतर नहीं किया. हमारे पूर्व अनुभव से पता चला है कि 155 केडीए टीएमआर-Dextran के प्रणालीगत परिसंचरण ने कुशलता से दोनों सामान्य ऊतकों के वास्कुलचर को लेबल किया, जैसे स्तन ग्रंथि और फेफड़े (चित्र 2ए, बी), साथ ही नियोप्लास्टिक ऊतकों के रूप में, जैसे प्राथमिक स्तन कैंसर और स्तन कैंसर फेफड़ों में मेटास्टेसिस (चित्र 2सी, डी)। के रूप में भी पूर्व अध्ययन द्वारा पुष्टि की5,46, 155 केडीए TMR-Dextran इस प्रकार दोनों प्राथमिक और माध्यमिक ट्यूमर साइटों में "विस्फोट" को मापने के लिए एक उपयुक्त जांच है. एक प्राथमिक MMTV-PYMT स्तन ट्यूमर में multiphoton intravital इमेजिंग का उपयोग कर चोटी फट गतिविधि (डॉटेड पीले क्षेत्र) का एक विशिष्ट उदाहरण अभी भी छवियों की एक श्रृंखला के रूप में सचित्र है (चित्र 3ए). फटिंग गतिविधि हमेशा एक TMEM द्वार (डॉटेड सफेद वृत्त) के सहयोग से नोट किया गया था, एक Dend2+ ट्यूमर सेल एक CFP+ मैक्रोफेज और endothelium के स्थानिक संयोजन की विशेषता (चित्र 3ए) जैसा कि उल्लेख किया है, प्रत्येक TMEM द्वार एक perivascular मैक्रोफेज, एक Mena overexpressing ट्यूमर सेल, और एक endothelial सेल, एक दूसरे के साथ सीधे शारीरिक संपर्क में सभी के होते हैं. हालांकि Mena स्पष्ट रूप से इन प्रयोगों में इस्तेमाल माउस मॉडल में लेबल नहीं किया गया है, यह पहले से देर से चरण PyMT कार्सिनोमा47में overexpressed हो दिखाया गया है. यह TMEM दरवाजे की पहचान सरल और ट्यूमर कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से Mena लेबल की जरूरत समाप्त.

निश्चित ऊतक विश्लेषण में TMEM पर निर्भर संवहनी पारगम्यता का आकलन करने के लिए, हम चूहों में इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया जो 14 सप्ताह पुराने MMTV-PyMT दाता चूहों से लिया ट्यूमर खंड के साथ प्रत्यारोपित किया गया प्रदर्शन किया. जब चूहों एक उपयुक्त ट्यूमर आकार तक पहुँच गया, वे 155-kDa TMR-Dextran की एक एकल i.v. खुराक प्राप्त, के रूप में इस प्रोटोकॉल के भाग 2 में वर्णित है, और 1 घंटे के बाद बलिदान कर दिया गया. ट्यूमर के ऊतकों को एकत्र किया गया और आईएफ विश्लेषण के अधीन किया गया। एंडोमोक्यूसिन फ्लोरोसेंट संकेत डेक्सट्रान फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए एक बहिष्करण मुखौटा के रूप में इस्तेमाल किया गया था, उच्च पारगम्य और कम के बीच भेदभाव के लिए अनुमति देता है, या गैर पारगम्य, रक्त वाहिकाओं (चित्र 3बी)। जैसा कि पहले Karagiannis एट अल48में वर्णित है, एक अनुक्रमिक स्लाइड भी पहले से स्थापित TMEM ट्रिपल दाग के साथ दाग और इसी IF स्लाइड के साथ गठबंधन किया गया था. इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने पुष्टि की कि स्तन ट्यूमर ऊतक के भीतर अत्यधिक पारगम्य रक्त वाहिकाओं में कम से कम एक संबद्ध TMEM द्वार है (चित्र 3बी)।

Figure 1
चित्र 1 . प्रक्रिया का सारांश। (A) Dendra-2 लेबल आक्रामक कार्सिनोमा स्तन (हरा) एक ट्रांसजेनिक जानवर से लिया [FVB/N-Tg (MMTV-PyMT)मुल-Tg (MMTV-iCre)Jwp-Tg(loxP-stop-loxP-Pdendra2) Jwp] और छोटे टुकड़ों में काट दिया. एक टुकड़ा तो orthotopically एक और ट्रांसजेनिक जानवर जिसका मैक्रोफेज सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (cyan) द्वारा लेबल किया गया में प्रत्यारोपित किया जाता है [FVB/N-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. ट्यूमर के लिए प्रतिरोपित orthotopically तो विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है, जिसके बाद माउस उचित उपचार हाथ को आवंटित किया जाता है. (बी) एक बार उपचार समाप्त हो गया है, माउस तो intravital इमेजिंग के लिए लिया जाता है. एक बार anesthetized, एक त्वचा फ्लैप सर्जरी तो एक रबर समर्थन के साथ स्थिर किया जाता है. एक उथले इमेजिंग खिड़की तो ट्यूमर पर चिपका है. अंत में, माउस तो माइक्रोस्कोप मंच पर रखा गया है, जहां खिड़की कस्टम बनाया मंच प्लेट में फिट बैठता है और छवियों तो प्राप्त किया जा सकता है. (ग) वैकल्पिक रूप से, ए से माउस उच्च आणविक वजन dextran प्रशासित और 1 घंटे के बाद बलिदान कर दिया है. ट्यूमर तो हटा दिया जाता है, तय है, और पैराफिन embedding के लिए संसाधित. ऊतक के वर्गों में कटौती कर रहे हैं, IHC में TMEM के लिए दाग और IF में dextran और जहाजों, और एक डिजिटल पूरी स्लाइड स्कैनर पर स्कैन. अंत में, दो स्कैन से छवियों गठबंधन कर रहे हैं और देखने के व्यक्तिगत क्षेत्रों विश्लेषण और संवहनी रिसाव के परिमाणीकरण के लिए चुना जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों में टीएमआर-डेक्सट्रान का दृश्य वैस्कुलेचर लेबल किया गया है। (ए) एक ट्रांसजेनिक जानवर के भीतर एक स्वस्थ विकासशील स्तन ग्रंथि की छवि जिसका vasculature TMR-Dextran (लाल), स्तन नलिका उपकला द्वारा लेबल है फ्लोरोसेंट प्रोटीन Dendra-2 (हरा), और मैक्रोफेज एक सियान द्वारा लेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (नीला) ]FVB/N-Tg (loxP-stop-loxP-Pdendra2)Jwp-Tg(Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)]. (बी) स्वस्थ फेफड़ों के ऊतकों को एक चूहे के भीतर फेफड़ों की इमेजिंग विंडो के माध्यम से देखा जाता है जिसका वास्कुलचर टीएमआर-डेक्सट्रान (लाल) द्वारा लेबल किया जाता है। कोलेजन फाइबर से ब्लू जेड एसएचजी। (ग) Dendra2 लेबल आक्रामक वाहिनी कार्सिनोमा एक ट्रांसजेनिक जानवर से लिया [FVB/N-Tg (MMTV-PyMT)mulxTg (MMTV-iCre) Jwp-Tg(loxP-stop-loxP-Pendra2) Jwp] और orttopically एक और ट्रांसजेनिक जानवर में प्रत्यारोपित मैक्रोफेज को सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (नीला) द्वारा लेबल किया गया है -FVB/N-Tg (Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) और TMR-Dextran (लाल) के साथ लेबल वाले जहाजों। (डी) फेफड़े मेटास्टेसिस ट्यूमर कोशिकाओं के iv इंजेक्शन के आठ दिन बाद (E0771; फ्लोरोसेंट प्रोटीन क्लॉवर द्वारा लेबल) एक ट्रांसजेनिक जानवर जिसका मैक्रोफेज सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (cyan) द्वारा लेबल कर रहे हैं में -FVB/N-Tg (Cfms-gal4-vp16)-(UAS-eCFP) ] और vasculature TMR-Dextran (लाल) द्वारा लेबल| कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . इंट्राविटल इमेजिंग और फिक्स्ड ऊतक विश्लेषण का उपयोग कर तेएमईएम-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता कादृश्य। (ए) एक समय से चूक अंत:प्रस्थापित इमेजिंग फिल्म से 155-केडीए टीएमआर-डेक्सट्रान लेबलिंग नव-एंजियोजेनिक जहाजों (लाल) के भीतर एक Dendra-2 लेबल इनवेसिव कार्सिनोमा स्तन के आक्रामक कार्सिनोमा (हरा) एक ट्रांसजेनिक जानवर से लिया -FVB/N-Tg (एमएमटीवी-PyMT)mul-Tg (एमएमटीवी-iCre) Jwp-Tg(loxP-stop-loxP-Pendra2)Jwp] और ऑर्थोटॉपिक रूप से एक और ट्रांसजेनिक जानवर में प्रत्यारोपित किया गया जहां मैक्रोफेज को सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सियान) द्वारा लेबल किया गया था [एफवीबी/एन-टीजी(सीएफएम-gal4-vp16)-(UAS-eCFP)-(UAS-eCFP)। डॉटेड पीली रेखा क्षणिक संवहनी रिसाव क्षेत्र की रूपरेखा को पहले (t $ 0)), के दौरान (t ] 17') और उसके बाद (t $ 52') रिसाव (विस्फोट) घटना को दर्शाता है। तेज सफेद वृत्त एक TMEM द्वार करने के लिए अंक, के रूप में लाइव इमेजिंग में कब्जा कर लिया. (बी) मल्टीचैनल इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऑफ एंडोमुसिन (प्रथम कॉलम), 155-केडीए डेक्सट्रन-टीएमआर (दूसरा कॉलम), डीएपीआई (तीसरा कॉलम), थ्रेसहोल्ड रक्त वाहिका और अतिरिक्त संवहनी डेक्सट्रन मास्क (चौथा कॉलम) के साथ उनकी मर्ज की गई छवि, और एमएमटीवी-पीएमटी चूहों में TMEM IHC (पांचवें स्तंभ) के इसी अनुक्रमिक अनुभाग। शीर्ष पंक्ति: संवहनी प्रोफ़ाइल TMEM से दूर, एक "गैर-लेकी" संवहनी प्रोफ़ाइल के रूप में प्रदर्शित होने. नीचे पंक्ति: TMEM संबद्ध संवहनी प्रोफ़ाइल, एक "लकी" संवहनी प्रोफ़ाइल के रूप में प्रदर्शित होने. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ, हम दो प्रोटोकॉल है कि कल्पना और संवहनी पारगम्यता जो TMEM द्वार पर मौजूद है और संवहनी तंग और adherens जंक्शनों के विघटन के साथ जुड़ा हुआ है की एक विशिष्ट प्रकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता रूपरेखा. संवहनी पारगम्यता के इस प्रकार क्षणिक और त्रिपक्षीय TMEM सेल परिसर द्वारा नियंत्रित है, के रूप में ऊपर समझाया5. की पहचान करने और TMEM संबद्ध संवहनी पारगम्यता की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने की क्षमता एक समर्थक मेटास्टैटिक कैंसर सेल microenvironment के आकलन के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही पूर्व नैदानिक अध्ययन है कि ट्यूमर पर पारंपरिक cytotoxic उपचार के प्रभाव की जांच के लिए सूक्ष्म पर्यावरण के साथ-साथ लक्षित और गैर-लक्षित चिकित्साकी एंटी-मेटास्टैटिक क्षमता। महत्वपूर्ण बात, हम यहाँ प्रदर्शन किया है कि इस आकलन या तो इंट्राविटल इमेजिंग या स्थिर ऊतकों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया जा सकता है. दोनों दृष्टिकोण अपने फायदे और नुकसान है. Intravital इमेजिंग संवहनी पारगम्यता के गतिशील प्रक्रिया के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है, लेकिन विशेष उपकरणों और प्रशिक्षण की आवश्यकता है. दूसरी ओर, स्थिर ऊतकों में प्रदर्शन किया इम्यूनोफ्लोरेसेंस केवल एक स्थिर छवि प्रदान करता है, लेकिन नियमित रूप से अधिकांश प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है।

कैंसर रोगियों को आमतौर पर प्रणालीगत चिकित्सा के कुछ फार्म के साथ इलाज कर रहे हैं, और प्रणालीगत उपचार की सफलता आमतौर पर इस तरह के apoptosis, प्रसार, या सकल ट्यूमर आकार के रूप में कैंसर सेल अस्तित्व से संबंधित मानकों के मूल्यांकन द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। हालांकि, यह समझना भी उतना ही महत्वपूर्ण है कि ये प्रणालीगत उपचार कैंसर कोशिका प्रसार को कैसे प्रभावित करते हैं, यह देखते हुए कि अधिकांश कैंसर से संबंधित मृत्यु दर मेटास्टेसिस के कारण होती है, एक प्रक्रिया जिसमें कैंसर कोशिका प्रसार के साथ-साथ कैंसर कोशिका दोनों शामिल होती है प्रसार1| उदाहरण के लिए, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि रसायन चिकित्सा माउस और मानव स्तन कैंसर48,49में TMEM दरवाजे के घनत्व में एक महत्वपूर्ण वृद्धि पैदा कर सकते हैं . इसके अलावा, यह दिखाया गया था कि रसायन चिकित्सा TMEM गतिविधि और कैंसर कोशिकाओं के hematogenous प्रसार में परिणाम लाती है, कैंसर कोशिकाओं के घूम में वृद्धि हुई है, और फेफड़ों मेटास्टेसिस48में वृद्धि हुई. TMEM गतिविधि में रसायन चिकित्सा प्रेरित वृद्धि दवा है कि TIE2 समारोह को रोकता है और इसलिए TMEM गतिविधि को रोकता है के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, rebastinib14कहा जाता है,48. इस प्रकार, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल चूहों के गैर इलाज साथियों के लिए इलाज की तुलना के माध्यम से TMEM गतिविधि पर विभिन्न प्रणालीगत उपचार के प्रभाव के लिए मूल्यवान समापन बिंदु माप की पेशकश कर सकते हैं.

हाल के वर्षों में, कैंसर में antiangiogenic चिकित्सा की अवधारणा पर फिर से गौर किया गया है, सुझाव है कि एक संवहनी "सामान्यीकरण" रणनीति (यानी असामान्य संरचना और रक्त वाहिकाओं के समारोह के क्षणिक पुनर्गठन), लक्ष्यीकरण के लिए बेहतर हो सकता है विनाश के लिए रक्त वाहिकाओं , क्योंकि यह दवा वितरण50,51,52,53,54के लिए नियोवास्कुलेचर को अधिक प्रभावी बनाता है . इस उभरती हुई परिकल्पना को ध्यान में रखते हुए, अन्य समूहों ने संवहनीपारगम्यता का आकलन करने और संवहनी सामान्यीकरण रणनीतियों की दक्षता के परीक्षण के लिए परख भी विकसित की है। यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि, सिद्धांत रूप में, इन तरीकों संवहनी पारगम्यता के TMEM स्वतंत्र तरीके का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इसलिए, सबसे उपयुक्त संवहनी पारगम्यता परख का चयन एक अध्ययन के दायरे पर निर्भर करता है, और शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि वे प्रकाशित संवहनी पारगम्यता परख में से प्रत्येक की प्रयोज्यता को समझना चाहिए, उन्हें लागू करने से पहले उनके अध्ययन.

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, दो तरीकों में से प्रत्येक यहाँ वर्णित दूसरे से अधिक कुछ लाभ है. उदाहरण के लिए, vivo में "विस्फोटपार" मापने मूल्यवान गतिज जानकारी प्रदान करता है, लेकिन के बाद से फट एक दुर्लभ घटना है, कई घंटे के लंबे समय तक इमेजिंग सत्र प्रत्येक के लिए पर्याप्त डेटा प्राप्त करने में सक्षम होने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, intravital इमेजिंग विशेष उपकरण है जो सभी जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है की आवश्यकता है. दूसरी ओर, निश्चित ऊतकों में TMEM गतिविधि का मूल्यांकन अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए आसान है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है. इसके अलावा, निश्चित ऊतकों में TMEM गतिविधि के विश्लेषण की व्याख्या करने के लिए आसान है, लेकिन गतिज जानकारी का अभाव है. इसके अलावा, निश्चित ऊतक विश्लेषण कम विशिष्ट है, क्योंकि यह समय के साथ transcellular और अक्षत endothelia के paracellular संवहनी पारगम्यता, या यहां तक कि सहज संवहनी चोट के कारण अचानक रिसाव घटना से डेक्सट्रान के संचयी रिसाव पर कब्जा कर सकते हैं. इस प्रकार, दो विधियों के synergistic उपयोग TMEM-मध्यस्थ संवहनी पारगम्यता की व्याख्या अधिक विशिष्ट और अधिक संवेदनशील बनाना होगा. जबकि हम स्पष्ट रूप से यहाँ प्रस्तुत तकनीकों के अन्य अनुप्रयोगों का परीक्षण नहीं किया है, वे प्रेरित पोत पारगम्यता की जांच के लिए उपयोगी साबित हो सकता है, उदाहरण के लिए संक्रमण द्वारा या दवा चिकित्सा द्वारा.

सारांश में, TMEM संबद्ध संवहनी पारगम्यता की माप, के रूप में दो स्वतंत्र तरीके यहाँ द्वारा उल्लिखित, समर्थक मेटास्टैटिक ट्यूमर microenvironment और उसके संबद्ध TMEM गतिविधि का आकलन करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं, और कुछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता किसी भी प्रयोगशाला द्वारा सीमा. इन तरीकों को कैंसर सेल प्रसार पर प्रणालीगत उपचार के प्रभाव के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन में विशेष रूप से उपयोगी हैं. इसके अलावा, वे एजेंट है कि रसायन चिकित्सा प्रेरित TMEM गतिविधि ब्लॉक कर सकते हैं के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अंत में, इन तरीकों के लिए सबसे अच्छा संयोजन चरण मैं रोगी परीक्षण पिछले चिकित्सा का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों के हित ों का कोई संघर्ष का खुलासा.

Acknowledgments

हम इमेजिंग समर्थन के लिए अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में विश्लेषणात्मक इमेजिंग सुविधा (एआईएफ) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। यह काम NCI से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (P30CA013330, CA150344, CA 100324 और CA216248), SIG 1S10OD019961-01, ग्रस-लिपर बायोफोटोनिक सेंटर और इसके एकीकृत इमेजिंग कार्यक्रम, और मोंटेफिओर के एल रुथ सर्जनT233 प्रशिक्षण ट्यूमर Microenvironment के अध्ययन के लिए (CA200561).

GSK सह पांडुलिपि लिखा, आंकड़ा 1C और 3B के लिए इमेजिंग प्रदर्शन किया, निश्चित ऊतक विश्लेषण प्रोटोकॉल विकसित की है, और विश्लेषण और सभी डेटा की व्याख्या; जेएमपी ने पांडुलिपि को सह-लिखा, और चित्रा 1 B,2C और 3A के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया; एलबी और एसी ने चित्रा 2 बी के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया; आरजे ने चित्रा 2A के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया; जेएससी ने पांडुलिपि को सह-लिखा और सभी डेटा का विश्लेषण और व्याख्या की; MHO सह पांडुलिपि लिखा है और विश्लेषण और सभी डेटा की व्याख्या; और डे ने चित्रा 2 डी के लिए सर्जरी और इंट्राविटल इमेजिंग का प्रदर्शन किया, पांडुलिपि को सह-लिखा, निश्चित ऊतक विश्लेषण और इंट्राविटल इमेजिंग प्रोटोकॉल विकसित किया, और सभी डेटा का विश्लेषण और व्याख्या की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

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References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
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मेटास्टेसिस डोरवे के ट्यूमर माइक्रोएनेवायरनमेंट का आकलन-मध्यस्थ संवहनी स्थायित्व कैंसर सेल प्रसार के साथ जुड़े इंट्राविटल इमेजिंग और फिक्स्ड ऊतक विश्लेषण का उपयोग कर
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Karagiannis, G. S., Pastoriza, J.… More

Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).

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