Summary
Здесь представлен метод электропорации для плазмидной доставки ДНК и эпендимолиальной маркировки клеток во взрослой теленцефалоне зебры. Этот протокол является быстрым и эффективным методом визуализации и отслеживания отдельных эпендимолиальных клеток и открывает новые возможности для применения электропорации к широкому спектру генетических манипуляций.
Abstract
Электропорация является методом трансфекции, при котором электрическое поле применяется к клеткам для создания временных пор в клеточной мембране и повышения ее проницаемости, тем самым позволяя различным молекулам быть введены в клетку. В этой работе, электропорация используется для введения плазмиды эпиддийных клеток, которые выстраиваются в желудочковой зоне взрослого теленцефалона зебры. Часть этих клеток показывает свойства стволовых клеток и генерирует новые нейроны в мозге зебры; Поэтому, изучение их поведения имеет важное значение для определения их роли в нейрогенезе и регенерации. Внедрение плазмидов с помощью электропорации позволяет долгосрочно маркировать и отслеживать одну эпендимолиальную клетку. Кроме того, плазмиды, такие как рекомбиназа cre или Cas9, могут быть доставлены в одиночные эпендимолиальные клетки, что позволяет рекомбинации генов или редактирования генов и предоставляет уникальную возможность оценить функцию автономного гена клетки в контролируемой, естественной Среды. Наконец, этот подробный, пошаговой протокол электропорации используется для успешного внедрения плазмидов в большое количество одиночных эпиддимолиальных клеток.
Introduction
Зебрафиш являются отличными моделями животных для изучения регенерации мозга после травмы раны. По сравнению с млекопитающими, на эволюционной лестнице, менее развитые виды, такие как зебра, как правило, показывают более высокие показатели составного нейрогенеза и более широкие области взрослого нейронных стволовых клеток жительства, что приводит к постоянному генерации новых нейронов во всем большинство областей мозга во взрослой жизни. Эта особенность, как представляется, коррелируют со значительно более высокой регенеративной способности зебры по сравнению с млекопитающими1, как зебрацы имеют замечательный потенциал для эффективного создания новых нейронов в большинстве моделей травмы мозга изучены2, 3,4,5,6,7,8. Здесь изучается теленцефалон зебры, так как это область мозга с выдающимся нейрогенезом во взрослом возрасте. Эти зоны взрослого нейрогенеза гомологичны к нейрогенным зонам в взрослом мозге млекопитающих9,10,11.
Обильные нейрогенные области в теленефалион зебрафиш присутствуют из-за существования радиальной глии, как клетки или клетки эпиндимолии. Эпендимоглиальные клетки действуют как резиденты взрослых нервных стволовых клеток и несут ответственность за генерацию новых нейронов как в нетронутой и регенерирующей мозга3,5. Эксперименты по отслеживанию линии показали, что желудочковая эпендимолия реагирует на травмы, затем размножается и генерирует новые нейробласты, которые мигрируют на место поражения5. Из-за вечной природы теленефалиона зебры, эпендимолиальные клетки выстраиваются в линию поверхности желудочка и строят стенку желудочков. Стенка желудочковых суставов образуется слоем эпидимальных клеток(рисунок 1A). Важно отметить, что зебрафиш ependymoglia воплощают характеристики как млекопитающих радиальной глии и эпендимальных клеток. Длинные радиальные процессы являются типичной особенностью клеток радиальной глии, в то время как клеточные расширения и плотные соединения (а также их желудочковые положения) являются типичными особенностями эпендимальных клеток12,13,14. Таким образом, эти клетки называются эпедимолийными клетками.
Чтобы следить за поведением in vivo одиночных эпедимолиальных клеток во время регенерации, они должны быть надежно помечены. Различные методы in vivo маркировки клеток для флуоресцентной микроскопии были ранее описаны, такие как эндогенные репортеры или липофильные красители15. Эти методы, в отличие от электропорации, могут потребовать более длительных периодов времени и часто не дают возможности маркировки одной клетки или постоянного долгосрочного отслеживания. Электропорация, однако (кроме одноклеточной маркировки), предлагает возможность введения новой ДНК в клетку-хозяина. Кроме того, по сравнению с другими методами передачи ДНК в клетки, электропорация была продемонстрирована как один из самых эффективных методов16,17,18,19.
Представлен протокол электропорации, который был усовершенствован с целью маркировки отдельных эпеничных клеток во взрослом теленефалии зебры. Этот протокол позволяет маркировки одного эпенимолитальных клеток для того, чтобы следовать за ними в течение длительного периода20 или манипулировать конкретными путями в клеточной автономной манере21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные, используемые в этом протоколе, содержались в стандартных условиях, и эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами ЕС и правительства Верхней Баварии (55,2-1-54-2532-0916).
1. Подготовка плазмидной смеси для электропорации
- Разбавить плазмид интереса в стерильной воде и добавить быстрый зеленый раствор пятен запаса (1 мг/мл). Убедитесь, что конечная концентрация плазмиды составляет 1 мкг/л. Добавить пятно в концентрации не более 3%, так как его единственной целью является цвет раствора и визуализация инъекций желудочков.
- После того, как подготовлены, смешать плазмидный раствор, пипетка вверх и вниз несколько раз или по пальцам постукивания. Хранить при комнатной температуре (RT) до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для коэлектропосации двух плазмидов в одну и ту же клетку убедитесь, что концентрация каждой отдельной плазмиды, используемой в смеси, составляет не менее 0,8 нг/Л с молярным соотношением 1:1 для получения эффективности совместного электропора 80%-90%.
2. Подготовка к инъекционному и электропорации
- Подготовьте стеклянные капилляры (внешний диаметр 1 мм, внутренний диаметр 0,58 мм), необходимые для инъекции в иголку потянув аппарата.
- Для того, чтобы ввести правильное количество плазмиды (см. выше), потяните капилляр при температуре 68,5 градусов с двумя легкими и двумя тяжелыми весами (см. Таблицу Материалов для спецификаций шкива).
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае использования другого шкива, калибруйте капилляр, чтобы обеспечить соответствующий объем электропорации смеси. - Вручную установите инъекционное устройство под давление инъекций 200 hPa (путем поворота ручки Pi) и постоянное давление 0 hPa. Вручную установите время впрыска в ручной режим и контролируйте давление педалей ноги.
- Установите электропорационное устройство в режим "LV" с пятью импульсами при 54-57 V (по 25 мс каждый с интервалом 1 с интервалом). Подключите электроды к устройству.
- Приготовьте один аквариум с чистой рыбной водой, где рыба будет пробуждена от анестезии после процедуры электропорации. Произваем воду, сохраняя воздушный камень, прикрепленный к воздушному насосу в течение всего периода восстановления, пока рыба полностью не пробудится.
- Возьмите обычную кухонную губку и сделайте продольную нарезку в губке, чтобы держать рыбу во время инъекций и процедуры электропорации (см. предыдущую публикацию3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кухонная губка должна регулярно мыть или обмениваться для того, чтобы удалить потенциальные токсичные химические вещества. - Поместите небольшое количество высокопроводящего многоцелевого ультразвукового геля рядом с инъекционной и электропорационной установкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит адекватную электрическую проводимость и, следовательно, распределение электропорированных клеток по всей теленефалии.
3. Анестезия зебрафиш
- Перед анестезией подготовьте запасной раствор анестезии с 0,2% MS222 в дистиллированной воде и отрегулируйте рН до 7 с буфером Tris-HCl. Разбавить этот запас 1:10 (т.е. до 0,02% MS222) с помощью рыбной воды.
- Обезболилизировать рыбу, удерживая их в этом рабочем растворе до тех пор, пока движение тела и жабры не утихнет (обычно в течение нескольких минут).
4. Плазмидное решение инъекций
- Заполните подготовленный стеклянный капилляр 10 злицу плазмидного раствора с помощью микрозагрузчика советы. Избегайте образования пузырьков воздуха внутри капилляра.
- Меню нажмите/Измените капилляр на устройстве впрыска. Вставьте и закрепите иглу в держатель иглы.
- Под стереомикроскопом с увеличением 3,2x или 4x, вырезать только кончик капилляра с помощью тонкой части щипцы. Переключите устройство впрыска из режима Change Capillary в режим inject, а затем нанесите давление педалей ноги, чтобы убедиться, что плазмидное решение легко выходит из иглы и беспрепятственно.
- Перенесите рыбу из цистерны с животноводством в контейнер (пластиковую коробку) с обезболистым раствором. Подождите несколько минут, пока движение жабры спадает.
- Поместите рыбу в предварительно увлажненный губки с нижней стороны вверх. Выполните все следующие шаги инъекции под стереомикроскоп, чтобы обеспечить точность процедуры.
- Используя рассекающий микронож из нержавеющей стали с 40 мм режущей кромкой и толщиной 0,5 мм, создайте небольшое отверстие в черепе рыбы на задней стороне теленефалии(рисунок 1B),рядом с границей с оптическим тектумом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен тщательно, так как отверстие должно быть очень маленьким и поверхностным, проникая исключительно в череп, чтобы избежать повреждения мозга. - Наклоните рыбу по мере необходимости и ориентируйте кончик стеклянного капилляра к черепу под правильным углом, чтобы облегчить проникновение капиллярного наконечника через отверстие.
- Вставьте кончик капилляра через отверстие в черепе тщательно, пока он не достигнет телецефалического желудочка (см. Рисунок 1B). Это потребует проникновения через слоем царных эпиндимальных клеток. Будьте особенно осторожны, чтобы не вставить капилляр слишком глубоко, чтобы избежать контакта с тканью мозга. Держите капилляр точно между полушариями, оставаясь внутри желудочка сразу после пронизы соднего эпендимального слоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень деликатный шаг. Точность этой процедуры улучшается с помощью пигментации мутантных линий, таких как медный24, что позволяет лучше визуализации положения стеклянных капилляров во время инъекции. - С капиллярным наконечником внутри желудочка вводят плазмидный раствор, применяя давление с педалью ноги примерно на 10 с, что соответствует примерно 1 злу плазмидного раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: При изменении иглы шкив, капилляры или инжектор, система должна быть откалибрована для того, чтобы всегда доставить 1 л плазмидного раствора. Калибровка может быть выполнена путем измерения диаметра капли плазмида, выбрасываемого в минеральное масло (например, парафина) и последующего расчета объема капли. После 10 с инъекций, не должно быть 1 qL плазмидной жидкости выбрасывается в минеральное масло. - Подтвердите успех предыдущего шага, наблюдая за распространением жидкости по всему желудочку.
5. Электропорация
- Удалите рыбу из инъекции настройки в то же время держа его в губке.
- Погрузите внутреннюю сторону кончика электродов в ультразвуковой гель.
- Обложка рыбы теленефалии с небольшим количеством ультразвукового геля.
- Расположите голову рыбы между электродами, поместив положительный электрод на брюшной стороне головы рыбы и отрицательный электрод на стороне доза(рисунок 1С),сохраняя при этом тело рыбы в губке. Это определяет направление потока тока, необходимого для электропората эпендимолиии, расположенной в субвентрикулярной зоне.
- Нажимаете электроды мягко и точно против теленцефалона(рисунок 1С). Администрирование тока с педалью ноги. Держите электроды на месте до тех пор, пока все пять импульсов не будут закончены.
6. Восстановление рыбы
- Пусть рыба восстановить в заранее подготовленных, непрерывно атерированный бак, пока он не проснется. Лидокаин гель может быть применен на черепе для того, чтобы облегчить любые возможно развитых боли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный метод электропорации позволяет доставлять плазмидную ДНК в эпендимолиальные клетки, которые расположены поверхностно в теленецефалии зебры и чуть ниже зеронного эпендимального клеточного слоя(рисунок 1A).
Если результат электропорации положительный, помеченные одиночные эпедимолиальные клетки (красные клетки на рисунке 2A,B)можно наблюдать среди других эпеничимоляальных клеток (белый цвет на рисунке 2A,B). В зависимости от эффективности процесса электропорации, более высокое(рисунок 2A)или более низкое(рисунок 2B)число эпиндимолиальных клеток может быть помечено. Тем не менее, этот протокол дает большее количество помеченных клеток, чем ранее опубликованные20, что очевидно на рисунке 3A и видео 1. Стоит отметить, что самая высокая плотность помеченных клеток, как правило, возникают в основном на внутренней, желудочковой стороне обоих полушарий(рисунок 3A), из-за того, как инъекционные плазмидной жидкости распределяется между полушариями. В видео 1, одно полушарие зебры теленефалион представлен в 3D, и эпендимолиальные клетки с радиальными процессами можно увидеть со стороны. Клетки совместно электропоранированы и помечены двумя плазмидов, tdTomato-mem (красный флуоресцентный белок, закрепленный на клеточной мембране) и плазмид H2B-YFP (маркировка ядер). Следует отметить деление двух ядер, окруженных желтыми кругами.
Неудачная электропорация приводит к очень низкому числу или нет помечены эпеничегляальных клеток. Этот результат обычно можно объяснить неточной инъекцией, при которой кончик капилляра не проникает в содвянее эпидимальный клеточный слой. В этом случае плазмидный раствор распространяется над слоем царских эпидимальных клеток вместо заполнения телецефалического желудочка. Это приводит к ependymal клетки исключительно помечены(Рисунок 3B). Дорсальные эпиндимальные клетки (синие стрелки на рисунке 3В)морфологически отличаются от эпиндимоляальных клеток (желтая стрелка на рисунке 3А). Их сома больше и кубоид, и они не обладают радиальными, удлиненные процессы. Это видно по сравнению бокового зрения эпиндимолиального клеточного слоя(рисунок 4A,B). TdTomato-mem помечены клетки, скорее всего, эпенадимные клетки, которые расположены над слоем эпиндимолии(рисунок 4B). В отличие от этого, на рисунке 4A,tdTomato-mem, выражающий плазмид, вводится в отдельные эпиндимольные клетки. Таким образом, они выражают tdTomato-mem в дополнение к их первоначальной маркировке (в данном случае, трансгенные gfap: GFP рыбной линии, видели здесь в белом).
Этот протокол позволяет маркировки и последующего после поведения эпендимолиальных клеток в зебрафиш теленефалион после травмы в течение короткого21 или долгосрочного3 периода времени. Это достигается через жить, in vivo изображений и помогает решить вопрос об их роли в регенерации и нейрогенеза.
Рисунок 1: Схематическое представление корональной части вечной теленефалии зебры. ()Схема корональной секции теленефалиона зебры, подчеркивая положение эпендимолиальных клеток, которые выстилают поверхность желудочка и строят стенку желудочков. Дорсальный эпендимальный слой сходит на нет два полушария и покрывает желудочек (V), расположенный между двумя слоями клеток: эпендимолиальным и эпендимальным. Черная стрелка и изображение глаза указывают на вид показаны на рисунках 2 и рисунке 3. (B) Слева, фотография головы зебры, сделанная сверху, подчеркивая положение теленцефалона с белой пунктирной линией. Стеклянный капилляр изображен красным цветом, а также целевой участок для капиллярной вставки. Справа изображена схема мозга зебры, показывающая положение плазмидной инъекции красным цветом. Следует отметить, что стеклянный капилляр не касается теленефалиона и что плазмида вводится чуть выше теленцефалона в желудочек. Т- теленцефалон, OT и оптический тектум. (C)Изображенная слева фотография головы зебры (вид сбоку), а справа изображение головы (вид стороны), показывающее положение электродов для того, чтобы нацелиться на теленцефалон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Микрографы, показывающие эффективные результаты электропорации. Трехмерное представление a (A) больше или (B) меньшее количество электропопорированных эпиддимолиальных клеток во взрослом теленефалии зебры, если смотреть сверху. Электропорация была сделана в Tg(gfap:GFP) рыбная линия, выражающая GFP флуоресцентный белок (изображенный белым цветом) во всех эпендимоглиальных клетках. Индивидуальные электропонные клетки помечены pCS2-tdTomato-mem плазмид3. Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Конфокальные микрографы, изображающие разницу между успешной и неудачной электропорацией. (A) Трехмерное конфоковое изображение BABB-очищенной зебры теленефалион (REF) с большим количеством pCS-tdTomato-mem электропонных эпинимоглиальных клеток. Следует отметить морфологию эпедимолиальных клеток с длинными, удлиненные процессы (желтые стрелки). Оба теленецефалических полушария, выделенные желтыми линиями, можно наблюдать. (B) Конфокальный образ неудачной электропорации pCS2-tdTomato-mem плазмид. В основном дорсальные эпендимальные клетки помечены, и несколько эпендимолиальных клеток выражают tdTomato-mem плазмид. Следует отметить явную разницу в морфологии эпендимальных клеток (синих стрелок). Шкала баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: 3D боковые виды электропорированных и неэлектропонных эпиндимолиальных клеток. (A) Трехмерное боковое представление электропорированных эпендимоглиальных клеток, положительные как для Tg(gfap:GFP) и pCS2-tdTomato-mem (желтая стрелка). (B) 3D боковое представление неудачной электропорации. Следует отметить расположение pCS2-tdTomato-mem положительных клеток выше Tg(gfap:GFP)ependymoglia слоя. Скорее всего, клетки дорсального эпенадимного слоя были электропорами (синяя стрелка). Шкала баров 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: 3D фильм о теленефалии зебры и электропорированных эпендимоглиальных клетках. Видео показывает одно полушарие теленцефалона зебры в 3D. Эпендимоглиальные клетки со-электропоратизируются с двумя плазмидами: tdTomato-mem (красный флуоресцентный белок, закрепленный на клеточной мембране) и плазмид H2B-YFP (маркировка ядер). Индивидуально помечены ependymoglia с радиальными процессами, которые можно наблюдать из стороны. В желтых кругах выделяются эпендимолиальные клетки с митотической фигурой, визуализированной H2B-YFP с надписью H2B-YFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол электропорации является надежным методом in vivo для маркировки отдельных эпиндимольных клеток. Протокол может потребоваться дальнейшая адаптация для обозначения других типов клеток, таких как нейроны или олигодендроциты. Для достижения успешной маркировки можно использовать плазмиды, содержащие различные промоутеры. Куриный бета-актин промоутер, eF1alpha, CMV и убиквитин промоутер ранее были использованы для привода выражение различных трансгенов в ependymoglia и их потомство23. Тем не менее, различные кинетики трансгенного выражения наблюдались, которые должны быть приняты во внимание. Например, ПРОмотор CMV приводом трансгенвыражение очень быстро (выражение можно увидеть после 24 ч), в то время как eF1alpha занимает больше времени. Помимо маркировки, протокол электропорации может быть использован в качестве быстрой и простой платформы редактирования генов с использованием рекомбиназы Cre или CRISPR Cas9 методы22. Кроме того, использование флип-кассеты25-содержащихплазмиды и их электропорации в клеточных типах специфических Линий Cre может служить четким продолжением метода, позволяющего маркировать или редактирование генов в эпинадимоглиальном потомстве, генерируемом после электропорации.
Этот протокол имеет несколько критических шагов. Во-первых, во время инъекционного шага, экспериментальный должен быть осторожным, что впрыскиваемое количество плазмида равно для каждой отдельной рыбы, так что количество помеченных клеток остается сравнительно похожим. Это может быть достигнуто путем контроля размера стекла капиллярного отверстия, а это означает, что разрез каждого кончика должен быть постоянным среди различных капилляров или калибровки должны быть выполнены для каждого отдельного капилляра. Кроме того, продолжительность инъекции, регулируемая педалью ноги, должна быть одинаковой для каждой отдельной инъекции. Во-вторых, правильное положение отверстия в черепе, сделанного с помощью микро-ножа, имеет решающее значение для правильного дисперсии плазмидной жидкости по всей теленефалии. Не менее важно проникать в слое царя-эпендимальной клетки с капиллярным наконечником, как указано в протоколе. Кроме того, важно также, чтобы отверстие, созданное не слишком большой, чтобы предотвратить плазменную смесь и спинномозговой жидкости от утечки из теленефалии. Другим важным шагом является прочность прикладного электрического тока. Важно убедиться, что электропорация устройство работает как можно точнее, так что сила прикладного тока не сильно отклоняется от напряжения, появляющегося на экране, что не всегда точно. Если эти значения не соответствуют, необходимо скорректировать силу тока на электропорации устройства, так как введенный ток выше, чем рекомендуемый 54-57 V может поставить под угрозу выживание рыбы.
По сравнению с другими методами доставки плазмида и маркировки клеток, широко используемых в полевых условиях, электропорация имеет очевидные преимущества. Несмотря на критические шаги, упомянутые выше, это происходит очень редко, что никаких электропонных клеток не может наблюдаться или что дорсальные эпендимальные клетки ошибочно электропоратные. Как правило, показатель успеха этого протокола электропорации составляет 90%-95%, и мы почти не наблюдаем тюнеле-клеток после электропорации. В отличие от липофекции, например, во время электропорации, катионные липосомы (например, липофектамин) не используются и, таким образом, токсичность, связанная с его использованием, полностью избегается26. Ранее сообщалось, что липотекция и электропорация имеют равные показатели эффективности (20-50 клеток на теленефалион)27. Однако, этот оптимизированный протокол обычно дает 100-200 клеток на теленцефалон. По сравнению с вирусными вектором, биобезопасность не является проблемой с электропорированием.
Кроме того, широко используемые AAVs или лентивирусы не в состоянии производить обнаруживаемое выражение трансгенов в мозге зебры17,28. Наконец, хотя система Cre-lox в настоящее время широко используется в зебрафиш, плазмид электропорации быстрее, поскольку она не требует длительного времени ожидания, необходимого для размножения и выращивания рыбы и позволяет отдельных клеток маркировки и отслеживания. Тем не менее, такая методика требует высококвалифицированных ученых для достижения успешной электропорации и высоких показателей выживаемости экспериментальных животных (мы, как правило, опыт выживаемости 70%-80%). Этот показатель также имеет тенденцию колебаться в зависимости от экспериментатора. Изучение процедуры требует практики и, как правило, занимает три испытания. Однако, это зависит от ловкости рук человека и может занять больше времени в некоторых случаях.
Представленный протокол электропорации является быстрым, высокоэффективным методом для электропоратации большого количества эпиндимолиальных клеток с необходимыми мерами предосторожности для получения оптимальных результатов. Электропорация теленцефалона взрослых зебры имеет решающее значение для визуализации отдельных эпендипереломальных клеток и изучения их роли в процессах нейрогенеза и регенерации. В последнее время успех был достигнут в одновременном нарушении нескольких генов взрослых зебрафиш теленефалион через редактирование генов через электропорации и StagR-Cas9 методы22. Это открывает много возможностей и будущих применений электропорации для широкого спектра генетических манипуляций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Особая благодарность Джеймсу Копти за редактирование рукописи. Мы также с благодарностью признаем финансирование JN от Немецкого научно-исследовательского фонда (DFG) по SFB 870 и SPP "Интегративный анализ Olfaction" и SPP 1738 "Новые роли не кодирования РНК в развитии нервной системы, пластичность и болезни", SPP1757 " Глиальная неоднородность" и Стратегия превосходства в рамках Мюнхенского кластера системной неврологии (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
