Summary
Præsenteret her er en elektroporation metode til plasmid DNA levering og ependymoglial celle mærkning i den voksne Zebra telencephalon. Denne protokol er en hurtig og effektiv metode til at visualisere og spore individuelle ependymogliale celler og åbner nye muligheder for at anvende elektro poration til en bred vifte af genetiske manipulationer.
Abstract
Elektro poration er en transfektering metode, hvor et elektrisk felt påføres celler til at skabe midlertidige porer i en celle membran og øge dens permeabilitet, hvorved forskellige molekyler, der skal indføres til cellen. I dette papir bruges elektroporation til at introducere plasmider til ependymogliale celler, som linje den ventrikulære zone af den voksne Zebra telencephalon. En brøkdel af disse celler viser stamcelle egenskaber og genererer nye neuroner i Zebra hjernen; Derfor, studere deres adfærd er afgørende for at bestemme deres roller i neurogenese og regenerering. Indførelsen af plasmider via elektroporation muliggør langsigtet mærkning og sporing af en enkelt ependymoglial celle. Desuden kan plasmider som CRE rekombinase eller Cas9 leveres til enkelt ependymogliale celler, som muliggør genkombinering eller genredigering og giver en enestående mulighed for at vurdere cellens autonome genfunktion i et kontrolleret, naturligt Miljø. Endelig er denne detaljerede, trin-for-trin elektro poration protokol anvendes til at opnå en vellykket introduktion af plasmider i et stort antal enkelt ependymoglial celler.
Introduction
Zebrafish er fremragende dyremodeller til at undersøge hjernens regenerering efter en stab sår skade. Sammenlignet med pattedyr, på den evolutionære stigen, mindre udviklede arter som Zebra generelt viser højere satser for konstitutiv neurogenese og bredere områder af voksne neurale stamceller bopæl, hvilket fører til konstant generering af nye neuroner i hele de fleste hjerneområder i voksenlivet. Denne funktion synes at korrelere med betydeligt højere regenerativ kapacitet af Zebra i forhold til pattedyr1, som zebra har bemærkelsesværdigt potentiale til effektivt at generere nye neuroner i de fleste hjerneskade modeller studerede2, 3,4,5,6,7,8. Her er Zebra telencephalon undersøgt, da det er et hjerne område med fremtrædende neurogenese i voksenalderen. Disse zoner af voksne neurogenese er homologe til neurogene zoner i den voksne pattedyr hjernen9,10,11.
Rigelige neurogene områder i Zebra telencephalon er til stede på grund af eksistensen af radial glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungerer som residente voksne neurale stamceller og er ansvarlige for generering af nye neuroner i både intakt og regenererende hjerne3,5. Lineage Tracing eksperimenter har vist, at ventrikulære ependymoglia reagerer på skade, derefter formere sig og generere nye Neuro Blaster, der migrerer til læsionsstedet5. På grund af den krænget natur af Zebra telencephalon, line ependymoglial celler den ventrikel overflade og bygge den ventrale ventrikel væg. Den dorsale ventrikel væg dannes af et dorsale ependymalt cellelag (figur 1a). Vigtigere, zebra ependymoglia legemliggøre egenskaberne af både pattedyrs radiale glia og ependymale celler. Lange radiale processer er et typisk træk ved radial glia-celler, hvorimod cellulære forlængelser og stramme kryds (samt deres ventrikulære positioner) er typiske egenskaber ved ependymale celler12,13,14. Derfor kaldes disse celler for ependymoglial celler.
For at følge in vivo opførsel af enkelt ependymoglial celler under regenerering, skal de være pålideligt mærket. Forskellige metoder til in vivo celle mærkning for fluorescerende mikroskopi er tidligere beskrevet, såsom endogene journalister eller lipofile farvestoffer15. Disse metoder, i modsætning til elektro poration, kan kræve længere perioder og ofte ikke giver mulighed for enkelt celle mærkning eller permanent langsigtet sporing. Elektro poration, men (udover enkelt celle mærkning), giver mulighed for at indføre nye DNA i værtscellen. Desuden, sammenlignet med andre metoder til DNA-overførsel i cellerne, elektro poration har vist sig at være en af de mest effektive metoder16,17,18,19.
Præsenteret her er en elektroporation protokol, der er blevet raffineret med henblik på mærkning enkelt ependymoglial celler i den voksne Zebra telencephalon. Denne protokol giver mulighed for mærkning af enkelt ependymogliale celler for at følge dem over en langsigtet periode20 eller for at manipulere bestemte veje i en celle-autonom måde21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr, der anvendes i denne protokol, er holdt under normale opdrætsforhold, og forsøgene er udført i henhold til retningslinjerne og reglerne for EU og regeringen i øvre Bayern (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. fremstilling af plasmid blanding til elektroporation
- Fortynde plasmid af interesse i sterilt vand og tilsæt hurtig grøn plet stamopløsning [1 mg/mL]. Sørg for, at den endelige koncentration af plasmid er ∼ 1 μg/μL. Tilsæt pletten i en koncentration på højst 3%, da dens eneste formål er at farveopløsningen og visualisere ventrikel injektion.
- Når det er tilberedt, blandes plasmid-opløsningen ved pipettering op og ned flere gange eller ved finger aflytning. Opbevares ved stuetemperatur (RT) indtil brug.
Bemærk: For Co-elektroporation af to plasmider i samme celle, sikre, at koncentrationen af hvert enkelt plasmid anvendes i blandingen er mindst 0,8 ng/μL med en molær ratio på 1:1 for at opnå 80%-90% Co-elektroporation effektivitet.
2. præparater til injektion og elektro Poration procedure
- Forbered glas kapillærer (udvendig diameter 1 mm, indvendig diameter 0,58 mm) nødvendig for injektion i nålen trække apparatet.
- For at injicere den korrekte mængde plasmid (se ovenfor), trækkes kapillær ved en temperatur på 68,5 °c med to lette og to tunge vægte (Se tabel over materialer til aftrækker specifikationer).
Bemærk: Hvis der anvendes en anden aftrækker, skal kapillar kalibreres for at levere den passende mængde elektroporations blanding. - Indstil injektions anordningen manuelt til et indsprøjtningstryk på 200 hPa (ved at dreje pi-knappen) og konstant tryk på 0 hPa. Indstil Indsprøjtnings tiden manuelt til manuel tilstand, og kontroller trykket med fodpedal.
- Indstil elektro portering enhed til "LV mode" med fem impulser på 54 – 57 V (25 MS hver med 1 s intervaller). Tilslut elektroderne til enheden.
- Forbered en fisk tank med ren fisk vand, hvor fiskene vil blive vækket fra anæstesi efter elektro poration procedure. Vandet ved at holde den luft sten fastgjort til luftpumpen i hele restitutionsperioden, indtil fisken er fuldt vækket.
- Tag en almindelig køkken svamp og lav en langsgående udskæring i svampen for at holde fiskene i under Indsprøjtnings-og elektro porerings proceduren (Se foregående publikation3).
Bemærk: Køkken svamp bør regelmæssigt vaskes eller udskiftes for at fjerne potentielle giftige kemikalier. - Placer en lille mængde af stærkt ledende multi-purpose ultralyd gel ved siden af injektion og elektro poration setup.
Bemærk: Dette vil sikre tilstrækkelig elektrisk ledningsevne, og dermed fordelingen af elektroporerede celler i hele telencephalon.
3. zebrafish anæstesi
- Før bedøvelse, forberede en stamopløsning af anæstesi med 0,2% MS222 i destilleret vand og justere pH til 7 med Tris-HCl buffer. Fortyndes denne bestand 1:10 (dvs. til 0,02% MS222) ved hjælp af fiskevand.
- Bedøv fiskene ved at holde dem i denne arbejds løsning, indtil bevægelsen af kroppen og gyller aftager (typisk for et par minutter).
4. plasmid opløsning injektion
- Fyld den forberedte glas kapillar med 10 μL plasmid opløsning ved hjælp af mikrolæsser spidser. Undgå dannelse af luftbobler inde i kapillær.
- Tryk på menu/Skift kapillar på injektions anordningen. Sæt nålen ind i kanyle holderen, og fastgør den.
- Under et stereomicroskop med en forstørrelse på 3,2 x eller 4X, skær kun spidsen af kapillar ved hjælp af fine-end tang. Skift injektions anordningen fra Skift kapillar tilstand til Indsprøjtnings tilstand, og Påfør derefter tryk med en fodpedal for at sikre, at plasmid-opløsningen kører let ud af nålen og uhindret.
- Overfør fiskene fra opdræts beholderen til beholderen (plastikkasse) med bedøvelsesmiddel opløsning. Vent et par minutter, indtil bevægelsen af gællerne aftager.
- Placer fiskene i den præ-befugtede svamp med Rygsiden opad. Udfør alle følgende Indsprøjtnings trin under stereomicroskop for at sikre, at proceduren er korrekt.
- Ved hjælp af en dissekere mikro-kniv fra rustfrit stål med 40 mm skærkant og 0,5 mm tykkelse, skabe et lille hul i fisken kraniet på den bageste side af telencephalon (figur 1b), lige ved siden af grænsen med optisk tectum.
Bemærk: Dette trin bør udføres omhyggeligt, da hullet skal være meget lille og overfladisk, penetrateret udelukkende kraniet, for at undgå hjerneskade. - Hæld fisken om nødvendigt og drej spidsen af glasset kapillær mod kraniet i den rigtige vinkel for at lette indtrængning af kapillar spidsen gennem hullet.
- Indsæt spidsen af kapillar gennem hullet i kraniet omhyggeligt, indtil det når telencephalic ventrikel (Se figur 1b). Dette vil kræve penetration gennem dorsale ependymal cellelag. Vær især omhyggelig med ikke at indsætte kapillær for dybt for at undgå kontakt med hjernevæv. Hold kapillar præcist i mellem halvkugler, resterende inde i ventriklen lige efter piercing dorsale ependymal lag.
Bemærk: Det er et meget følsomt skridt. Nøjagtigheden af denne procedure er forbedret ved hjælp af pigmentering mutant linjer såsom brassy24, giver bedre visualisering af glas kapillær position under injektion. - Med kapillar spidsen inde i ventriklen indsprøjtes plasmid-opløsningen ved at anvende tryk med fodpedalen i ca. 10 s, hvilket svarer til ca. 1 μL plasmid opløsning.
Bemærk: Hvis du ændrer nåle Puller, kapillærer eller injektor, bør systemet kalibreres for altid at levere 1 μL plasmid opløsning. Kalibrering kan udføres ved at måle diameteren af plasmid dråbe bortvist i en mineralolie (f. eks, paraffinolie) og efterfølgende beregning af mængden af dråbe. Efter 10 s injektion, der skal være ~ 1 μL plasmid væske udvises i mineralolie. - Bekræft succesen af det foregående trin ved at observere spredningen af væske i hele ventriklen.
5. Elektro portering
- Fjern fisken fra Indsprøjtnings-set-up, mens du stadig holder den i svampen.
- Sænk den indvendige side af spidsen af elektroderne i ultralydgel.
- Dække fisk telencephalon med en lille mængde af ultralyd gel.
- Placer fiskehovedet mellem elektroderne, Anbring den positive elektrode på den ventrale side af fiskens hoved og den negative elektrode på Rygsiden (figur 1c), mens du stadig holder fiskens krop i svampen. Dette indstiller retningen af strømmen af den aktuelle nødvendige for at elektro porere ependymoglia placeret i subventrikulær zone.
- Tryk elektroderne forsigtigt og præcist mod telencephalon (figur 1c). Administrer strømmen med fodpedalen. Hold elektroderne på plads, indtil alle fem impulser er færdige.
6. genopretning af fisk
- Lad fiskene restituere sig i den tidligere forberedte, kontinuerligt kulsyreholdige tank, indtil den vågner op. Lidocaine gel kan påføres på kraniet for at lindre eventuelle udviklede smerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne elektroporationsmetode giver mulighed for levering af plasmid-DNA til ependymoglialceller, som er placeret overfladisk i Zebra telencephalon og lige under det rygmarske cellelag (figur 1a).
Hvis resultatet af elektro portering er positivt, kan etiketten enkelt ependymoglial celler (røde celler i figur 2a, b) observeres blandt andre ependymogliale celler (hvid i figur 2a, b). Afhængigt af effektiviteten af elektro portering proces, en højere (figur 2a) eller lavere (figur 2b) antallet af ependymoglial celler kan mærkes. Ikke desto mindre giver denne protokol et højere antal mærkede celler end tidligere offentliggjort20, hvilket fremgår af figur 3a og video 1. Det er værd at nævne, at den højeste tæthed af mærkede celler tendens til at dukke mest på den indre, ventrikel side af begge halvkugler (figur 3a), på grund af den måde, hvorpå den injicerede plasmid væske fordeler mellem halvkugler. I video 1, en halvkugle af Zebra telencephalon er præsenteret i 3D, og ependymoglial celler med radiale processer kan ses fra siden. Cellerne er co-elektroporeret og mærket med to plasmider, tdTomato-MEM (rødt fluorescerende protein forankret til cellemembranen) og H2B-YFP plasmid (mærkning kerner). Celledeling af to kerner omgivet af gule cirkler skal bemærkes.
Mislykket elektro portering resulterer i meget lavt antal eller ingen mærkede ependymogliale celler. Dette resultat kan generelt forklares ved upræcis injektion, hvor spidsen af kapillar ikke trænger ind i det dorsale ependymale cellelag. I dette tilfælde, plasmid opløsning spredes over dorsale ependymale celle lag i stedet for påfyldning telencephalic ventrikel. Dette fører til, at ependymale celler kun mærkes (figur 3b). Dorsale ependymale celler (blå pile i figur 3b) afviger morfologisk fra ependymoglial celler (gul pil i figur 3a). Deres Soma er større og cuboid, og de besidder ikke radiale, aflange processer. Dette er tydeligt ved at sammenligne en sidevisning af ependymoglialcellelag (figur 4a, B). TdTomato-MEM-mærkede celler er sandsynligvis ependymale celler, som er placeret over laget af ependymoglia (figur 4b). I figur 4aintroduceres et tdTomato-MEM-udtryk plasmid til individuelle ependymogliale celler. Således, de udtrykker tdTomato-MEM ud over deres oprindelige mærkning (i dette tilfælde, transgene GFAP: GFP fisk linje, ses her i hvidt).
Denne protokol gør det muligt at mærke og efterfølgende følge ependymoglialcellernes opførsel i Zebra telencephalon efter skade over en kort-21 eller langvarig3 -periode. Dette opnås gennem live, in vivo Imaging og hjælper med at løse spørgsmålet om deres roller i regenerering og neurogenese.
Figur 1: skematisk gengivelse af koronal del af den krænget Zebra telencephalon. (A) ordning af en koronal del af Zebra telencephalon, der fremhæver positionen af ependymogliale celler, som er foring ventrikel overflade og opbygning af ventrale ventrikel væggen. Dorsale ependymal lag er bridging de to halvkugler og dækker ventrikel (V), placeret i mellem to cellelag: ependymoglial og ependymal. Sort pil og gengivelsen af øjet indikerer visning er vist i figur 2 og figur 3. (B) til venstre, et fotografi af Zebra hovedet taget ovenfra, hvilket fremhæver positionen af telencepon med en hvid stiplet linje. Et glas kapillær er afbildet i rødt, sammen med målet site for kapillær indsættelse. Afbilledet til højre er en skematisk af Zebra hjernen viser positionen af plasmid injektion i rødt. Det skal bemærkes, at glasset kapillær ikke rører telencepon, og at plasmid injiceres lige over telencephalon i ventrikel. T = telencephalon, OT = optisk tectum. (C) afbildet til venstre er et fotografi af Zebra hovedet (sidevisning), og til højre er en skildring af hovedet (sidevisning), der viser elektrodernes position for at målrette telencephalon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikrografer, der viser effektive elektro porations resultater. Tredimensionel Gengivelse af a (a) større eller (B) mindre antal elektroporerede ependymogliale celler i den voksne Zebra telencephalon, som set ovenfra. Elektro porationen blev udført i TG (GFAP: gfp) fiskelinje, der udtrykker gfp fluorescerende protein (afbildet i hvidt) i alle ependymogliale celler. Individuelle elektroporerede celler mærkes med pCS2-tdTomato-MEM plasmid3. Skala stænger = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konfokale mikrografer, som skildrer forskellen mellem vellykket og mislykket elektro portering. (A) tredimensionelt Konfokal billede af Babb-clearet Zebra telencephalon (ref) med et stort antal pc'er-tdtomato-MEM elektroporerede ependymogliale celler. Den morfologi af ependymoglial celler med lange, langstrakte processer (gule pile) skal bemærkes. Begge telencephalic halvkugler, fremhævet med gule stiplede linjer, kan observeres. B) Konfokal billede af mislykket elektro portering af PCS2-tdTomato-MEM plasmid. For det meste er dorsale ependymale celler mærket, og få ependymoglial celler udtrykker tdTomato-MEM plasmid. Den klare forskel i morfologien af ependymale celler (blå pile) skal bemærkes. Skala stænger = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:3D lateral visning af elektro porterede og ikke-elektro porterede ependymogliale celler. (A) tredimensionale lateral repræsentation elektroporerede ependymogliale celler, positive for både TG (GFAP: gfp) og PCS2-tdtomato-MEM (gul pil). (B) 3D lateral repræsentation af mislykket elektro portering. Placeringen af pCS2-tdTomato-MEM positive celler over TG (GFAP: GFP) ependymoglia lag skal bemærkes. Mest sandsynlige dorsale ependymale lag celler blev elektroporated (blå pil). Skala stænger = 30 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1:3D-film af Zebra telencephalon og elektro porterede ependymogliale celler. Video viser en halvkugle af Zebra telencephalon i 3D. Ependymoglialceller er co-elektroporeret med to plasmider: tdTomato-MEM (rødt fluorescerende protein forankret til cellemembranen) og H2B-YFP plasmid (mærknings kerner). Individuelt mærket ependymoglia med radiale processer, der kan observeres fra side. Gule cirkler fremhæve ependymoglial celle med mitotisk figur visualiseret af H2B-YFP mærket kromatin. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne elektroporations protokol er en pålidelig in vivo-metode til mærkning af individuelle ependymogliale celler. Protokollen kan have brug for en yderligere tilpasning for at mærke andre celletyper såsom neuroner eller oligodendrocytter. For at opnå en vellykket mærkning kan der anvendes plasmider med forskellige initiativtagere. Chicken-beta actin Promoter, eF1alpha, CMV og ubiquitin Promoter er tidligere blevet brugt til at drive ekspression af forskellige transgener i ependymoglia og deres afkom23. Der blev dog observeret forskellige kinetik af transgenekspression, som bør tages i betragtning. For eksempel er CMV Promoter driven transgene Expression meget hurtig (udtryk kan ses efter 24 h), mens eF1alpha tager længere tid. Bortset fra mærkning, kan den elektroporation protokol bruges som en hurtig og ligetil platform af genredigering med brug af CRE rekombinase eller crispr Cas9 teknikker22. Desuden kan brugen af flip-kassette25-holdige plasmider og deres elektroporering i celletype-specifikke CRE linjer fungere som en klar udvidelse af en metode, der tillader mærkning eller genredigering i ependymoglial afkom genereret efter elektroporation.
Denne protokol har flere kritiske trin. For det første skal eksperimenteren under Indsprøjtnings trinnet være forsigtige med, at det injicerede plasmid-beløb er ens for hver enkelt fisk, således at antallet af mærkede celler forbliver sammenligneligt tilsvarende. Dette kan opnås ved at kontrollere størrelsen af glasset kapillær åbning, hvilket betyder, at snittet af hver spids skal være konstant blandt forskellige kapillærer eller kalibrering bør udføres for hver enkelt kapillar. Desuden bør varigheden af injektionen, reguleret af en fodpedal, være den samme for hver enkelt injektion. For det andet, den korrekte placering af et hul i kraniet lavet med mikro-kniv er afgørende for korrekt dispersion af plasmid væske i hele telencephalon. Det er lige så vigtigt at trænge ind i det dorsale ependymale celle lag med kapillar spidsen, som anført i protokollen. Desuden er det også vigtigt, at hullet skabt ikke er for stor til at forhindre plasmid blanding og cerebrospinalvæsken fra lækage ud af telencephalon. Et andet kritisk skridt er styrken af den anvendte elektriske strøm. Det er vigtigt at sikre, at elektroporations anordningen fungerer så præcist som muligt, således at styrken af den anvendte strøm ikke afviger meget fra den spænding, der vises på skærmen, hvilket ikke altid er korrekt. Hvis disse værdier ikke er konsistente, er det nødvendigt at justere styrken af strømmen på elektroporations anordningen, da en administreret strøm, der er højere end den anbefalede 54-57 V, kan kompromittere fiskens overlevelse.
Sammenlignet med de andre metoder til en plasmid levering og celle mærkning almindeligt anvendt i marken, elektro poration har indlysende fordele. På trods af de kritiske trin, der er nævnt ovenfor, sker det meget sjældent, at ingen elektroporerede celler kan observeres, eller at de dorsale ependymale celler fejlagtigt er elektroporerede. Generelt er succesraten for denne elektroporations protokol 90%-95%, og vi observerer næsten ingen TUNEL + celler efter elektroporation. I modsætning til lipofection for eksempel, under elektroporation, kationiske Liposomer (f. eks, lipofectamin) ikke anvendes, og dermed toksicitet forbundet med dens anvendelse er helt undgås26. Tidligere blev det rapporteret, at lipofection og elektroporation har samme effektivitetsgrad (20-50 celler pr. telencephalon)27. Men, denne optimerede protokol generelt giver 100-200 celler per telencephalon. I forhold til virale vektorer, biosikkerhed er ikke et problem med elektro poration.
Desuden undlader almindeligt anvendte aavs eller lentivira at producere detekterbare udtryk af transgener i Zebra hjernen17,28. Endelig, selv om CRE-LOX systemet er i dag almindeligt anvendt i zebrafish, plasmid elektro poration er hurtigere, da det ikke kræver lange ventetider er nødvendige for fiskeopdræt og dyrkning og tillader individuel celle mærkning og sporing. Men, en sådan teknik kræver højt kvalificerede videnskabsfolk til at opnå en vellykket elektroporation og høje overlevelsesrater af forsøgsdyr (vi typisk oplever overlevelsesrater på ~ 70%-80%). Denne sats har også tendens til at svinge afhængigt af eksperimententer. At lære proceduren kræver øvelse og typisk tager tre forsøg. Men, dette er afhængig af den manuelle fingerfærdighed af den enkelte og kan tage længere tid i nogle tilfælde.
Den præsenterede elektroporations protokol er en hurtig, meget effektiv metode til elektroporering af et stort antal ependymogliale celler med de nødvendige forholdsregler for at opnå optimale resultater. Elektroporation af den voksne Zebra telencephalon er afgørende for visualisering af individuelle ependymogliale celler og undersøgelse af deres roller i Neuro Genesis og regenererings processer. For nylig er succes blevet opnået i den samtidige afbrydelse af flere gener af den voksne Zebra telencephalon gennem genredigering via elektroporation og stagr-Cas9 teknikker22. Dette åbner mange muligheder og fremtidige anvendelser af elektro portering for en bred vifte af genetiske manipulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Særlig tak til James Copti for redigering af manuskriptet. Vi anerkender også taknemmeligt finansiering til JN fra den tyske Research Foundation (DFG) af SFB 870 og SPP "Integrative analyse af Olfaction" og SPP 1738 "nye roller af ikke-kodning RNAs i nervesystemet udvikling, plasticitet & sygdom", SPP1757 " Glial heterogenitet "og ekspertise strategi inden for rammerne af München-klyngen for system Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
