Summary
Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.
Abstract
Elektroporation ist ein Transfektionsverfahren, bei dem ein elektrisches Feld auf Zellen angewendet wird, um temporäre Poren in einer Zellmembran zu erzeugen und ihre Durchlässigkeit zu erhöhen, wodurch verschiedene Moleküle in die Zelle eingeführt werden können. In diesem Papier wird Elektroporation verwendet, um Plasmide in ependymogliale Zellen einzuführen, die die ventrikuläre Zone des erwachsenen Zebrafischtelencephalons aussäumen. Ein Bruchteil dieser Zellen zeigt Stammzelleigenschaften und erzeugt neue Neuronen im Zebrafischgehirn; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten zu untersuchen, um ihre Rolle bei der Neurogenese und Regeneration zu bestimmen. Die Einführung von Plasmiden über Elektroporation ermöglicht die langfristige Kennzeichnung und Verfolgung einer einzelnen ependymogliaalen Zelle. Darüber hinaus können Plasmide wie Cre recombinase oder Cas9 an einzelne ependymogliade Zellen abgegeben werden, was eine Genrekombination oder Genbearbeitung ermöglicht und eine einzigartige Gelegenheit bietet, die autonome Genfunktion der Zelle in einer kontrollierten, natürlichen umgebung. Schließlich wird dieses detaillierte, schrittweise Elektroporationsprotokoll verwendet, um eine erfolgreiche Einführung von Plasmiden in eine große Anzahl von einzelnen ependymogliaalen Zellen zu erhalten.
Introduction
Zebrafische sind ausgezeichnete Tiermodelle, um die Hirnregeneration nach einer Stichwunde zu untersuchen. Im Vergleich zu Säugetieren weisen auf der evolutionären Leiter weniger entwickelte Arten wie Zebrafische im Allgemeinen höhere Raten konstitutiver Neurogenese und breitere Bereiche des aufenthaltes von adulten neuronalen Stammzellen auf, was zu einer konstanten Erzeugung neuer Neuronen im gesamten die meisten Hirnbereiche im Erwachsenenleben. Diese Funktion scheint mit deutlich höheren Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen im Vergleich zu Säugetieren1korrelieren, da Zebrafische ein bemerkenswertes Potenzial haben, in den meisten untersuchten Hirnverletzungsmodellen effizient neue Neuronen zu erzeugen2, 3,4,5,6,7,8. Hier wird der Zebrafisch Telencephalon untersucht, da es sich um ein Hirngebiet mit prominenter Neurogenese im Erwachsenenalter handelt. Diese Zonen der adulten Neurogenese sind homologe zu neurogenen Zonen im erwachsenen Säugetiergehirn9,10,11.
Reichlich neurogene Bereiche im Zebrafisch Telencephalon sind aufgrund der Existenz von radialen Glia wie Zellen oder Ependymoglia-Zellen vorhanden. Ependymogliade Zellen fungieren als ansässige adulte neuronale Stammzellen und sind verantwortlich für die Erzeugung neuer Neuronen sowohl im intakten als auch im regenerierenden Gehirn3,5. Lineage-Tracing-Experimente haben gezeigt, dass ventrikuläre Ependymoglia auf Verletzungen reagieren, sich dannvermehren und neue Neuroblasten erzeugen, die zur Läsionsstelle 5 wandern. Aufgrund der immerleten Natur von Zebrafischtelencephalon säumen ependymogliale Zellen die ventrikuläre Oberfläche und bauen die ventrale ventrikuläre Wand. Die dorsale ventrikuläre Wand wird durch eine dorsale ependymale Zellschicht gebildet (Abbildung 1A). Wichtig ist, dass Zebrafische ependymoglia die Eigenschaften sowohl der Radialglia als auch der ependymalen Zellen verkörpern. Lange radiale Prozesse sind ein typisches Merkmal von radialen Gliazellen, während Zellverlängerungen und enge Knoten (sowie ihre ventrikulären Positionen) typische Merkmale der ependymalen Zellen12,13,14sind. Daher werden diese Zellen als ependymogliade Zellen bezeichnet.
Um dem In-vivo-Verhalten einzelner ependymotgliaaler Zellen während der Regeneration zu folgen, müssen sie zuverlässig beschriftet werden. Verschiedene Methoden der In-vivo-Zellbeschriftung für die fluoreszierende Mikroskopie wurden bereits beschrieben, wie z. B. endogene Reporter oder lipophile Farbstoffe15. Diese Methoden können im Gegensatz zur Elektroporation längere Zeiträume erfordern und bieten oft nicht die Möglichkeit der Einzelzellkennzeichnung oder permanenten Langzeitverfolgung. Die Elektroporation bietet jedoch (neben der Einzelzellbeschriftung) die Möglichkeit, neue DNA in die Wirtszelle einzuführen. Darüber hinaus hat sich im Vergleich zu anderen Methoden der DNA-Übertragung in die Zellen gezeigt, dass die Elektroporation eine der effizientesten Methoden16,17,18,19ist.
Hier wird ein Elektroporationsprotokoll vorgestellt, das verfeinert wurde, um einzelne ependymogliale Zellen im erwachsenen Zebrafischtelencephalon zu kennzeichnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung einzelner ependyglialer Zellen, um ihnen über einen längeren Zeitraumvon 20 zu folgen oder bestimmte Wege zellautonom zu manipulieren21,22.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden unter Standardhaltungsbedingungen gehalten, und die Versuche wurden gemäß den Handhabungsrichtlinien und -vorschriften der EU und der Regierung von Oberbayern durchgeführt (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Herstellung von Plasmidmischung zur Elektroporation
- Verdünnen Sie das Plasmid von Interesse an sterilem Wasser und fügen Sie schnelle grüne Fleckenstammlösung [1 mg/ml] hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration des Plasmids 1 g/l beträgt. Fügen Sie den Fleck mit einer Konzentration von nicht mehr als 3% hinzu, da der einzige Zweck darin besteht, die Lösung zu färben und die ventrikuläre Injektion zu visualisieren.
- Nach der Herstellung die Plasmidlösung mischen, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen oder mit dem Finger tippen. Lagern Sie bei Raumtemperatur (RT) bis zur Nutzung.
HINWEIS: Für die Ko-Elektroporation von zwei Plasmiden in dieselbe Zelle stellen Sie sicher, dass die Konzentration jedes einzelnen Plasmids, das in der Mischung verwendet wird, mindestens 0,8 ng/l mit einem Molverhältnis von 1:1 beträgt, um eine Co-Elektroporationseffizienz von 80 %–90 % zu erzielen.
2. Vorbereitungen für Injektions- und Elektroporationsverfahren
- Bereiten Sie die Glaskapillaren (Außendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser 0,58 mm) vor, die für die Injektion in das Nadelzuggerät erforderlich sind.
- Um die richtige Menge an Plasmid zu injizieren (siehe oben), ziehen Sie die Kapillare bei einer Temperatur von 68,5 °C mit zwei leichten und zwei schweren Gewichten (siehe Tabelle der Materialien für Abzieherspezifikationen).
HINWEIS: Falls ein anderer Abzieher verwendet wird, kalibrieren Sie die Kapillare, um das entsprechende Volumen der Elektroporation zu liefern. - Stellen Sie die Einspritzvorrichtung manuell auf einen Einspritzdruck von 200 hPa (durch Drehen des Pi-Reglers) und einen konstanten Druck von 0 hPa ein. Stellen Sie die Einspritzzeit manuell auf den manuellen Modus ein und steuern Sie den Druck mit dem Fußpedal.
- Stellen Sie das Elektroporationsgerät mit fünf Impulsen bei 54–57 V (je 25 ms mit 1 s Intervallen) auf "LV-Modus" ein. Schließen Sie die Elektroden an das Gerät an.
- Bereiten Sie einen Fischtank mit sauberem Fischwasser vor, wo die Fische nach dem Elektroporationsverfahren aus der Anästhesie geweckt werden. Belüften Sie das Wasser, indem Sie den Luftstein während der gesamten Erholungsphase an der Luftpumpe befestigen, bis der Fisch vollständig erwacht ist.
- Nehmen Sie einen normalen Küchenschwamm und machen Sie einen Längsschnitt in den Schwamm, um Fische während des Injektions- und Elektroporationsvorgangs zu halten (siehe vorherige Veröffentlichung3).
HINWEIS: Der Küchenschwamm sollte regelmäßig gewaschen oder ausgetauscht werden, um mögliche giftige Chemikalien zu entfernen. - Legen Sie eine kleine Menge hochleitfähiges Mehrzweck-Ultraschallgel neben das Injektions- und Elektroporations-Setup.
HINWEIS: Dadurch wird eine angemessene elektrische Leitfähigkeit und damit die Verteilung der elektropoierten Zellen über das gesamte Telencephalon gewährleistet.
3. Zebrafisch Anästhesie
- Vor der Anästhesisierung eine Anästhesielösung mit 0,2% MS222 in destilliertem Wasser vorbereiten und den pH-Wert mit Tris-HCl-Puffer auf 7 einstellen. Verdünnen Sie diesen Bestand 1:10 (d.h. auf 0,02% MS222) mit Fischwasser.
- Anästhesisieren Sie die Fische, indem Sie sie in dieser Arbeitslösung halten, bis die Bewegung des Körpers und der Kiemen nachlässt (in der Regel für ein paar Minuten).
4. Plasmid-Lösungsinjektion
- Füllen Sie die vorbereitete Glaskapillare mit 10 L Plasmidlösung mit Mikroladerspitzen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen innerhalb der Kapillare.
- Drücken Sie Menü/Änderungskapillare am Injektionsgerät. Setzen Sie die Nadel ein und befesten Sie sie.
- Unter einem Stereomikroskop mit einer Vergrößerung von 3,2x oder 4x nur die Spitze der Kapillare mit feinen Enden schneiden. Schalten Sie die Injektionsvorrichtung aus dem Kapillarmodus ändern in den Inject-Modus, und drücken Sie dann mit einem Fußpedal, um sicherzustellen, dass die Plasmidlösung leicht aus der Nadel herausläuft und ungehindert.
- Den Fisch aus dem Haltungsbehälter mit Anästhesielösung in den Behälter (Kunststoffbox) geben. Warten Sie einige Minuten, bis die Bewegung der Kiemen nachlässt.
- Legen Sie den Fisch in den vorbenetzten Schwamm mit der dorsalen Seite nach oben. Führen Sie alle folgenden Injektionsschritte unter dem Stereomikroskop durch, um die Genauigkeit des Verfahrens zu gewährleisten.
- Mit einem sezierenden Mikromesser aus Edelstahl mit 40 mm Schneide und 0,5 mm Dicke, schaffen Sie ein kleines Loch im Fischschädel an der hinteren Seite des Telencephalons (Abbildung 1B), direkt neben der Grenze mit optischem Tectum.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte sorgfältig durchgeführt werden, da das Loch sehr klein und oberflächlich sein sollte, nur in den Schädel eindringen, um Hirnschäden zu vermeiden. - Neigen Sie den Fisch nach Bedarf und richten Sie die Spitze der Glaskapillare in den richtigen Winkel, um das Eindringen der Kapillarspitze durch das Loch zu erleichtern.
- Legen Sie die Spitze der Kapillare vorsichtig durch das Loch in den Schädel, bis er die telenzephalische Herzkammer erreicht (siehe Abbildung 1B). Dies erfordert das Eindringen durch die dorsale ependymale Zellschicht. Achten Sie besonders darauf, die Kapillare nicht zu tief einzufügen, um den Kontakt mit dem Hirngewebe zu vermeiden. Halten Sie die Kapillare genau zwischen den Hemisphären und bleiben Sie innerhalb der Herzkammer, kurz nachdem sie die dorsale ependymale Schicht durchbohrt hat.
HINWEIS: Das ist ein sehr heikler Schritt. Die Genauigkeit dieses Verfahrens wird durch Pigmentierung mutierte Linien wie messingy24verbessert, so dass eine bessere Visualisierung der Glaskapillarposition während der Injektion. - Mit der Kapillarspitze im Inneren des Ventrikels, injizieren Sie die Plasmidlösung, indem Sie Druck mit dem Fußpedal für ca. 10 s, was etwa 1 l Plasmidlösung entspricht.
HINWEIS: Beim Wechsel des Nadelziehers, der Kapillaren oder des Injektors sollte das System kalibriert werden, um immer eine Plasmidlösung von 1 L zu liefern. Die Kalibrierung kann durchgeführt werden, indem der Durchmesser des in ein Mineralöl ausgestoßenen Plasmidtröpfchens (z. B. Paraffinöl) gemessen und anschließend das Volumen des Tröpfchens berechnet wird. Nach 10 s Injektion sollte in das Mineralöl 1 L Plasmidflüssigkeit ausgestoßen werden. - Bestätigen Sie den Erfolg des vorherigen Schritts, indem Sie die Ausbreitung der Flüssigkeit im gesamten Ventrikel beobachten.
5. Elektroporation
- Entfernen Sie den Fisch aus dem Injektionssetup, während Sie ihn noch im Schwamm halten.
- Tauchen Sie die Innenseite der Spitze der Elektroden in das Ultraschallgel ein.
- Bedecken Sie den Fisch Telencephalon mit einer kleinen Menge Ultraschallgel.
- Positionieren Sie den Fischkopf zwischen den Elektroden, platzieren Sie die positive Elektrode an der ventralen Seite des Fischkopfes und die negative Elektrode auf der dorsalen Seite(Abbildung 1C), während Sie den Körper des Fisches noch im Schwamm halten. Dadurch wird die Strömungsrichtung des Stroms festgelegt, der erforderlich ist, um Ependymoglia in der subventrikulären Zone zu elektroporatieren.
- Drücken Sie die Elektroden vorsichtig und präzise gegen das Telencephalon (Abbildung 1C). Den Strom mit dem Fußpedal abstellen. Halten Sie die Elektroden an Ort und Stelle, bis alle fünf Impulse fertig sind.
6. Fischrückgewinnung
- Lassen Sie die Fische im zuvor vorbereiteten, kontinuierlich belüfteten Tank erholen, bis er aufwacht. Lidocain-Gel könnte auf den Schädel aufgetragen werden, um eventuell entwickelte Schmerzen zu lindern.
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Representative Results
Die beschriebene Elektroporationsmethode ermöglicht die Abgabe von Plasmid-DNA in ependymogliale Zellen, die sich oberflächlich im Zebrafischtelencephalon und knapp unter der dorsalen ependymalen Zellschicht befinden (Abbildung 1A).
Wenn das Ergebnis der Elektroporation positiv ist, können markierte einzelne ependygliale Zellen (rote Zellen in Abbildung 2A,B) unter anderen ependymogliaalen Zellen beobachtet werden (weiß in Abbildung 2A,B). Je nach Effizienz des Elektroporationsprozesses kann eine höhere (Abbildung 2A) oder niedrigere (Abbildung 2B) Anzahl der ependymogliaalen Zellen beschriftet werden. Dennoch ergibt dieses Protokoll eine höhere Anzahl von markierten Zellen als zuvor veröffentlicht20, was in Abbildung 3A und Video 1dargestellt ist. Es ist erwähnenswert, dass die höchste Dichte der markierten Zellen neigt dazu, vor allem auf der inneren, ventrikulären Seite beider Hemisphären entstehen (Abbildung 3A), aufgrund der Art und Weise, in der die injizierte Plasmid Flüssigkeit auf die Hemisphären verteilt. In Video 1wird eine Hemisphäre des Zebrafischtelencephalons in 3D dargestellt, und die ependymogliale Zellen mit radialen Prozessen sind von der Seite aus zu sehen. Die Zellen sind ko-elektropoiert und mit zwei Plasmiden, tdTomato-mem (rotes fluoreszierendes Protein, das an der Zellmembran verankert ist) und H2B-YFP-Plasmid (Etikettierungskerne) gekennzeichnet. Die Zellteilung von zwei Kernen, die von gelben Kreisen umgeben sind, sollte beachtet werden.
Erfolglose Elektroporation führt zu einer sehr geringen Anzahl oder keine beschrifteten ependymogliaalen Zellen. Dieses Ergebnis kann in der Regel durch eine ungenaue Injektion erklärt werden, bei der die Spitze der Kapillare nicht in die dorsale ependymale Zellschicht eindringt. In diesem Fall breitet sich die Plasmidlösung über die dorsale ependymale Zellschicht aus, anstatt telenzephalische Ventrikel zu füllen. Dies führt dazu, dass ependymale Zellen ausschließlich beschriftet werden (Abbildung 3B). Dorsale ependymale Zellen (blaue Pfeile in Abbildung 3B) unterscheiden sich morphologisch von ependymoglialen Zellen (gelber Pfeil in Abbildung 3A). Ihr Soma ist größer und quader, und sie besitzen keine radialen, längigen Prozesse. Dies zeigt sich am Vergleich einer Seitenansicht der ependymogliaalen Zellschicht (Abbildung 4A,B). TdTomato-mem-markierte Zellen sind höchstwahrscheinlich ependymale Zellen, die sich oberhalb der Schicht von Ependymoglia befinden (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu wird in Abbildung 4Aein tdTomato-mem-exemittes Plasmid in einzelne ependymogliaale Zellen eingeführt. So drücken sie tdTomato-mem zusätzlich zu ihrer anfänglichen Kennzeichnung aus (in diesem Fall transgene gfap:GFP Fischlinie, hier in Weiß gesehen).
Dieses Protokoll ermöglicht die Kennzeichnung und nachfolgende Verfolgung des Verhaltens von ependymogliale Zellen in Zebrafischtelencephalon nach Verletzungen über einen kurzen Zeitraum von21 oder langfristig3. Dies wird durch Live-, In-vivo-Bildgebung erreicht und hilft, die Frage nach ihrer Rolle bei regeneration und Neurogenese zubeantworten.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des koronalen Abschnitts des everted Zebrafischtelencephalons. (A) Schema eines koronalen Abschnitts von Zebrafischtelencephalon, Hervorhebung der Position von ependymoglialen Zellen, die ventrikuläre Oberfläche auskleidung und die ventrale ventrikuläre Wand bilden. Dorsale ependymale Schicht überbrückt die beiden Hemisphären und bedeckt die Herzkammer (V), die sich zwischen zwei Zellschichten befindet: ependymogliale und ependymale. Schwarzer Pfeil und die Darstellung der Augenanzeigeansicht sind in den Abbildungen 2 und Abbildung 3dargestellt. (B) Auf der linken Seite ein Foto des Zebrafischkopfes von oben aufgenommen, hervorhebt die Position von Telencephalon mit einer weißen gestrichelten Linie. Eine Glaskapillare ist rot dargestellt, zusammen mit der Zielstelle für das Einstecken von Kapillaren. Auf der rechten Seite ist ein Schaltplan des Zebrafischgehirns abgebildet, das die Position der Plasmidinjektion in Rot zeigt. Es sei darauf hingewiesen, dass die Glaskapillare das Telencephalon nicht berührt und dass das Plasmid knapp über dem Telencephalon in die Herzkammer injiziert wird. T = Telencephalon, OT = optisches Tectum. (C) Auf der linken Seite ist ein Foto des Zebrafischkopfes (Seitenansicht) abgebildet, und auf der rechten Seite ist eine Darstellung des Kopfes (Seitenansicht) dargestellt, die die Position der Elektroden zeigt, um das Telencephalon anzugreifen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mikrographen, die effektive Ergebnisse der Elektroporation zeigen. Dreidimensionale Darstellung eines (A) größeren oder (B) kleineren Anteils von elektroporated ependymoglial en zellen im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon, von oben betrachtet. Die Elektroporation erfolgte in Tg (gfap:GFP) Fischlinie, die GFP fluoreszierendes Protein (in Weiß dargestellt) in allen ependymogliaalen Zellen exdrückte. Einzelne elektroporated Zellen sind mit pCS2-tdTomato-mem Plasmid3gekennzeichnet. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Konfokale Mikrographien, die den Unterschied zwischen erfolgreicher und erfolgloser Elektroporation darstellen. (A) Dreidimensionales konfokales Bild von BABB-gerodetem Zebrafischtelencephalon (REF) mit einer großen Anzahl von pCS-tdTomato-mem elektroporated ependymoglial Zellen. Die Morphologie der ependymogliaalen Zellen mit langen, länglichen Prozessen (gelbe Pfeile) sollte beachtet werden. Beide telenzephalischen Hemisphären, hervorgehoben mit gelbgestrichelten Linien, können beobachtet werden. (B) Konfokales Bild der erfolglosen Elektroporation von pCS2-tdTomato-mem Plasmid. Meistens werden dorsale ependymale Zellen gekennzeichnet, und nur wenige ependymogliamale Zellen exprimieren tdTomato-mem Plasmid. Der deutliche Unterschied in der Morphologie von ependymalen Zellen (blaue Pfeile) sollte beachtet werden. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: 3D-Seitenansichten von elektropolierten und nicht-elektropoierten ependymogliaalen Zellen. (A) Dreidimensionale laterale Darstellung elektroporated ependymoglial Zellen, positiv für tg(gfap:GFP) und pCS2-tdTomato-mem (gelber Pfeil). (B) 3D-Lateraldarstellung erfolgloser Elektroporation. Die Lage der pCS2-tdTomato-mem-positiven Zellen über der Tg(gfap:GFP) ependymoglia Schicht sollte beachtet werden. Wahrscheinlich wurden dorsale ependymale Schichtzellen elektropoiert (blauer Pfeil). Skalenbalken = 30 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: 3D-Film von Zebrafisch Telencephalon und elektroporated ependymoglial Zellen. Video zeigt eine Hemisphäre des Zebrafischtelencephalons in 3D. Ependymogliale Zellen werden mit zwei Plasmiden ko-elektropoiert: tdTomato-mem (rotes fluoreszierendes Protein, das an der Zellmembran verankert ist) und H2B-YFP-Plasmid (Etikettierungskerne). Individuell gekennzeichnete Ependymoglia mit radialen Prozessen, die von der Seite beobachtet werden können. Gelbe Kreise markieren ependymogliaale Zelle mit mitotischen Figur visualisiert durch H2B-YFP beschriftet Chromatin. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Dieses Elektroporationsprotokoll ist eine zuverlässige In-vivo-Methode zur Kennzeichnung einzelner ependymotaler Zellen. Das Protokoll kann eine weitere Anpassung benötigen, um andere Zelltypen wie Neuronen oder Oligodendrozyten zu kennzeichnen. Um eine erfolgreiche Kennzeichnung zu erreichen, können Plasmide verwendet werden, die verschiedene Promotoren enthalten. Chicken-beta Actin Promoter, eF1alpha, CMV und Ubiquitin Promoter wurden zuvor verwendet, um die Expression von verschiedenen Transgenen in Ependymoglia und ihre Nachkommen zu fördern23. Es wurde jedoch eine unterschiedliche Kinetik der transgenen Expression beobachtet, die berücksichtigt werden sollte. Zum Beispiel ist die CMV-promotoriver transgene Expression sehr schnell (Ausdruck könnte nach 24 h gesehen werden), während eF1alpha länger dauert. Neben der Etikettierung kann das Elektroporationsprotokoll als schnelle und unkomplizierte Plattform der Genbearbeitung unter Verwendung von Cre Recombinase oder CRISPR Cas9 Techniken22verwendet werden. Darüber hinaus kann die Verwendung von Flip-Kassette25-haltigenPlasmiden und deren Elektroporation in zelltypspezifischen Cre-Linien als klare Erweiterung eines Verfahrens dienen, das eine Kennzeichnung oder Genbearbeitung in der nach Electroporation.
Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Erstens muss der Versuchsversuch während des Injektionsschritts darauf achten, dass die injizierte Plasmidmenge für jeden einzelnen Fisch gleich ist, so dass die Anzahl der markierten Zellen vergleichsweise ähnlich bleibt. Dies kann durch die Kontrolle der Größe der Glaskapillaröffnung erreicht werden, was bedeutet, dass der Schnitt jeder Spitze zwischen verschiedenen Kapillaren konstant sein sollte oder eine Kalibrierung für jede einzelne Kapillare durchgeführt werden sollte. Darüber hinaus sollte die Dauer der Injektion, die durch ein Fußpedal reguliert wird, für jede einzelne Injektion gleich sein. Zweitens ist die richtige Position eines Lochs im Schädel, das mit dem Mikromesser gemacht wird, entscheidend für die richtige Dispersion der Plasmidflüssigkeit im Telencephalon. Ebenso wichtig ist es, die dorsale ependymale Zellschicht mit der Kapillarspitze zu durchdringen, wie es im Protokoll heißt. Darüber hinaus ist es auch wichtig, dass das entstehende Loch nicht zu groß ist, um zu verhindern, dass das Plasmidgemisch und die Zerebrospinalflüssigkeit aus dem Telencephalon austritten. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Stärke des angewendeten elektrischen Stroms. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Elektroporationsvorrichtung so präzise wie möglich arbeitet, so dass die Stärke des angelegten Stroms nicht viel von der auf dem Bildschirm erscheinenden Spannung abweicht, die nicht immer genau ist. Wenn diese Werte nicht konsistent sind, ist es notwendig, die Stärke des Stroms auf der Elektroporationsvorrichtung einzustellen, da ein verabreichter Strom höher als die empfohlenen 54-57 V das Überleben der Fische beeinträchtigen kann.
Im Vergleich zu den anderen Methoden zur Plasmidabgabe und Zellkennzeichnung, die häufig im Feld verwendet werden, hat die Elektroporation offensichtliche Vorteile. Trotz der oben genannten kritischen Schritte kommt es sehr selten vor, dass keine elektroporated Zellen beobachtet werden können oder dass die dorsalen ependymalen Zellen irrtümlich elektropoiert werden. Im Allgemeinen beträgt die Erfolgsrate dieses Elektroporationsprotokolls 90%-95% und wir beobachten fast keine TUNEL+ Zellen nach der Elektroporation. Im Gegensatz zur Lipofektion beispielsweise werden während der Elektroporation kationische Liposomen (z.B. Liptectamin) nicht verwendet und somit eine mit ihrer Verwendung verbundene Toxizität vollständig vermieden26. Es wurde zuvor berichtet, dass Lipofektion und Elektroporation gleiche Effizienzraten haben (20-50 Zellen pro Telencephalon)27. Dieses optimierte Protokoll ergibt jedoch in der Regel 100-200 Zellen pro Telencephalon. Im Vergleich zu viralen Vektoren ist Biosicherheit kein Problem mit Derelektroporation.
Darüber hinaus können häufig verwendete AAVs oder Lentiviren keine nachweisbare Expression von Transgenen im Zebrafischhirn17,28produzieren. Obwohl das Cre-lox-System heutzutage häufig in Zebrafischen verwendet wird, ist die Plasmidelektroporation schneller, da sie keine langen Wartezeiten für die Fischzucht und -zucht erfordert und eine individuelle Zellkennzeichnung und -verfolgung ermöglicht. Eine solche Technik erfordert jedoch hochqualifizierte Wissenschaftler, um eine erfolgreiche Elektroporation und hohe Überlebensraten von Versuchstieren zu erreichen (wir haben in der Regel Überlebensraten von 70 %-80 %). Diese Rate neigt auch dazu, je nach Experimentator zu schwanken. Das Erlernen des Verfahrens erfordert Übung und dauert in der Regel drei Versuche. Dies hängt jedoch von der manuellen Geschicklichkeit des Einzelnen ab und kann in einigen Fällen länger dauern.
Das vorgestellte Elektroporationsprotokoll ist eine schnelle, hocheffiziente Methode zur Elektropoierung einer großen Anzahl von ependymogliaalen Zellen mit den notwendigen Vorsichtsmaßnahmen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Elektroporation des erwachsenen Zebrafischtelencephalons ist entscheidend für die Visualisierung einzelner ependymogliale Zellen und die Untersuchung ihrer Rolle in Neurogenese- und Regenerationsprozessen. In jüngster Zeit wurde ein Erfolg bei der gleichzeitigen Störung mehrerer Gene des erwachsenen Zebrafischtelencephalons durch Genbearbeitung über die Elektroporation und StagR-Cas9-Techniken22erzielt. Dies eröffnet viele Möglichkeiten und zukünftige Anwendungen der Elektroporation für ein breites Spektrum von genetischen Manipulationen.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Besonderer Dank geht an James Copti für die Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken auch der Finanzierung von JN durch die Deutsche Forschungsstiftung (DFG) durch die SFB 870 und SPP "Integrative Analyse der Olfaction" und SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plastizität & disease", SPP1757 " Glial heterogenity" und Exzellenzstrategie im Rahmen des Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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