Summary
Presenteras här är en elektroporation metod för plasmid DNA leverans och ependymoglial cell märkning i den vuxna zebrafiskar telencephalon. Detta protokoll är en snabb och effektiv metod för att visualisera och spåra enskilda ependymoglial celler och öppnar upp nya möjligheter att tillämpa elektroporation till ett brett spektrum av genetiska manipulationer.
Abstract
Electroporation är en transfektion metod där ett elektriskt fält appliceras på celler för att skapa tillfälliga porer i ett cellmembran och öka dess permeabilitet, vilket gör att olika molekyler som skall införas i cellen. I detta papper, är elektroporation används för att införa plasmider till ependymoglial celler, som linje ventrikulär zon av den vuxna zebrafiskar telencephalon. En bråkdel av dessa celler visar stamcells egenskaper och genererar nya nervceller i zebrafiskar hjärnan; Därför är det viktigt att studera deras beteende för att avgöra deras roller i neurogenes och regeneration. Införandet av plasmider via elektroporation möjliggör långsiktig märkning och spårning av en enda ependymoglial cell. Dessutom kan plasmider som CRE driver eller Cas9 levereras till en enda ependymoglial celler, vilket möjliggör genrekombination eller genredigering och ger en unik möjlighet att bedöma cellens autonoma genfunktion i en kontrollerad, Naturlig Miljö. Slutligen, denna detaljerade, steg-för-steg elektroporation protokoll används för att få framgångsrikt införande av plasmider i ett stort antal enda ependymoglial celler.
Introduction
Zebrafish är utmärkta djurmodeller för att undersöka hjärnans förnyelse efter en knivhugg sårskada. I jämförelse med däggdjur, på den evolutionära stege, mindre utvecklade arter såsom zebrafiskar allmänhet visar högre priser av konstitutiva neurogenes och bredare områden av vuxna neurala stamceller bosättning, vilket leder till ständig generering av nya nervceller i hela de flesta hjärnområden i vuxenlivet. Denna funktion verkar korrelera med betydligt högre regenerativ kapacitet av zebrafisk i jämförelse med däggdjur1, som zebrafiskar har anmärkningsvärd potential att effektivt generera nya nervceller i de flesta hjärnskada modeller studerade2, 3,4,5,6,7,8. Här är zebrafiskar telencephalon studeras, eftersom det är ett hjärnområde med framstående neurogenes i vuxen ålder. Dessa zoner av vuxna neurogenes är homolog till neurogena zoner i den vuxna däggdjurs hjärnan9,10,11.
Rikliga neurogena områden i zebrafiskar telencephalon är närvarande på grund av förekomsten av radiella glia som celler eller ependymoglia celler. Ependymoglial celler fungerar som bosatta vuxna neurala stamceller och är ansvariga för generering av nya nervceller i både intakt och regenererande hjärnan3,5. Härstamning experiment har visat att ventrikulär ependymoglia reagera på skada, sedan förgöra och generera nya neuroblaster som migrerar till lesion plats5. På grund av den vrängs natur zebrafiskar telencephalon, ependymoglial celler linje ventrikulära ytan och bygga ventrala ventrikulära väggen. Den dorsala ventrikulära väggen bildas av en dorsala ependymceller cellskikt (figur 1a). Viktigt är att zebrafiskar ependymoglia förkroppsligar egenskaperna hos både radiella glia-och ependymalceller från däggdjur. Långa radiella processer är typiska för radiala glia-celler, medan cellulära förlängningar och täta korsningar (liksom deras ventrikulära positioner) är typiska egenskaper hos ependymala celler12,13,14. Därför är dessa celler kallas ependymoglial celler.
För att följa in vivo beteende av enskilda ependymoglial celler under förnyelse, de måste vara tillförlitligt märkta. Olika metoder för in vivo cell märkning för fluorescerande mikroskopi har beskrivits tidigare, såsom endogena reportrar eller lipofila färgämnen15. Dessa metoder, i motsats till elektroporation, kan kräva längre tidsperioder och ofta inte erbjuder möjligheten att Single cell märkning eller permanent långsiktig spårning. Elektroporation, men (förutom Single cell märkning), erbjuder möjligheten att införa nya DNA i värdcellen. Dessutom, jämfört med andra metoder för DNA-överföring i cellerna, har elektroporation visat sig vara en av de mest effektiva metoderna16,17,18,19.
Presenteras här är en elektroporation protokoll som har förfinats i syfte att märka enda ependymoglial celler i den vuxna zebrafiskar telencephalon. Detta protokoll medger märkning av enstaka ependymoglialceller för att följa dem över en långsiktig period20 eller för att manipulera specifika vägar i ett cell självständigt sätt21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som används i detta protokoll har hållits under standard uppfödningsförhållanden, och experiment har utförts i enlighet med riktlinjerna och föreskrifterna för EU och regeringen i Oberbayern (AZ 55,2-1-54-2532-0916).
1. beredning av plasmid blandning för elektroporation
- Späd plasmiden av intresse i sterilt vatten och tillsätt snabbt grön fläck stamlösning [1 mg/mL]. Se till att den slutliga koncentrationen av Plasmiden är ∼ 1 μg/μL. Tillsätt fläcken vid en koncentration på högst 3%, eftersom dess enda syfte är att färga lösningen och visualisera ventrikulär injektion.
- När den är förberedd, blanda plasmid-lösningen genom att Pipettera upp och ner flera gånger eller med finger knackning. Förvara i rumstemperatur (RT) tills användning.
Anmärkning: För samtidig elektroporation av två plasmider i samma cell, se till att koncentrationen av varje enskild plasmid som används i blandningen är minst 0,8 ng/μL med ett molar förhållande på 1:1 för att få 80% – 90% samtidig elektroporering effektivitet.
2. förberedelser för injektion och Elektroporering förfarande
- Förbered glaset kapillärerna (yttre diameter 1 mm, innerdiameter 0,58 mm) som behövs för injektion i nålen dra apparaten.
- För att injicera rätt mängd plasmid (se ovan), dra kapillär vid en temperatur av 68,5 ° c med två lätta och två tunga vikter (se tabell över material för avdragare specifikationer).
Anmärkning: Om en annan avdragare används, kalibrera kapillär att leverera lämplig volym av elektroporation mix. - Ställ manuellt in insprutnings anordningen på ett insprutningstryck på 200 hPa (genom att vrida PI-ratten) och konstant tryck på 0 hPa. Ställ manuellt in insprutnings tiden till manuellt läge och kontrollera trycket med fotpedal.
- Ställ in elektroporeringsenheten på "LV-läge" med fem pulser vid 54 – 57 V (25 MS vardera med 1 s intervall). Anslut elektroderna till enheten.
- Förbered en fisk tank med rent fisk vatten, där fisken kommer att väckas från anestesi efter elektroporation förfarande. Lufta vattnet genom att hålla luft stenen ansluten till luftpump för hela återvinnings perioden tills fisken är helt väckt.
- Ta en vanlig köks svamp och gör en längsgående snitt i svampen för att hålla fisken i under injektion och elektroporation förfarande (se tidigare publikation3).
Anmärkning: Köks svamp bör regelbundet tvättas eller bytas ut för att avlägsna potentiella giftiga kemikalier. - Placera en liten mängd mycket ledande multi-purpose ultraljud gel bredvid injektion och elektroporation setup.
Anmärkning: Detta kommer att säkerställa adekvat elektrisk ledningsförmåga, och följaktligen, distribution av elektroporerade celler i hela telencephalon.
3. Zebrafish anestesi
- Före anestetisering, Förbered en stamlösning av anestesi med 0,2% MS222 i destillerat vatten och justera pH till 7 med Tris-HCl buffert. Späd detta bestånd 1:10 (dvs, till 0,02% MS222) med hjälp av fisk vatten.
- Anesthetize fisken genom att hålla dem i denna arbetslösning tills förflyttning av kroppen och gälarna avtar (typiskt för ett par minuter).
4. injektion av plasmid-lösning
- Fyll den beredda glas kapillär med 10 μL av plasmid lösning med hjälp av microloader tips. Undvik bildandet av luftbubblor inuti kapillärområdet.
- Tryck på Menu/ändra kapillär på injektions apparaten. Sätt in och Fäst nålen i Nålhållaren.
- Under ett stereomikroskop med en förstoring på 3,2 x eller 4x, skär bara spetsen av kapillär med hjälp av fina-end pinpett. Byt injektions apparat från Byt Kapillärläge till inmatnings läge och tryck sedan på en fotpedal för att säkerställa att plasmid-lösningen går lätt ut ur nålen och utan hinder.
- Överför fisken från djurhållnings behållaren till behållaren (plastask) med bedövningsmedel lösning. Vänta några minuter tills förflyttning av gälarna avtar.
- Placera fisken i den förfuktade svampen med ryggsidan vänd uppåt. Utför alla följande injektions steg under stereomikroskopet för att säkerställa att förfarandet är korrekt.
- Med hjälp av en dissekera mikro-kniv från rostfrittstål med 40 mm skäregg och 0,5 mm tjocklek, skapa ett litet hål i fisk skallen på den bakre sidan av telencephalon (figur 1b), precis bredvid gränsen med optisk tectum.
Anmärkning: Detta steg bör utföras noggrant eftersom hålet bör vara mycket liten och ytlig, genomträngande enbart skallen, för att undvika hjärnskador. - Luta fisken som behövs och orientera spetsen på glaset kapillär mot skallen i rätt vinkel för att underlätta inträngning av kapillärspetsen genom hålet.
- För in spetsen på kapillär genom hålet i skallen noga tills den når den av ventrikeln (se figur 1b). Detta kommer att kräva penetration genom dorsala ependymceller cell skiktet. Var särskilt noga med att inte infoga kapillär för djupt för att undvika kontakt med hjärnvävnaden. Håll kapillär exakt i mellan hjärnhalvorna, kvar inuti ventrikeln strax efter piercing den dorsala ependymceller skiktet.
Anmärkning: Detta är ett mycket känsligt steg. Noggrannheten i detta förfarande förbättras med hjälp av pigmentering Mutant linjer såsom BRASSY24, vilket möjliggör bättre visualisering av glas kapillär position under injektion. - Med kapillärspetsen insidan av ventrikeln, injicera plasmid lösning genom att tillämpa tryck med fotpedal för ca 10 s, vilket motsvarar cirka 1 μL av plasmid lösning.
Anmärkning: Om byte av nålavdragare, kapillärer eller injektor, bör systemet kalibreras för att alltid leverera 1 μL plasmid-lösning. Kalibrering kan utföras genom att mäta diametern på plasmid dropp utvisas i en mineralolja (t. ex. paraffinolja) och därefter beräkna volymen av DROPP. Efter 10 s av injektion, det bör vara ~ 1 μL av plasmid vätska utvisas i mineralolja. - Bekräfta framgången av föregående steg genom att observera spridningen av vätska i hela ventrikeln.
5. elektroporation
- Ta bort fisken från injektionsstället medan du fortfarande håller den i svampen.
- Doppa den inre sidan av spetsen av elektroderna i ultraljudsgelen.
- Täck fisken telencephalon med en liten mängd ultraljud gel.
- Placera fisk huvudet mellan elektroderna, placera den positiva elektroden på den ventrala sidan av fiskens huvud och den negativa elektroden på ryggsidan (figur 1c), medan du fortfarande håller fisken kropp i svampen. Detta sätter riktningen av flödet av strömmen som är nödvändig till electroporate ependymoglia som är placerad på subventrikulära zonplanerar.
- Tryck elektroderna försiktigt och exakt mot telencephalon (figur 1c). Administrera strömmen med fotpedal. Håll elektroderna på plats tills alla fem pulserna är klara.
6. fisk återvinning
- Låt fisken återhämta sig i den tidigare beredda, kontinuerligt kolsyrade tanken tills den vaknar upp. Lidokain gel kan appliceras på skallen för att lindra eventuellt utvecklad smärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna elektroporation metod tillåter leverans av plasmid DNA i ependymoglial celler, som ligger ytligt i zebrafiskar telencephalon och strax under dorsala ependymceller cell lagret (figur 1a).
Om resultatet av elektroporation är positivt, märkt enda ependymoglial celler (röda blodkroppar i figur 2A, B) kan observeras bland andra ependymoglial celler (vit i figur 2A, B). Beroende på effektiviteten i den elektroporation processen, en högre (figur 2A) eller lägre (figur 2b) antal ependymoglial celler kan märkas. Detta protokoll ger dock högre antal märkta celler än tidigare publicerade20, vilket framgår av figur 3a och video 1. Det är värt att nämna att den högsta tätheten av märkta celler tenderar att dyka upp mest på den inre, ventrikulära sidan av båda halvkloten (figur 3a), på grund av det sätt på vilket den injicerade plasmid vätskan distribuerar mellan hjärnhalvorna. I video 1, en halvklot av zebrafiskar telencephalon presenteras i 3D, och ependymoglial celler med radiella processer kan ses från sidan. Cellerna är co-elektroporated och märkta med två plasmider, tdTomato-MEM (rött fluorescerande protein förankrad i cellmembranet) och H2B-YFP plasmid (märkning kärnor). Cell delning av två kärnor omgiven av gula cirklar bör noteras.
Misslyckad elektroporation resulterar i mycket lågt antal eller inga märkta ependymoglial celler. Detta resultat kan generellt förklaras av felaktig injektion, där spetsen av kapillär inte penetrera dorsala ependymceller cell skiktet. I detta fall, plasmid lösning sprider sig över dorsala ependymceller cell lagret i stället för att fylla av ventrikeln. Detta leder till att ependymceller celler enbart märks (figur 3b). Dorsala ependymala celler (blå pilar i figur 3b) skiljer sig morfologiskt från ependymogliala celler (gul pil i figur 3a). Deras Soma är större och kub, och de inte besitter radiella, långsträckta processer. Detta framgår av att jämföra en sida syn på ependymoglial cellager (figur 4a, B). Tdtomato-MEM märkta celler är mest sannolikt ependymceller celler, som ligger ovanför lagret av ependymoglia (figur 4b). Däremot, i figur 4a, en tdTomato-MEM uttrycker plasmid introduceras till enskilda ependymoglial celler. Således uttrycker de tdTomato-MEM förutom deras första märkning (i detta fall, transgena gfap: GFP Fish Line, sett här i vitt).
Detta protokoll gör det möjligt att märkningen och efterföljande följande av beteendet hos ependymoglial celler i zebrafiskar telencephalon efter skada under en kort-21 eller långsiktiga3 tidsperiod. Detta åstadkoms genom Live, in vivo Imaging och hjälper till att ta itu med frågan om deras roller i förnyelse och neurogenes.
Figur 1: schematisk representation av koronala delen av vrängs zebrafiskar telencephalon. (A) system av en koronar sektion av zebrafiskar telencephalon, belyser positionen av ependymoglial celler, som är foder ventrikulär yta och bygga den ventrala ventrikulära väggen. Dorsala ependymceller skiktet är att överbrygga de två hjärnhalvorna och täcker ventrikeln (V), som ligger mellan två cellskikt: ependymoglial och ependymceller. Svart pil och återgivningen av ögat indikerar visning visas i figurerna 2 och figur 3. (B) till vänster, ett fotografi av zebrafiskar huvudet tas uppifrån, belyser positionen av telencephalon med en vit streckad linje. Ett glas kapillär avbildas i rött, tillsammans med målplatsen för kapillär införande. Bilden till höger är en schematisk av zebrafiskar hjärna som visar positionen av plasmid injektion i rött. Det bör noteras att glaset kapillär inte vidrör telencephalon och att plasmiden injiceras strax ovanför telencephalon i ventrikeln. T = telencephalon, OT = optisk tectum. (C) avbildad till vänster är ett fotografi av zebrafiskar huvudet (sidovy), och till höger är en skildring av huvudet (sidovy) som visar positionen av elektroder för att rikta den telencephalon. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikrografer som visar effektiva elektroporeringutfall. Tredimensionell representation av a (a) större eller (B) mindre antal elektroporerade ependymoglial celler i den vuxna zebrafiskar telencephalon, sedd från ovan. Den elektroporation gjordes i TG (gfap: GFP) fisk linje uttrycker GFP fluorescerande protein (avbildad i vitt) i alla ependymoglial celler. Enskilda elektroporerade celler är märkta med pCS2-tdTomato-MEM plasmid3. Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: konfokala mikrografer som skildrar skillnaden mellan lyckad och misslyckad elektroporation. (A) tredimensionell konfokal bild av Babb-rensat zebrafiskar telencephalon (Ref) med ett stort antal datorer-tdtomato-MEM elektroporated ependymoglial celler. Morfologin av ependymoglial celler med långa, långsträckt processer (gula pilar) bör noteras. Både av halvklot, markeras med gula streckade linjer, kan observeras. (B) konfokala bilden av misslyckad elektroporation av PCS2-tdTomato-MEM plasmid. Mestadels dorsala ependymceller celler är märkta, och några ependymoglial celler uttrycker tdtomato-MEM plasmid. Den tydliga skillnaden i morfologin av ependymceller celler (blå pilar) bör noteras. Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:3D laterala vyer av elektroporerade och icke-elektroporated ependymoglial celler. Atredimensionell lateral representation elektroporerad ependymoglial celler, positiv för både TG (GFAP: GFP) och PCS2-tdtomato-MEM (gula pilen). B) 3D-lateral representation av misslyckad elektroporering. Placeringen av pCS2-tdTomato-MEM positiva celler ovanför TG (gfap: GFP) ependymoglia skikt bör noteras. Mest sannolika dorsala ependymceller lager celler var electroporated (blå pil). Skalstreck = 30 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1:3D-film av zebrafiskar telencephalon och elektroporated ependymoglial celler. Video visar en halvklot av zebrafiskar telencephalon i 3D. Ependymoglial celler är co-elektroporated med två plasmider: tdTomato-MEM (rött fluorescerande protein förankrat i cellmembranet) och H2B-YFP plasmid (märkning kärnor). Individuellt märkta ependymoglia med radiella processer som kan observeras från sidan. Gula cirklar Markera ependymoglial cell med mitotisk figur visualiseras av H2B-YFP märkt kromatin. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta elektroporation protokoll är en pålitlig in vivo metod för märkning enskilda ependymoglial celler. Protokollet kan behöva en ytterligare anpassning för att märka andra celltyper såsom nervceller eller oligodendrocyter. För att uppnå en lyckad märkning kan plasmider som innehåller olika projektansvariga användas. "Chicken-beta aktin promotor, eF1alpha, CMV och ubiquitin promotor" har tidigare använts för att driva uttrycket av olika transgener i ependymoglia och deras avkomman23. Emellertid observerades olika kinetik av transgen uttryck som bör tas in i kontot. Till exempel är CMV promotorn driven transgenens uttryck mycket snabb (uttryck kan ses efter 24 h), medan eF1alpha tar längre tid. Bortsett från märkning, kan elektroporation protokollet användas som en snabb och enkel plattform för genredigering med hjälp av CRE driver eller CRISPR Cas9 tekniker22. Dessutom kan användning av plasmider med Flip-kassett25och deras elektroporering i celltypspecifika CRE-linjer fungera som en tydlig utvidgning av en metod som möjliggör märkning eller genredigering i den ependymogliala avkomman som genereras efter elektroporation.
Det här protokollet har flera kritiska steg. Först, under insprutnings steget, måste försökspersonen vara försiktig med att den injicerade plasmid beloppet är lika för varje enskild fisk, så att antalet märkta celler förblir jämförbar lika. Detta kan åstadkommas genom att kontrollera storleken på glaset kapilläröppningen, vilket innebär att snittet av varje spets bör vara konstant bland olika kapillärer eller kalibrering bör utföras för varje enskild kapillär. Dessutom, varaktigheten av injektion, regleras av en fotpedal, bör vara densamma för varje enskild injektion. För det andra, rätt position ett hål i skallen som gjorts med mikro-kniven är avgörande för en korrekt spridning av plasmid vätskan i hela telencephalon. Det är lika viktigt att tränga in i dorsala ependymceller cell skiktet med kapillärspetsen, som anges i protokollet. Dessutom är det också viktigt att hålet skapas inte är för stor för att förhindra plasmid blandningen och cerebrospinalvätska läcker ut ur telencephalon. Ett annat kritiskt steg är styrkan i den applicerade elektriska strömmen. Det är viktigt att se till att elektroporation enheten fungerar så exakt som möjligt, så att styrkan i den tillämpade strömmen inte avviker mycket från spänningen som visas på skärmen, vilket inte alltid är korrekt. Om dessa värden inte är konsekventa, är det nödvändigt att justera styrkan på strömmen på elektroporation enheten, eftersom en administrerad ström högre än den rekommenderade 54-57 V kan äventyra fisk överlevnad.
Jämfört med andra metoder för en Plasmid leverans och cell märkning som vanligen används inom området, har elektroporation uppenbara fördelar. Trots de kritiska stegen som nämns ovan, händer det mycket sällan att inga elektroporerade celler kan observeras eller att dorsala ependymceller celler av misstag elektroporated. Generellt är framgången för detta elektroporation protokoll 90%-95% och vi observerar nästan ingen Tunel + celler efter elektroporation. Till skillnad från lipofektion till exempel, under elektroporation, katjoniska liposomer (t. ex. lipofectamin) används inte och därmed toxicitet i samband med dess användning är helt undvikas26. Det rapporterades tidigare att lipofektion och elektroporation har lika effektivitetsgrad (20-50 celler per telencephalon)27. Emellertid, detta optimerade protokoll ger i allmänhet 100-200 celler per telencephalon. I jämförelse med virala vektorer, biosäkerhet är inte ett problem med elektroporation.
Dessutom, vanligen används aavs eller lentivirus misslyckas med att producera detekterbart uttryck av transgener i zebrafiskar hjärna17,28. Slutligen, även om CRE-LOX systemet är numera vanligen används i Zebrafish, plasmid elektroporation är snabbare eftersom det inte kräver långa väntetider som krävs för fisk avel och odling och tillåter individuell cell märkning och spårning. Men en sådan teknik kräver mycket skickliga forskare för att uppnå framgångsrik elektroporation och hög överlevnad av försöksdjur (vi brukar uppleva överlevnad på ~ 70%-80%). Denna kurs tenderar också att fluktuera beroende på försöksledaren. Att lära sig proceduren kräver övning och tar normalt tre prövningar. Detta är dock beroende av den manuella fingerfärdighet av individen och kan ta längre tid i vissa fall.
Den presenterade elektroporation protokollet är en snabb, mycket effektiv metod för elektroporating ett stort antal ependymoglial celler med nödvändiga försiktighetsåtgärder för att få optimala resultat. Elektroporation av den vuxna zebrafiskar telencephalon är avgörande för att visualisera enskilda ependymoglial celler och studera deras roller i neurogenes och regenereringsprocesser. Nyligen har framgång uppnåtts i samtidig störning av flera gener av den vuxna zebrafiskar telencephalon genom genredigering via elektroporation och stagr-Cas9 Techniques22. Detta öppnar många möjligheter och framtida tillämpningar av elektroporation för ett brett spektrum av genetiska manipulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Speciellt tack till James Copti för redigering av manuskriptet. Vi erkänner också tacksamt finansiering till JN från den tyska Research Foundation (DFG) av SFB 870 och SPP "integrativ analys av Olfaction" och SPP 1738 "framväxande roller icke-kodning RNAs i nervsystemet utveckling, plasticitet & sjukdom", SPP1757 " Glial heterogenitet ", och Excellence strategi inom ramen för München cluster för system Neurology (EXC 2145 SyNergy-ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
