Summary
מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.
Abstract
אלקטרופורציה היא שיטת המשך החצייה שבה שדה חשמלי מוחל על תאים כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום התא ולהגדיל את החדירות שלה, ובכך לאפשר למולקולות שונות להיות מוצגים לתא. במאמר זה, אלקטרופורציה משמש כדי להחדיר פלמידים כדי ependymoglial תאים, אשר קו האזור החדרית של המבוגר ביותר הדגים telencephalon. חלק של תאים אלה מראה מאפייני תא גזע ומייצר נוירונים חדשים במוח דג זברה; לכן, לימוד התנהגותם חיוני כדי לקבוע את תפקידם בנוירוגנזה והתחדשות. הקדמה של פלסטלינה באמצעות אלקטרופורציה מאפשרת תיוג לטווח ארוך ומעקב אחר תא ependymoglial יחיד. יתר על כן, פלמידים כגון היצורים recombinase או Cas9 יכולים להיות מועברים לתאים בודדים ependymoglial, אשר מאפשר שילוב גנים או לערוך גנים ומספק הזדמנות ייחודית להעריך את פונקציית הגן האוטונומית של התא בשליטה, טבעי סביבה. בסופו של דבר, פרוטוקול האלקטרופורציה המפורט, שלב-אחר-שלב משמש להשגת הקדמה מוצלחת של פלמידים למספר רב של תאים ependymoglial בודדים.
Introduction
בכדי לבחון התחדשות מוחית. לאחר פציעה בפצע דקירה בהשוואה ליונקים, על הסולם האבולוציוני, מינים מפותחים פחות כגון דג זברה בדרך כלל להציג שיעורי גבוה יותר של נוירוגנזה ואזורים נרחבים של מגורים מבוגרים תא גזע עצבי, המוביל לדור קבוע של נוירונים חדשים ברחבי רוב אזורי המוח בחיים הבוגרים. תכונה זו מופיעה בתיאום עם קיבולת משובי גבוהה באופן משמעותי של דג דג זברה בהשוואה ליונקים1, כמו דג זברה יש פוטנציאל מדהים ליצור ביעילות נוירונים חדשים ברוב מודלים של פגיעה במוח למדו2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה כאן מחקר הדגים הזינצאלון נלמד, שכן הוא אזור מוחי עם נוירוגנזה בולטת בבגרות. אזורים אלה של נוירוגנזה למבוגרים הם הומוולוגי לאזורים נוירוגניים במוח היונקים הבוגרים9,10,11.
שופע באזורים נוירוגניים ב-דג זברה telencephalon נוכחים בשל קיומו של הרדיאלי glia כמו תאים או תאים ependymoglia. Ependymoglial תאים לפעול כתושב תאי גזע עצביים למבוגרים ואחראים על הדור של נוירונים חדשים במוח שלמים ומתחדשות3,5. ניסויים מעקב השושלת הראו כי ependymoglia חדרית להגיב לפציעה, לאחר מכן מתרבים וליצור חדש neuroblasts נמשך להגר לאתר הנגע5. בשל טבעו הטבעי של הדגים הזינצאלון, תאים ependymoglial קו המשטח החדרית ולבנות את הקיר החדרית הגייתי. הקיר הבין-חדרית נוצר על ידי שכבת תא ependymal (איור 1A). וחשוב מכך, דג זברה ependymoglia לגלם את המאפיינים של שני היונקים הרדיאליים והתאים ependymal. תהליכים רדיאליים ארוכים הם תכונה טיפוסית של תאים הרדיאלי של גליה, ואילו הרחבות סלולר וצמתים הדוקים (כמו גם המיקומים החדרית שלהם) הם תכונות טיפוסיות של ependymal תאים12,13,14. לכן, תאים אלה נחשבים לתאים ependymoglial.
כדי לעקוב אחר התנהגות vivo של תאים בודדים ependymoglial במהלך התחדשות, הם צריכים להיות מתויג באופן אמין. שיטות שונות של vivo תא תיוג עבור מיקרוסקופ פלורסנט תוארו בעבר, כגון כתבים אנדוגני או צבע ליפופילית15. שיטות אלה, בניגוד לאלקטרופורציה, עשויות לדרוש פרקי זמן ארוכים יותר ולעתים קרובות אינן מציעות אפשרות של תיוג תאים בודד או מעקב קבוע לטווח ארוך. אלקטרופורציה, עם זאת (מלבד תוויות תא יחיד), מציעה את האפשרות של החדרת DNA חדש לתא המארח. יתר על כן, לעומת שיטות אחרות של העברת DNA לתוך התאים, אלקטרופורציה הוכח להיות אחת השיטות היעילות ביותר16,17,18,19.
מוצג כאן הוא פרוטוקול אלקטרופורציה כי כבר מעודן לצורך תיוג תאים ependymoglial בודדים בתוך המבוגר הדגים telencephalon. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial יחיד כדי לעקוב אחריהם לאורך תקופה ארוכת טווח20 או לטפל מסלולים ספציפיים באופן אוטונומי התא21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל החיות המשמשות בפרוטוקול זה נשמרו תחת תנאי גידול סטנדרטיים, וניסויים בוצעו על פי הנחיות הטיפול והתקנות של האיחוד האירופי וממשלת בוואריה עילית (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. הכנת תערובת פלאמיד לאלקטרופורציה
- לדלל את הפלסטלינה של העניין במים סטריליים ולהוסיף מהיר הירוק פתרון מלאי הכתם [1 מ"ג/mL]. ודא כי הריכוז הסופי של הפלסמיד הוא ∼ 1 μg/μL. להוסיף את הכתם על ריכוז של לא יותר מ 3%, כמו המטרה היחידה שלה היא צבע את הפתרון ולהמחיש הזרקת חדרית.
- לאחר הכנת, לערבב את הפתרון פלמיד על ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים או על ידי הקשה אצבע. אחסן בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש.
הערה: עבור שיתוף אלקטרופורציה של שני פלמידים לתוך אותו תא, להבטיח את הריכוז של כל מרכז בודד בשימוש בתערובת הוא לפחות 0.8 ng/μL עם יחס טוחנת של 1:1 להשיג 80% – 90% שיתוף היעילות.
2. ההכנות להזרקה ולהליך אלקטרופורציה
- הכן את נימי הזכוכית (קוטר חיצוני 1 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ) הכרחי להזרקה במנגנון מושך המחט.
- על מנת להזריק את הכמות הנכונה של פלסמיד (ראה לעיל), משוך את הנימים בטמפרטורה של 68.5 ° c עם שני משקולות אור ושני משקלים כבדים (ראו טבלת חומרים למפרטים).
הערה: במקרה של שימוש בפולר שונה, כיול הקפילר כדי לספק את הנפח המתאים של ערבוב האלקטרופורציה. - להגדיר באופן ידני את התקן ההזרקה ללחץ הזרקה של 200 hPa (על ידי הפעלת כפתור Pi) ולחץ מתמיד של 0 hPa. הגדר באופן ידני את זמן ההזרקה למצב ידני ושלוט בלחץ עם דוושה ברגל.
- הגדר את התקן אלקטרופורציה "במצב LV" עם חמישה פולסים ב 54-57 V (25 ms כל אחד עם מרווחי 1). חבר את האלקטרודות להתקן.
- הכינו מיכל דגים אחד עם מי דגים נקיים, שם הדגים יתעוררו מהרדמה לאחר הליך האלקטרופורציה. מאוורר את המים על ידי שמירה על אבן האוויר המצורפת למשאבת האוויר למשך תקופת ההחלמה כולה עד שהדג מתעורר במלואו.
- קח ספוג מטבח רגיל ולעשות חתך האורך בספוג להחזיק דגים לתוך במהלך ההזרקה והליך אלקטרופורציה (לראות את הפרסום הקודם3).
הערה: ספוג מטבח צריך לשטוף או להחליף באופן קבוע כדי להסיר כימיקלים רעילים פוטנציאליים. - מניחים כמות קטנה של ג'ל אולטרא סאונד רב תכליתי במיוחד ליד התקנת הזריקה ואלקטרופורציה.
הערה: הדבר יבטיח מוליכות חשמלית נאותה, וכתוצאה מכך, הפצת תאים אלקטרופורמים בכל הטלנצלון כולו.
3. דג הרדמה מדגים
- לפני ההרדמה, להכין פתרון מניות של הרדמה עם 0.2% MS222 במים מזוקקים ולהתאים את ה-pH כדי 7 עם מאגר Tris-HCl. לדלל את המניה 1:10 (כלומר, כדי 0.02% MS222) באמצעות מי דגים.
- הכפיש את הדג על-ידי שמירה על הפתרון העובד הזה עד לתנועת הגוף והזימים (בדרך כלל למספר דקות).
4. פלמיד הזרקת פתרון
- למלא את נימי זכוכית מוכן עם 10 μL של פתרון פלבאמצע באמצעות טיפים microloader. הימנע היווצרות בועות אוויר בתוך נימי.
- הקש על תפריט/שנה נימי בהתקן ההזרקה. להוסיף ולאבטח את המחט לתוך מחזיק המחט.
- תחת stereomicroscope עם הגדלה של 3.2 x או 4x, לחתוך רק את קצה הנימים באמצעות מלקחיים בקצה עדין. החלף את מכשיר ההזרקה ממצב נימי למצב הכנסה , לאחר מכן להחיל לחץ עם דוושת הרגל כדי להבטיח את הפתרון הפלמיד פועל בקלות מתוך המחט ללא הפרעה.
- להעביר את הדג ממיכל הגידול אל המיכל (פלסטיק תיבת) עם פתרון הרדמה. חכו כמה דקות עד שהתנועה. של הזימים תהיה משנית
- מניחים דגים לתוך הספוג שלפני הציפוי, כאשר הצד השני פונה כלפי מעלה. בצע את כל שלבי ההזרקה הבאים תחת stereomicroscope כדי להבטיח את הדיוק של השגרה.
- באמצעות ניתוח מיקרו-סכין מפלדת אל-חלד עם 40 mm חיתוך קצה ו 0.5 מ"מ עובי, ליצור חור קטן בגולגולת הדג בצד האחורי של הטלנצאלון (איור 1B), ממש ליד הגבול עם tectum אופטי.
הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות, שכן החור צריך להיות מאוד קטן ושטחי, חודר אך ורק את הגולגולת, כדי למנוע נזק מוחי. - להטות את הדג לפי הצורך וכוון את קצה נימי הזכוכית לעבר הגולגולת בזווית הנכונה כדי להקל על חדירת הקצה הנימי דרך החור.
- הכנס את קצה הנימים דרך החור בגולגולת בזהירות עד שהוא מגיע החדר telencephalic (ראה איור 1B). זה ידרוש חדירה דרך שכבת התא ependymal. להיות זהירים במיוחד לא להכניס את נימי עמוק מדי כדי למנוע מגע עם רקמת המוח. לשמור על נימי בדיוק בין האונות, נשאר בתוך החדר רק לאחר פירסינג השכבה ependymal.
הערה: . זה צעד מאוד עדין דיוק של הליך זה משופר באמצעות קווי פיגמנטציה מוטציה כגון חצוף24, המאפשר הדמיה טובה יותר של מיקום נימי זכוכית במהלך ההזרקה. - עם עצה נימי בתוך החדר, להזריק את הפתרון פלבאמצע על ידי הפעלת לחץ עם דוושת הרגל על 10 s, אשר מתאים כ 1 μL של פתרון פלמיד.
הערה: אם שינוי מחטים המחט, נימים או מזרק, המערכת צריך להיות מכויל כדי לספק תמיד 1 μL של פתרון פלבאמצע. ניתן לבצע כיול על-ידי מדידת קוטר ה-droplet הפלגיאני הנפלט לתוך שמן מינרלי (למשל, שמן פרפין) ולאחר מכן חישוב הנפח של ה-droplet. לאחר 10 s של הזרקה, צריך להיות ~ 1 μL של נוזל פלמיד מגורש לתוך שמן מינרלי. - לאשר הצלחה של השלב הקודם על ידי התבוננות התפשטות של נוזל בכל החדר.
5. אלקטרופורציה
- הסר את הדג מתוך הגדרת הזריקה תוך שהוא עדיין מחזיק אותו בספוג.
- לטבול את הצד הפנימי של קצה האלקטרודות ג'ל אולטרסאונד.
- מכסים את הדג טלנצאלון עם כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד.
- מקמו את ראש הדג בין האלקטרודות, ממקמים את האלקטרודה החיובית בצדו הגחוני של ראש הדג ואת האלקטרודה השלילית שבצד השני (איור 1C), תוך שהיא עדיין מחזיקה את גוף הדג בספוג. זה מגדיר את הכיוון של הזרימה הנוכחית של הצורך electroporate ependymoglia ממוקם באזור subventricular.
- לחץ על האלקטרודות בעדינות ובדיוק נגד הטלנצאלון (איור 1C). . הזרם עם דוושת הרגל החזיקו את האלקטרודות במקום עד לסיום כל חמשת הפולסים.
6. שחזור דגים
- בואו הדג להתאושש במיכל מוכן בעבר, גז ברציפות עד שהוא מתעורר. ג'ל לידוקאין יכול להיות מיושם על הגולגולת כדי להקל על כל כאבים שפותחו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת האלקטרופורציה המתוארת מאפשרת אספקת דנ א פלמיד לתוך ependymoglial תאים, אשר נמצאים באופן שטחי ביותר בתוך הטלודג הזינצאלון ומתחת לשכבת התא הependymal (איור 1A).
אם תוצאת האלקטרופורציה חיובית, הנקראת ependymoglial תאים בודדים (תאים אדומים באיור 2a, b) ניתן לצפות בין תאים ependymoglial אחרים (לבן באיור 2a, b). בהתאם ליעילות של תהליך האלקטרופורציה, ייתכן שתווית גבוהה יותר (איור 2A) או מספר נמוך יותר (איור 2a) של תאים ependymoglial. עם זאת, פרוטוקול זה מניב מספר גבוה יותר של תאים בעלי תוויות מאשר שפורסמו בעבר20, אשר ברור באיור 3A ו- Video 1. כדאי להזכיר כי הצפיפות הגבוהה ביותר של תאים בעלי תווית נוטה לצוץ בעיקר בתוך הצד הפנימי, הצדדי של שתי האונות (איור 3A), בשל האופן שבו נוזל בינוני הזריק הנוזלים בין האונות. ב וידאו 1, כדור המחצית השני של הדגים טלנצאלון מוצג 3d, ואת התאים הependymoglial עם תהליכים רדיאליים ניתן לראות מהצד. התאים הם שכונתיות ומתויג עם שני פלמידים, tdTomato-מזכור (חלבון פלורסנט אדום מעוגן קרום התא) ו H2B-YFP פלמיד (גרעיני תוויות). יש לציין חלוקת תאים של שני גרעינים המוקפים בעיגולים צהובים.
אלקטרופורציה לא מוצלחת גורמת למספר נמוך מאוד או ללא ependymoglial תאים מסומנים. תוצאה זו יכולה להיות מוסברת בדרך כלל על ידי הזרקה לא מדויקת, שבה קצה של נימי אינו חודר את שכבת התא ependymal. במקרה זה, פתרון פלמיד מתפשט מעל שכבת התא ependymal במקום למלא telencephalic חדר. הדבר מוביל לתאים ependymal המסומנים בלבד (איור 3B). Ependymal תאים (חיצים כחולים באיור 3B) שונים מורפולוגית מתאי ependymoglial (חץ צהוב באיור 3b). הסומה שלהם גדולה יותר וכתיבה, והם אינם בעלי תהליכים רדיאליים ומאורכים. הדבר ניכר מהשוואת התצוגה הצדדית של שכבת התא הependymoglial (איור 4A, B). התאים המסומנים ב-TdTomato מתויגים כנראה תאים ependymal, הממוקמים מעל שכבת ependymoglia (איור 4B). לעומת זאת, באיור 4A, המבטא הפלמאני של הגברת tdTomato מוצג לתאים ependymoglial בודדים. כך, הם מבטאים tdTomato-גברתי בנוסף תיוג הראשונית שלהם (במקרה זה, הטרנסגניים gfap: קו הדגים gfp, נראה כאן לבן).
פרוטוקול זה מאפשר את התיוג ולאחר מכן בעקבות התנהגותם של תאים ependymoglial ב-דג זברה טלנצאלון לאחר הפגיעה במשך זמן קצר-21 או ארוך טווח3 . זה מושג באמצעות החיים, בהדמיה vivo ומסייעת להתייחס לשאלת תפקידם בהתחדשות ובנוירוגנזה.
איור 1: ייצוג סכימטי של החלק הקורילי של הדגים הזנצניים. (A) הערכה של קטע ילתית של מערכת הדגים טלנצאלון, הדגשת המיקום של תאים ependymoglial, אשר בטנה משטח חדרית ובניית הקיר חדרית הגייתי. השכבה הependymal היא גישור שתי האונות וכיסוי החדר (V), הממוקם בין שתי שכבות התא: ependymoglial ו ependymal. חץ שחור וייצוג העין מציינים את התצוגה מוצגים באיורים 2 ובאיור 3. (ב) בצד שמאל, תצלום של ראש הדגים שנלקח מלמעלה, הדגשת המיקום של טלנצאלון עם קו מקווקו לבן. נימי זכוכית מתוארים באדום, יחד עם אתר היעד להכנסת קפילר. בתמונה מימין הוא סכמטי של מוח של דג מראה את המיקום של הזרקת פלאמיד באדום. יש לציין כי נימי הזכוכית לא נוגעים בטלנצאלון ושהפלסטלינה מוזרקת ממש מעל לחדר המגע. T = טלנצאלון, OT = tectum אופטי. (ג) המופיע משמאל הוא תצלום של ראש הדג (מבט צדדי), ומימין הוא תיאור של הראש (מבט צדדי) המראה את מיקום האלקטרודות על מנת למקד את הטלנצאלון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרוגרפים המציגים תוצאות אלקטרופורציה אפקטיביות. ייצוג תלת מימדי של (א) גדול יותר או (ב) מספר קטן יותר של תאים ependymoglial electroporated בתוך המבוגר בדגים טלנצאלון, כפי שמוצג מלמעלה. האלקטרופורציה נעשתה ב Tg (gfap: gfp) קו דגים המבטא חלבון פלורסנט gfp (מתואר לבן) בכל התאים הependymoglial. תאים חשמליים בודדים מתויג באמצעות pCS2-tdTomato-גברת פלמיד3. קנה מידה ברים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקרוגרפים בעלי מיקוד המתאר את ההבדל בין אלקטרופורציה מוצלחת לנכשלה. (א) תמונה מימדית תלת ממדית של באבבי נוקו מחברת טלנצאלון (REF) עם מספר רב של תאים מחשבים-tdTomato-ependymoglial. יש לציין את המבנה של התאים הependymoglial עם תהליכים ארוכים ומאורכים (חיצים צהובים). שתי האונות הtelencephalic, המסומנות בקווים מקווקווים צהובים, ניתן לצפות בהן. (ב) מיקוד של הpCS2-tdTomato-מוקד של הגברת. בעיקר תאים ependymal מתויג, ומעטים ependymoglial תאים לבטא tdTomato-הגברת פלמיד. יש לציין את ההבדל הברור במבנה התאים הependymal (חיצים כחולים). קנה מידה ברים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4:3D צפיות לרוחב של התאים מependymoglial אלקטרופורבטים ושאינם אלקטרופורביים. (A) תלת מימדי ייצוג לרוחב התאים ependymoglial, חיובי עבור שניהם Tg (gfap: gfp) ו PCS2-tdtomato-הגברת (החץ הצהוב). (ב) הצגה לרוחב תלת ממדית של אלקטרופורציה לא מוצלחת. יש לציין את מיקומו של תאים חיוביים מסוג pCS2-tdTomato מעל לשכבה ependymoglia של Tg (gfap: GFP). סביר להניח שתאי השכבה ependymal בעלי electroporated (חץ כחול). קנה מידה של פסים = 30 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הסרט 3D של הזברה טלנצאלון ותאים ependymoglial electroporated. וידאו מראה אחד האונה הראשונה של דג הזינצאלון ב 3D. תאים Ependymoglial הם שכונתיות עם שני פלמידים: tdTomato-הגברת (חלבון פלורסנט אדום מעוגן קרום התא) ו H2B-YFP פלמיד (גרעיני תוויות). Ependymoglia מתויג באופן אינדיבידואלי עם תהליכים רדיאליים שניתן לצפות מהם מצידה. עיגולים צהובים להאיר ependymoglial cell עם דמות mitotic דמיינו על ידי H2B-YFP מתויג כרומטין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול אלקטרופורציה זו הוא שיטה אמינה בvivo לתיוג תאים בודדים ependymoglial. הפרוטוקול עשוי להזדקק לעיבוד נוסף כדי לתייג סוגי תאים אחרים כגון נוירונים או oligodendrocytes הפוך. כדי להשיג תוויות מוצלחות, ניתן להשתמש בפלמידים המכילים היזמים שונים. עוף בטא אקטין מיזם, eF1alpha, cmv ו מקדם אוביקוויב השתמשו בעבר כדי לכונן את הביטוי של טרנסגנים שונים ependymoglia ואת צאצהם23. עם זאת, קינטיקה שונה של ביטוי טרנזגנטי נצפתה אשר יש לקחת לתוך החשבון. לדוגמה, ביטוי טרנזגנטי מונחה של מקדם המקדם של CMV הוא מהיר מאוד (הביטוי יכול להיראות לאחר 24 שעות), בעוד eF1alpha לוקח יותר זמן. מלבד תיוג, פרוטוקול אלקטרופורציה יכול לשמש פלטפורמה מהירה וישירה של העריכה הגנטית עם שימוש של recombinase היצורים או CRISPR Cas9 טכניקות22. יתרה מזאת, השימוש בקסטה מסוג25-המכיל פלמידים והאלקטרופורציה שלהם בקווים ספציפיים לסוגי תאים עשויים לשמש כשלוחה ברורה של שיטה המאפשרת תוויות או עריכת גנים בependymoglial צאצאים שנוצרו לאחר אלקטרופורציה.
פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים. ראשית, במהלך הזריקה, הניסוי צריך להיות זהיר כי הסכום המוזרק בפלסטלינה שווה לכל דג בודד, כך מספר התאים המוצגים נשאר זהובה דומה. זה יכול להיות מושגת על ידי שליטה על הגודל של הפתח נימי זכוכית, כלומר חתך של כל עצה צריך להיות קבוע בין נימים או כיול שונים יש לבצע עבור כל נימי בודד. בנוסף, משך ההזרקה, מוסדר על ידי דוושה ברגל, צריך להיות זהה עבור כל הזרקה בודדת. שנית, המיקום הנכון של חור בגולגולת עשה עם המיקרו-סכין הוא חיוני עבור הפיזור הנכון של נוזל פלבאמצע לאורך הטלנצאלון. זה חשוב באותה מידה לחדור את השכבה ependymal cell עם טיפ נימי, כאמור בפרוטוקול. כמו-כן, חיוני גם שהחור שנוצר אינו גדול מדי כדי למנוע את התערובת הפלסתית והנוזל השדרתי מהדליפה מתוך הטלנצאלון. שלב קריטי נוסף הוא החוזק של זרם החשמל המוחל. חשוב לוודא שהתקן האלקטרופורציה פועל בדיוק ככל האפשר, כך שהכוח של הזרם המוחל אינו מסטות הרבה מהמתח המופיע על המסך, שאינו תמיד מדויק. אם ערכים אלה אינם עקביים, יש צורך לכוונן את כוחה של הזרם בהתקן האלקטרופורציה, מכיוון שזרם מנוהל גבוה יותר מאשר הגירסה המומלצת 54-57 V עלולה לפגוע בהישרדות הדגים.
בהשוואה לשיטות אחרות עבור משלוח פלמיד והתוויות התא בדרך כלל בשימוש בתחום, האלקטרופורציה יש יתרונות ברורים. למרות הצעדים הקריטיים שהוזכרו לעיל, זה קורה לעתים רחוקות מאוד כי לא ניתן לצפות בתאים אלקטרופורבטים או כי התאים הependymal בטעות electroporated. באופן כללי, שיעור ההצלחה של פרוטוקול אלקטרופורציה זה הוא 90%-95% ואנו מתבוננים כמעט בתאי TUNEL + לאחר אלקטרופורציה. בניגוד לליפפיקציה למשל, במהלך אלקטרופורציה, ליפוזומים לlipofectamine (g., למשל) לא נעשה שימוש ולכן רעילות המקושרת עם השימוש בה נמנעת לחלוטין26. בעבר דווח כי הליפסציה ואלקטרופוראציה הם בעלי שווי יעילות (20-50 תאים לכל טלנצאלון)27. עם זאת, פרוטוקול ממוטב זה מניב בדרך כלל 100-200 תאים לכל טלנצאלון. בהשוואה לווקטורים ויראליים, אבטחה טיחות אינה בעיה עם אלקטרופורציה.
בנוסף, משמש בדרך כלל aavs או וירוסים מצליחים לייצר ביטוי לזיהוי של טרנסגנים במוח דג זברה17,28. בסופו של דבר, למרות מערכת היצור-לקס משמש כיום בדרך כלל ב-zebrafish, אלקטרופורציה הפלסטיות היא מהירה יותר מאחר שהוא אינו דורש זמני המתנה ארוכים הדרושים לגידול דגים גדל ומאפשר התוויות תאים בודדים ומעקב. עם זאת, טכניקה כזו דורשת מדענים מיומנים ביותר להשיג אלקטרופורציה מוצלחת ושיעורי הישרדות גבוהים של בעלי חיים ניסיוניים (אנחנו בדרך כלל חווים שיעורי הישרדות של ~ 70%-80%). שיעור זה נוטה גם להשתנות בהתאם לניסויים. לימוד ההליך דורש תרגול ובדרך כלל לוקח שלושה מבחנים. עם זאת, פעולה זו תלויה במיומנות הידנית של האינדיבידואל ועשויה להימשך זמן רב יותר במקרים מסוימים.
פרוטוקול האלקטרופורציה המוצגת הוא שיטה מהירה ויעילה ביותר לאלקטרופורטינג של מספר רב של תאים ependymoglial באמצעי הזהירות הדרושים להשגת תוצאות אופטימליות. אלקטרופורציה של המבוגרים בלבד telependymoglial alon הוא חיוני להמחיש תאים בודדים וללמוד את תפקידם בתהליכי נוירוגנזה והתחדשות. לאחרונה, הצלחה הושגה הפרעה בו זמנית של גנים מרובים של המבוגר הזיבפיש telencephalon דרך עריכת גנים באמצעות אלקטרופורציה ו-Cas9 שיטות22. זה פותח אפשרויות רבות ויישומים עתידיים של אלקטרופורציה עבור מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
תודות מיוחדות לג Copti לעריכת כתב היד. אנו גם מממנים בהכרת תודה ל JN מקרן המחקר הגרמני (DFG) על ידי SFB 870 ו SPP ניתוח אינטגרטיבי של Olfaction "ו SPP 1738" תפקידים מתעוררים RNAs ללא קידוד בפיתוח מערכת העצבים, פלסטיות & מחלה ", SPP1757" Glial טרוגניות ", ואסטרטגיית מצוינות במסגרת אשכול מינכן לנוירולוגיה מערכות (EXC 2145 סינרגיה-ID 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
