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Developmental Biology

Méthode d'électroporation pour la livraison in vivo de l'ADN de Plasmid dans le Telencephalon adulte de poisson zèbre

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/60066
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, 2Graduate School of Systemic Neurosciences, Ludwig Maximilian University, 3Department of Cell Biology and Anatomy, Biomedical Center, Ludwig Maximilian University, 4Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

Summary

Présenté ici est une méthode d'électroporation pour la livraison d'ADN plasmide et l'étiquetage des cellules épendymogliales dans le téncephalon de poisson zèbre adulte. Ce protocole est une méthode rapide et efficace pour visualiser et tracer les cellules ependymoglial individuelles et ouvre de nouvelles possibilités d'appliquer l'électroporation à un large éventail de manipulations génétiques.

Abstract

L'électroporation est une méthode de transfection dans laquelle un champ électrique est appliqué aux cellules pour créer des pores temporaires dans une membrane cellulaire et augmenter sa perméabilité, permettant ainsi l'introduction de différentes molécules dans la cellule. Dans cet article, l'électroporation est utilisée pour introduire des plasmides aux cellules éparymogliales, qui tapissent la zone ventriculaire du ténaudif zèbre adulte. Une fraction de ces cellules montre des propriétés de cellules souches et génère de nouveaux neurones dans le cerveau du poisson zèbre; par conséquent, l'étude de leur comportement est essentielle pour déterminer leurs rôles dans la neurogenèse et la régénération. L'introduction de plasmides par électroporation permet l'étiquetage à long terme et le suivi d'une seule cellule éparymoglial. En outre, les plasmides tels que Cre recombinase ou Cas9 peuvent être livrés à des cellules éparymogliales uniques, ce qui permet la recombinaison ou l'édition de gènes et offre une occasion unique d'évaluer la fonction génétique autonome de la cellule dans un système contrôlé, naturel l'environnement. Enfin, ce protocole détaillé d'électroporation étape par étape est utilisé pour obtenir l'introduction réussie des plasmides dans un grand nombre de cellules éparymogliales simples.

Introduction

Les poissons zèbres sont d'excellents modèles animaux pour examiner la régénération du cerveau après une blessure au couteau. Par rapport aux mammifères, sur l'échelle évolutive, les espèces moins évoluées telles que le poisson zèbre montrent généralement des taux plus élevés de neurogenèse constitutive et de zones plus larges de résidence de cellules souches neurales adultes, conduisant à la génération constante de nouveaux neurones tout au long la plupart des zones du cerveau dans la vie adulte. Cette caractéristique semble être en corrélation avec la capacité régénératrice significativement plus élevée du poisson zèbre par rapport aux mammifères1, car le poisson zèbre a un potentiel remarquable pour générer efficacement de nouveaux neurones dans la plupart des modèles de lésions cérébrales étudiés2, 3,4,5,6,7,8. Ici, le ténèbre telencephalon est étudié, car il s'agit d'une zone du cerveau avec une neurogenèse proéminente à l'âge adulte. Ces zones de neurogenèse adulte sont homologues aux zones neurogènes dans le cerveau des mammifères adultes9,10,11.

Les zones neurogènes abondantes dans le téencéphale de poisson-zèbre sont présentes en raison de l'existence de gliales radiales comme les cellules ou les cellules d'éparymoglia. Les cellules ependymoglial agissent en tant que cellules souches neurales adultes résidentes et sont responsables de la génération de nouveaux neurones dans le cerveau intact et régénérant3,5. Les expériences de traçage de lignée ont montré que les éparggies ventriculaires réagissent aux blessures, puis prolifèrent et génèrent de nouveaux neuroblastes qui migrent vers le site de lésion5. En raison de la nature everted du téleencéphalon de poisson-zèbre, les cellules ependymoglial tapissent la surface ventriculaire et construisent la paroi ventriculaire ventrale. La paroi ventriculaire dorsal est formée par une couche cellulaire ependymale dorsal (Figure 1A). Fait important, le poisson zèbre ependymoglia incarne les caractéristiques des cellules radiales et des cellules éparymatiques des mammifères. Les longs processus radiaux sont une caractéristique typique des cellules de la gliale radiale, tandis que les extensions cellulaires et les jonctions serrées (ainsi que leurs positions ventriculaires) sont des caractéristiques typiques des cellules éparymales12,13,14. Par conséquent, ces cellules sont appelées cellules éparymoglial.

Pour suivre le comportement in vivo des cellules ependymoglial simples pendant la régénération, elles doivent être étiquetées de manière fiable. Diverses méthodes d'étiquetage cellulaire in vivo pour la microscopie fluorescente ont déjà été décrites, telles que les reporters endogènes ou les colorants lipophiles15. Ces méthodes, contrairement à l'électroporation, peuvent nécessiter de plus longues périodes de temps et souvent n'offrent pas la possibilité d'étiquetage à cellule unique ou de traçage permanent à long terme. L'électroporation, cependant (en plus de l'étiquetage à cellule unique), offre la possibilité d'introduire un nouvel ADN dans la cellule hôte. En outre, par rapport à d'autres méthodes de transfert d'ADN dans les cellules, l'électroporation a été démontrée comme l'une des méthodes les plus efficaces16,17,18,19.

Présenté ici est un protocole d'électroporation qui a été affiné dans le but d'étiqueter les cellules ependymoglial unique dans le ténencéphale de poisson zèbre adulte. Ce protocole permet l'étiquetage des cellules éparymoglial simples afin de les suivre sur une période à long terme20 ou de manipuler des voies spécifiques d'une manière cellulaire-autonome21,22.

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Protocol

Tous les animaux utilisés dans ce protocole ont été gardés dans des conditions d'élevage standard, et des expériences ont été réalisées conformément aux directives et règlements de manipulation de l'UE et du gouvernement de Haute-Bavière (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. Préparation du mélange de Plasmide pour l'électroporation

  1. Diluer le plasmide de l'intérêt pour l'eau stérile et ajouter une solution de bouillon de taches vertes rapides [1 mg/mL]. Assurez-vous que la concentration finale du plasmide est de 1 g/L. Ajouter la tache à une concentration d'au plus 3 %, car son seul but est de colorer la solution et de visualiser l'injection ventriculaire.
  2. Une fois préparé, mélanger la solution plasmide en faisant monter et descendre plusieurs fois ou en tapant sur les doigts. Conserver à température ambiante (RT) jusqu'à utilisation.
    REMARQUE: Pour la co-électroporation de deux plasmides dans la même cellule, assurez-vous que la concentration de chaque plasmide individuel utilisé dans le mélange est d'au moins 0,8 ng/L avec un rapport molaire de 1:1 pour obtenir 80% -90% d'efficacité de co-électroporation.

2. Préparations pour la procédure d'injection et d'électroporation

  1. Préparer les capillaires en verre (diamètre extérieur 1 mm, diamètre intérieur 0,58 mm) nécessaires à l'injection dans l'appareil de traction de l'aiguille.
  2. Afin d'injecter la bonne quantité de plasmide (voir ci-dessus), tirez le capillaire à une température de 68,5 oC avec deux poids légers et deux poids lourds (voir tableau des matériaux pour les spécifications du tireur).
    REMARQUE: Dans le cas où un puller différent est utilisé, calibrer le capillaire pour fournir le volume approprié de mélange d'électroporation.
  3. Régler manuellement le dispositif d'injection à une pression d'injection de 200 hPa (en tournant le bouton Pi) et une pression constante de 0 hPa. Régler manuellement le temps d'injection en mode manuel et contrôler la pression avec la pédale.
  4. Régler le dispositif d'électroporation en « mode LV » avec cinq impulsions à 54-57 V (25 ms chacun avec 1 s intervalles). Connectez les électrodes à l'appareil.
  5. Préparer un aquarium avec de l'eau de poisson propre, où le poisson sera réveillé de l'anesthésie après la procédure d'électroporation. Aérer l'eau en gardant la pierre d'air attachée à la pompe à air pendant toute la période de récupération jusqu'à ce que le poisson soit complètement réveillé.
  6. Prendre une éponge de cuisine régulière et faire une coupe longitudinale dans l'éponge pour retenir le poisson pendant la procédure d'injection et d'électroporation (voir la publication précédente3).
    REMARQUE: L'éponge de cuisine doit être lavée ou échangée régulièrement afin d'éliminer les produits chimiques toxiques potentiels.
  7. Placez une petite quantité de gel à ultrasons multi-usages hautement conducteur à côté de la configuration d'injection et d'électroporation.
    REMARQUE: Cela assurera une conductivité électrique adéquate et, par conséquent, une distribution des cellules électroporated dans l'ensemble du télencéphale.

3. Anesthésie de poisson zèbre

  1. Avant l'anesthésie, préparez une solution de stock d'anesthésie avec 0,2% MS222 dans l'eau distillée et ajustez le pH à 7 avec le tampon Tris-HCl. Diluer ce stock 1:10 (c.-à-d., à 0,02% MS222) en utilisant l'eau de poisson.
  2. Anesthésiez les poissons en les gardant dans cette solution de travail jusqu'à ce que le mouvement du corps et des branchies s'estompe (généralement pendant quelques minutes).

4. Injection de solution de Plasmid

  1. Remplissez le capillaire en verre préparé avec une solution de plasmide de 10 ll à l'aide de pointes de microchargeur. Évitez la formation de bulles d'air à l'intérieur du capillaire.
  2. Appuyez sur Menu/Changer Capillary sur le dispositif d'injection. Insérez et fixez l'aiguille dans le porte-aiguille.
  3. Sous un stéréomicroscope avec un grossissement de 3,2x ou 4x, couper seulement la pointe du capillaire à l'aide de forceps fins. Passez le dispositif d'injection du mode Change Capillary en mode Inject, puis appliquez la pression avec une pédale de pied pour s'assurer que la solution de plasmide s'exécute facilement hors de l'aiguille et sans obstacle.
  4. Transférer le poisson du réservoir d'élevage au récipient (boîte en plastique) avec une solution anesthésique. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le mouvement des branchies s'estompe.
  5. Placer le poisson dans l'éponge pré-humide avec le côté dorsal face vers le haut. Effectuez toutes les étapes d'injection suivantes sous le stéréomicroscope pour assurer l'exactitude de la procédure.
  6. À l'aide d'un micro-couteau disséquant en acier inoxydable avec un tranchant de 40 mm et une épaisseur de 0,5 mm, créez un petit trou dans le crâne du poisson du côté postérieur du ténencéphale (figure 1B), juste à côté de la bordure avec tectum optique.
    REMARQUE: Cette étape doit être effectuée avec soin puisque le trou doit être très petit et superficiel, pénétrant uniquement le crâne, pour éviter des dommages au cerveau.
  7. Inclinez le poisson au besoin et orientez la pointe du capillaire de verre vers le crâne dans le bon angle pour faciliter la pénétration de la pointe capillaire à travers le trou.
  8. Insérez soigneusement la pointe du capillaire à travers le trou du crâne jusqu'à ce qu'il atteigne le ventricule telencéphalique (voir figure 1B). Cela nécessitera une pénétration à travers la couche cellulaire ependymale dorsale. Soyez particulièrement prudent de ne pas insérer le capillaire trop profondément pour éviter le contact avec le tissu cérébral. Gardez le capillaire précisément entre les hémisphères, en restant à l'intérieur du ventricule juste après avoir percé la couche dorsymale dorsal.
    REMARQUE: C'est une étape très délicate. La précision de cette procédure est améliorée en utilisant des lignes mutantes de pigmentation telles que brassy24, permettant une meilleure visualisation de la position capillaire en verre pendant l'injection.
  9. Avec la pointe capillaire à l'intérieur du ventricule, injecter la solution plasmide en appliquant une pression avec la pédale du pied pendant environ 10 s, ce qui correspond à environ 1 l de solution plasmide.
    REMARQUE: Si vous modifiez le pulleur d'aiguille, les capillaires ou l'injecteur, le système doit être calibré afin de toujours fournir 1 l de solution plasmide. L'étalonnage peut être effectué en mesurant le diamètre de la gouttelette de plasmide expulsée dans une huile minérale (p. ex. huile de paraffine) et en calculant par la suite le volume de la gouttelette. Après 10 s d'injection, il devrait y avoir 1 l de liquide plasmide expulsé dans l'huile minérale.
  10. Confirmer le succès de l'étape précédente en observant la propagation du liquide dans tout le ventricule.

5. Électroporation

  1. Retirer le poisson de la mise en place d'injection tout en le tenant dans l'éponge.
  2. Immerger le côté intérieur de la pointe des électrodes dans le gel à ultrasons.
  3. Couvrir le poisson telencephalon avec une petite quantité de gel à ultrasons.
  4. Placez la tête du poisson entre les électrodes, en plaçant l'électrode positive du côté ventral de la tête du poisson et l'électrode négative du côté dorsal (figure 1C), tout en tenant le corps du poisson dans l'éponge. Cela définit la direction du flux du courant nécessaire à l'électroporate épendymoglia positionné à la zone sous-ventriculaire.
  5. Appuyez doucement et précisément contre le telencephalon (Figure 1C). Administrer le courant avec la pédale du pied. Maintenez les électrodes en place jusqu'à ce que les cinq impulsions soient terminées.

6. Récupération des poissons

  1. Laissez le poisson récupérer dans le réservoir préalablement préparé et continuellement aéré jusqu'à ce qu'il se réveille. Gel de lidocaïne pourrait être appliqué sur le crâne afin de soulager toute douleur éventuellement développée.

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Representative Results

La méthode d'électroporation décrite permet la livraison de l'ADN plasmide dans les cellules éparymogliales, qui sont situées superficiellement dans le téencéphale de poisson zèbre et juste sous la couche de cellules ependymales dorsales (Figure 1A).

Si le résultat de l'électroporation est positif, les cellules épendymoglial simples étiquetées (cellules rouges dans la figure 2A,B)peuvent être observées parmi d'autres cellules épendymogliales (blanches dans la figure 2A,B). Selon l'efficacité du processus d'électroporation, un nombre plus élevé (figure 2A) ou inférieur (figure 2B) de cellules épendymogliales peut être étiqueté. Néanmoins, ce protocole donne un nombre plus élevé de cellules étiquetées que précédemment publié20, ce qui est évident dans la figure 3A et la vidéo 1. Il convient de mentionner que la plus forte densité de cellules étiquetées tend à émerger principalement du côté intérieur et ventriculaire des deux hémisphères (Figure 3A), en raison de la façon dont le liquide plasmide injecté se distribue entre les hémisphères. Dans la vidéo 1, un hémisphère du ténèco zèbre est présenté en 3D, et les cellules éparymogliales avec des processus radiaux peuvent être vus de côté. Les cellules sont co-électroporated et étiquetées avec deux plasmides, tdTomato-mem (protéine fluorescente rouge ancrée à la membrane cellulaire) et Plasmide H2B-YFP (noyaux d'étiquetage). La division cellulaire de deux noyaux entourés de cercles jaunes doit être notée.

L'électroporation infructueuse a comme conséquence le nombre très bas ou aucune cellules épendymoglial étiquetées. Ce résultat peut être généralement expliqué par une injection inexacte, dans laquelle la pointe du capillaire ne pénètre pas la couche cellulaire ependymale dorsal. Dans ce cas, la solution de plasmide se propage au-dessus de la couche cellulaire épendymale dorsale au lieu de remplir le ventricule telencephalic. Cela conduit à des cellules épendymales uniquement étiquetées (Figure 3B). Les cellules ependymales dorsales (flèches bleues de la figure 3B)diffèrent morphologiquement des cellules éparymogliales (flèche jaune dans la figure 3A). Leur soma est plus grand et cuboïde, et ils ne possèdent pas de processus radiaux et allongés. Ceci est évident en comparant une vue latérale de la couche cellulaire ependymoglial (Figure 4A,B). Les cellules étiquetées TdTomato-mem sont très probablement des cellules épendymales, qui sont situées au-dessus de la couche d'épendymoglia (Figure 4B). En revanche, dans la figure 4A, un plasmide exprimant tdTomato-mem est introduit aux cellules éparymoglial individuelles. Ainsi, ils expriment tdTomato-mem en plus de leur étiquetage initial (dans ce cas, transgénique gfap:GFP ligne de poissons, vu ici en blanc).

Ce protocole permet l'étiquetage et la suite subséquente du comportement des cellules éparymogliales dans le téencéphale de poisson zèbre après une blessure sur une période de court-21 ou à long terme3 de temps. Ceci est accompli par l'imagerie en direct, in vivo et aide à aborder la question de leurs rôles dans la régénération et la neurogenèse.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la section coronale du téleencéphalon du poisson zèbre. (A) Schéma d'une section coronale de ténègue de télencéphale, soulignant la position des cellules éparymogliales, qui tapissent la surface ventriculaire et construisent la paroi ventriculaire ventrale. La couche épendymale dorsale fait le pont entre les deux hémisphères et recouvre le ventricule (V), situé entre deux couches cellulaires : l'épendymoglial et l'épendymal. La flèche noire et la représentation de l'œil indiquent que la vue est indiquée dans les figures 2 et 3. (B) Sur la gauche, une photographie de la tête de poisson zèbre prise d'en haut, soulignant la position du téencéphale avec une ligne pointillée blanche. Un capillaire en verre est représenté en rouge, avec le site cible pour l'insertion capillaire. Sur la photo de droite est un schéma de cerveau de poisson zèbre montrant la position de l'injection de plasmide en rouge. Il convient de noter que le capillaire en verre ne touche pas le téencéphale et que le plasmide est injecté juste au-dessus du ténadyaucis dans le ventricule. T - telencephalon, OT et tectum optique. (C) Représenté sur la gauche est une photographie de la tête de poisson zèbre (vue latérale), et sur la droite est une représentation de la tête (vue latérale) montrant la position des électrodes afin de cibler le telencephalon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Micrographies montrant des résultats efficaces d'électroporation. Représentation tridimensionnelle d'un (A) plus grand ou (B) plus petit nombre de cellules éendymoglial électroporated dans le telencephalon adulte de poisson zèbre, comme vu d'en haut. L'électroporation a été faite dans Tg (gfap:GFP) ligne de poissons exprimant la protéine fluorescente de GFP (représentée en blanc) dans toutes les cellules d'ependymoglial. Les cellules électroporated individuelles sont étiquetées avec plasmide plasmique pCS2-tdTomato-mem3. Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Micrographies confocales illustrant la différence entre l'électroporation réussie et l'électroporation infructueuse. (A) Image confocale tridimensionnelle du téleencéphale de poisson zèbre BAB-défriché (REF) avec un grand nombre de cellules éparymogliales électroporated de pCS-tdTomato-mem. La morphologie des cellules épendymoglial avec de longs processus allongés (flèches jaunes) doit être notée. Les deux hémisphères telencephalic, accentués avec les lignes pointillées jaunes, peuvent être observés. (B) Image confocale de l'électroporation infructueuse du plasmide pCS2-tdTomato-mem. La plupart des cellules ependymal dorsales sont étiquetées, et peu de cellules ependymoglial expriment le plasmide tdTomato-mem. La différence claire dans la morphologie des cellules éparymales (flèches bleues) doit être notée. Barres d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Vues latérales 3D des cellules éparymoglial électroporated et non électroporated. (A) Représentation latérale tridimensionnelle électroporated cellules éparmoglial, positif à la fois pour Tg (gfap:GFP) et pCS2-tdTomato-mem (flèche jaune). (B) Représentation latérale 3D de l'électroporation infructueuse. L'emplacement des cellules positives pCS2-tdTomato-mem au-dessus de la couche d'épargymoglia de Tg(gfap :GFP) devrait être noté. Les cellules de couche ependymal dorsal les plus probables ont été électroporated (flèche bleue). Barres d'échelle de 30 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Video 1
Vidéo 1: film 3D de zèbre sténèbre telencephalon et électroporated cellules ependymoglial. La vidéo montre un hémisphère du ténèco zèbre en 3D. Les cellules ependymoglial sont co-électroporated avec deux plasmides : tdTomato-mem (protéine fluorescente rouge ancrée à la membrane cellulaire) et plasmide H2B-YFP (noyaux d'étiquetage). Individuellement étiqueté ependymoglia avec des processus radiaux qui peuvent être observés de côté. Les cercles jaunes mettent en évidence la cellule d'éparymoglial avec la figure mitotique visualisée par la chromatine étiquetée H2B-YFP. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Ce protocole d'électroporation est une méthode in vivo fiable d'étiquetage des cellules ependymoglial individuelles. Le protocole peut avoir besoin d'une autre adaptation pour étiqueter d'autres types de cellules comme les neurones ou les oligodendrocytes. Pour réussir l'étiquetage, des plasmides contenant différents promoteurs peuvent être utilisés. Chicken-bêta actin promoteur, eF1alpha, CMV et ubiquitin promoteur ont déjà été utilisés pour conduire l'expression de différents transgènes dans ependymoglia et leur progéniture23. Cependant, différentes cinétiques de l'expression transgène ont été observées qui devraient être prises en compte. Par exemple, l'expression transgène pilotée par le promoteur CMV est très rapide (l'expression peut être vue après 24 h), tandis que eF1alpha prend plus de temps. Outre l'étiquetage, le protocole d'électroporation peut être utilisé comme une plate-forme rapide et simple de l'édition de gènes avec l'utilisation de Cre recombinase ou CRISPR Cas9 techniques22. En outre, l'utilisation de plasmides contenant25flip-cassettes et leur électroporation dans des lignes Cre spécifiques au type cellulaire peut servir d'extension claire d'une méthode permettant l'étiquetage ou l'édition de gènes dans la progéniture éparmoglial générée après Électroporation.

Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Tout d'abord, au cours de l'étape d'injection, l'expérimental doit faire attention que la quantité de plasmide injectée est égale pour chaque poisson individuel, de sorte que le nombre de cellules étiquetées reste comparablement similaire. Ceci peut être réalisé en contrôlant la taille de l'ouverture capillaire en verre, signifiant que la coupe de chaque extrémité devrait être constante parmi différents capillaires ou l'étalonnage devrait être exécuté pour chaque capillaire individuel. En outre, la durée de l'injection, réglée par une pédale de pied, devrait être la même pour chaque injection individuelle. Deuxièmement, la position appropriée d'un trou dans le crâne fait avec le micro-couteau est cruciale pour la dispersion appropriée du liquide plasmide tout au long du ténicéphale. Il est également important de pénétrer la couche cellulaire ependymal dorsale avec la pointe capillaire, comme indiqué dans le protocole. En outre, il est également essentiel que le trou créé n'est pas trop grand pour empêcher le mélange de plasmide et le liquide céphalo-rachidien de s'échapper du ténencéphale. Une autre étape critique est la force du courant électrique appliqué. Il est important de s'assurer que le dispositif d'électroporation fonctionne aussi précisément que possible, de sorte que la force du courant appliqué ne s'écarte pas beaucoup de la tension apparaissant sur l'écran, ce qui n'est pas toujours exact. Si ces valeurs ne sont pas cohérentes, il est nécessaire d'ajuster la résistance du courant sur le dispositif d'électroporation, car un courant administré supérieur au 54-57 V recommandé peut compromettre la survie des poissons.

Par rapport aux autres méthodes de livraison de plasmides et d'étiquetage cellulaire couramment utilisés sur le terrain, l'électroporation présente des avantages évidents. Malgré les étapes critiques mentionnées ci-dessus, il arrive très rarement qu'aucune cellule électroporated ne peut être observée ou que les cellules ependymales dorsales soient électroporated par erreur. En général, le taux de réussite de ce protocole d'électroporation est de 90%-95% et nous observons presque aucune cellule TUNELMD après l'électroporation. Contrairement à la lipofection par exemple, lors de l'électroporation, les liposomes cationiques (par exemple, lipofectamine) ne sont pas utilisés et donc la toxicité liée à son utilisation est complètement évitée26. Il a été précédemment rapporté que la lipoféction et l'électroporation ont des taux d'efficacité égaux (20-50 cellules par telencephalon)27. Cependant, ce protocole optimisé donne généralement 100-200 cellules par telencephalon. Par rapport aux vecteurs viraux, la biosécurité n'est pas un problème avec l'électroporation.

En outre, les AAV ou lentivirus couramment utilisés ne produisent pas l'expression détectable des transgènes dans le cerveau du poisson zèbre17,28. Enfin, bien que le système Cre-lox soit aujourd'hui couramment utilisé chez le poisson zèbre, l'électroporation plasmide est plus rapide puisqu'il ne nécessite pas de longs temps d'attente nécessaires à la reproduction et à la croissance des poissons et permet l'étiquetage et le traçage individuels des cellules. Cependant, une telle technique exige des scientifiques hautement qualifiés pour atteindre l'électroporation réussie et les taux élevés de survie des animaux expérimentaux (nous éprouvons typiquement des taux de survie de 70%-80%). Ce taux a également tendance à fluctuer en fonction de l'expérimentateur. L'apprentissage de la procédure nécessite de la pratique et prend généralement trois essais. Cependant, cela dépend de la dextérité manuelle de l'individu et peut prendre plus de temps dans certains cas.

Le protocole d'électroporation présenté est une méthode rapide et très efficace pour électroporating un grand nombre de cellules d'éparymoglial avec les précautions nécessaires pour obtenir des résultats optimaux. L'électroporation du ténèdion de poisson zèbre adulte est cruciale pour visualiser les cellules éparymogliales individuelles et étudier leurs rôles dans la neurogenèse et les processus de régénération. Récemment, le succès a été atteint dans la perturbation simultanée de plusieurs gènes du telencephalon adulte de poisson zèbre par l'édition de gène par l'intermédiaire de l'électroporation et des techniques de StagR-Cas922. Cela ouvre de nombreuses possibilités et applications futures de l'électroporation pour un large éventail de manipulations génétiques.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Un merci spécial à James Copti pour l'édition du manuscrit. Nous remercions également JN de la Fondation allemande de recherche (DFG) par le SFB 870 et SPP "Integrative Analysis of Olfaction" et SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plasticity and disease", SPP1757 " L'hétérogénéité gliale » et la stratégie d'excellence dans le cadre du Cluster for Systems Neurology de Munich (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Fast Green Sigma-Aldrich F7258-25G For coloring plasmid solution
MS222 Sigma-Aldrich A5040-25G MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel SignaGel, Parker laboratories INC. 15-60 Electrode Gel
Equipment
Air pump TetraTec APS 50, 10l-60l Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus 45-0486 1 mm diameter
Electroporation device BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus 45-0662
Injection device FemtoJet 4i, Eppendorf 5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary Warner Instruments 64-0766 Model No: G100-4
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micro-knife Fine Science Tools 10056-12
Joystick micromanipulator Narishige Japan MN - 151
Needle holder FemtoJet 4i, Eppendorf 5252000013 Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device Narishige Japan Model No: PC-10 The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes Greiner Bio-One International 633161

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Biologie du développement Numéro 151 électroporation éparoymoglia étiquetage cellulaire in vivo livraison de plasmides télencéphale de poisson zèbre édition de gènes
Méthode d'électroporation pour la livraison in vivo de l'ADN de Plasmid dans le Telencephalon adulte de poisson zèbre
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Durovic, T., Ninkovic, J. Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon. J. Vis. Exp. (151), e60066, doi:10.3791/60066 (2019).

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